閆偉偉，黃 昂，戴廣海

MBD蛋白家族研究進展

閆偉偉，黃 昂，戴廣海

甲基化CpG結(jié)合域（methyl-CpG-binding domain, MBD）蛋白家族在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用。MBD蛋白功能的實現(xiàn)需要蛋白的MBD結(jié)構(gòu)域和基因組的甲基化CpG位點，它們通過異染色質(zhì)的形成，組蛋白去乙酰化以及DNA甲基化修飾，進而產(chǎn)生基因表達抑制作用。但是，一些MBD蛋白也可以結(jié)合非甲基化DNA，并通過蛋白其他的結(jié)構(gòu)域或者與核小體重塑及去乙?；福╪ucleosome remodeling deacetylase, NuRD）/Mi-2復合物的相互作用來發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用和多向分化潛能。MBD蛋白發(fā)生基因突變或異常表達會引起多種疾病，包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥和慢性乙型肝炎。本文總結(jié)了MBD蛋白家族核心成員的主要功能及與相關(guān)疾病的關(guān)系。

甲基結(jié)合域蛋白質(zhì)；DNA甲基化；腫瘤；慢性乙型肝炎

甲基化CpG結(jié)合域（methyl-CpG-binding domain, MBD）蛋白家族是決定表觀基因組轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的關(guān)鍵成員。作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，MBD蛋白在DNA甲基化、組蛋白修飾與染色質(zhì)組織這一連貫的轉(zhuǎn)錄程序中發(fā)揮重要作用。目前，MBD蛋白家族包括11個已知的成員，它們都包含一個MBD域，該結(jié)構(gòu)域由70～85個氨基酸組成，具有結(jié)合單一對稱的甲基化CpG二核苷酸的能力。除了MBD域，MBD家族成員還包含幾個不同的結(jié)構(gòu)域，反映它們各自的角色。大多數(shù)家庭成員包含一個轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域（transcriptional repression domain,TRD），介導與蛋白伴侶的相互作用。MBD蛋白家族成員因其各自包含其他不同的結(jié)構(gòu)域，發(fā)揮著不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，其蛋白的突變或者表達異常會導致一些疾病的發(fā)生[1]。

1 MBD蛋白家族核心成員

1.1 MeCP2 MeCP2，是第一個被發(fā)現(xiàn)的含MBD域的蛋白，除了70個氨基酸組成的MBD域，它還包含1個TRD域。MeCP2具有組蛋白去乙?；饔貌⒛芙Y(jié)合組蛋白甲基化伴侶，在高階/遠程染色質(zhì)重塑與異染色質(zhì)的形成和沉默染色質(zhì)組織中發(fā)揮必要的作用[2]。此外，MeCP2可調(diào)節(jié)并翻譯基因的甲基化，使其成為可選擇的翻譯剪接，這些功能對于神經(jīng)發(fā)育至關(guān)重要。MeCP2基因突變會導致雷特綜合征（Rett syndrome），這是一種嚴重的特異影響女性神經(jīng)發(fā)育的疾病。雷特綜合征患者的MBD域或TRD域存在典型的點突變，因此會影響MeCP2結(jié)合伴侶或DNA的能力。MeCP2在大腦中的表達伴隨神經(jīng)元成熟，并在成熟神經(jīng)元中高表達，這說明MeCP2的調(diào)節(jié)異常對于神經(jīng)系統(tǒng)疾病至關(guān)重要[3]。

1.2 MBD1 MBD1是MBD家族中分子量最大的成員，MBD1包含1個N-末端的MBD域，1個C-末端的TRD域，以及2～3個內(nèi)部的CxxC鋅指結(jié)構(gòu)域（CxxC域）。MBD1亞型的前2個CxxC域優(yōu)先結(jié)合甲基化DNA，而存在的第3個CxxC域使得MBD1具有結(jié)合未甲基化DNA的能力。MBD域和CxxC域決定著MBD1結(jié)合的特異性以及MBD1與甲基化和非甲基化DNA結(jié)合的靶向性。MBD1主要作用是通過指導組蛋白甲基化和維持異染色質(zhì)來抑制基因的轉(zhuǎn)錄。對MBD1基因敲除小鼠的研究表明，MBD1不具有胚胎致死性，但似乎影響神經(jīng)形成和神經(jīng)干細胞分化，這符合MBD1嚴格的體表達模式。然而，在大腦中MBD1沒有特異性富集[4]。

1.3 MBD2 大部分MBD蛋白保持單獨的MBD域和TRD域，但在MBD2蛋白序列的中心這兩個域發(fā)生了重疊，表明MBD2具有緊密結(jié)合甲基化DNA和抑制轉(zhuǎn)錄的功能。MBD2包含的C-末端卷曲螺旋（coiled coil, CC）域介導蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用；N-末端甘氨酸-精氨酸（glycine-arginine, GR）的重復區(qū)域，則負責翻譯后修飾。MBD2主要是通過與結(jié)合伴侶如（nucleosome remodeling deacetylase, NuRD）/Mi-2復合物和Sin3A相互作用而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用[5]。對MBD2基因敲除小鼠的研究表明，MBD2不具有胚胎致死性，但可能會影響母親的培育行為，這表明其對神經(jīng)系統(tǒng)的影響與MBD1和MeCP2相似。MBD2主要在體細胞中表達，在胚胎細胞中的表達極低，因此，表達的損失并不會嚴重影響胚胎發(fā)育[4]。

1.4 MBD3 MBD3是MBD家族中分子量最小的成員。在所有的家族成員中，MBD2和MBD3顯示了最高的氨基酸序列相似性（71.1%）。兩者之間的主要區(qū)別是，MBD3缺乏MBD2具有的N-末端GR重復區(qū)；兩者相似的是均從MBD域的C-末端開始編碼。目前MBD3有3個剪接亞型：MBD3a，MBD3b和MBD3c。MBD3是MBD家族成員中惟一不會特異性地結(jié)合甲基化DNA而與非甲基化DNA結(jié)合的蛋白，而且還被報道可以與5′-羥甲基化DNA結(jié)合。MBD3結(jié)合非甲基化DNA是因為在其MBD域的2個關(guān)鍵的氨基酸殘基與MBD2的不同，在MBD2中是LYS30和TYR34，而在MBD3中是HIS30和PHE34。MBD3的轉(zhuǎn)錄抑制作用和它與NuRD/Mi-2復合體的相互作用密切相關(guān)。此外，MBD3對于NuRD/ Mi-2的形成和穩(wěn)定是必需的。MBD3-NuRD/Mi-2在胚胎干細胞（embryonic stem cells, ESCs）的多潛能性與分化方面起著關(guān)鍵的作用[6]。MBD3基因敲除小鼠具有胚胎致死性，而且MBD3在ESCs和體細胞組織中均有表達[4]。

1.5 MBD4 在MBD域N-末端的旁邊，MBD4包含了1個C-末端糖苷酶域，它對對稱甲基化CpG（mC→T轉(zhuǎn)換）和非甲基化CpG二核苷酸（C→U轉(zhuǎn)換）的不匹配具有修復作用。MBD4可以結(jié)合甲基化DNA，其更重要的作用似乎是在DNA修復，而不是在轉(zhuǎn)錄抑制。MBD4在體細胞和ESCs中均有表達[4]。有趣的是，MBD4基因敲除小鼠并不具有胚胎致死性，也似乎沒有發(fā)育或成熟的表型，但是它們在脾、腸的上皮細胞中出現(xiàn)mCpG向TpG的轉(zhuǎn)換會增多，這使同時攜帶有APC抑癌基因突變的小鼠腫瘤形成增加[7]。

1.6 MBD5和MBD6 MBD5和MBD6是近期發(fā)現(xiàn)且研究較少的MBD蛋白家族成員，它們包含的N-末端MBD域，定位于臂間異染色質(zhì)。目前尚沒有MBD5和MBD6在體外結(jié)合甲基化DNA的報道。這兩個蛋白質(zhì)都有富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域，而MBD5包含1個額外的Pro-Try-Try-Pro（PWWP）結(jié)構(gòu)域，它對蛋白結(jié)合甲基化的組蛋白具有指導作用[8]。MBD5和MBD6在睪丸中均高表達，MBD5在大腦和卵母細胞中也高表達，提示可進一步研究其發(fā)展功能。MBD6是脂肪組織中干細胞OCT4的靶基因，可以被招募到激光誘導的DNA損傷位點[9]。MBD5和MBD6均直接與人類多梳去泛素化酶復合體相互作用[10]。

1.7 SETDB和BAZ2 SETDB1/2和BAZ2A/B是目前已知的含有MBD域，可以不依賴于蛋白伴侶直接修飾蛋白/組蛋白的蛋白。SETDB1和SETDB2含有SET結(jié)構(gòu)域，賦予組蛋白H3K9賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性，而BAZ2A和BAZ2B含有溴結(jié)構(gòu)域，賦予乙?；M蛋白結(jié)合能力。在這兩組蛋白中的MBD域與核心MBD家族蛋白相比，其功能是不同的。SETDB1通過結(jié)合伴侶MBD1定位于5-mC并參與異染色質(zhì)形成和轉(zhuǎn)錄抑制[11]。有趣的是，在BAZ2A中的MBD域（也稱為TIP5）在體外結(jié)合非甲基化DNA而不是甲基化DNA。BAZ2A是核仁重塑復合體（nucleolar remodelling complex, NoRC）的1個組成部分，對于表觀遺傳沉默核糖體DNA（rDNA）是必需的，通過協(xié)調(diào)H3K9二甲基化、H4脫乙?；?、DNA甲基化來形成沉默的異染色質(zhì)[12]。目前對BAZ2B和SETDB2研究的較少，因其在功能區(qū)域與BAZ2A、SETDB1具有相似性，提示它們可能具有相似的功能。

2 MBD蛋白家族主要功能

2.1 異染色質(zhì)的形成 異染色質(zhì)是一種很難形成的染色質(zhì)狀態(tài)，涉及轉(zhuǎn)錄抑制和染色質(zhì)穩(wěn)定性，其特征在于壓縮的染色質(zhì)富含表觀遺傳標記，如H3K9甲基化和DNA甲基化。代表性的結(jié)構(gòu)是由連接-組蛋白HP1將連接體DNA結(jié)合在核小體之間形成壓縮的染色質(zhì)光纖[13]。早期免疫熒光研究發(fā)現(xiàn)MBD蛋白定位于甲基化位點，組成沉默的臂間異染色質(zhì)（位于著絲粒周圍），暗示其在轉(zhuǎn)錄沉默中的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，MBD蛋白家族（除了MBD3）的過度表達，可誘導異染色質(zhì)聚集，而敲低MBD蛋白則會導致異染色質(zhì)的損失，同時增加了基因組的不穩(wěn)定性。MeCP2和MBD1可與抑制性甲基化組蛋白相互作用并結(jié)合染色質(zhì)重塑伴侶HP1，參與異染色質(zhì)的生成[14]。

2.2 組蛋白修飾 組蛋白尾部關(guān)鍵氨基酸殘基的共價鍵修飾通過影響DNA結(jié)構(gòu)動力學，以及結(jié)合識別這些修飾的蛋白質(zhì)來影響染色質(zhì)的功能。組蛋白甲基化可以是活躍的也可以是抑制的，這取決于乙?；揎?。組蛋白乙酰化通常轉(zhuǎn)化為活躍的轉(zhuǎn)錄和開放的染色質(zhì)，而脫乙?；瘎t轉(zhuǎn)化為抑制性的轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化、組蛋白脫乙?；徒M蛋白甲基化與它們控制基因的表達密切相關(guān)[15]。MBD蛋白可以兼具DNA甲基化與組蛋白修飾的功能。MBD1可以鏈接DNA甲基化和組蛋白甲基化。其最早通過組蛋白脫乙酰化被確定為轉(zhuǎn)錄抑制子，后歸因于它與異染色質(zhì)復合物組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39H1和HP1的相互作用[4]。MeCP2通過與組蛋白修飾復合物本身的相互作用，或調(diào)制其結(jié)合伴侶（如CoREST和N-CoR），導致組蛋白甲基化和/或脫乙?；痆5]。與組蛋白去乙酰化酶復合物的相互作用不僅限于MeCP2。例如，NuRD/Mi-2和Sin3A-HDAC復合物能夠與MBD2、MBD3和MBD4相互作用。其中，MBD2- NuRD/Mi-2是第一個被證明能夠特異性結(jié)合甲基化DNA的HDAC復合物，協(xié)調(diào)甲基化CpG島啟動子沉默與NuRD/ Mi-2復合物的關(guān)系[16]。此外，MBD2涉及組蛋白精氨酸甲基化，MBD2與蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（protein arginine methyltransferase, PRMT）家族的2個成員PRMT1和PRMT5相互作用，PRMT1造成激活的非對稱的去甲基化（H4R3me2a），而PRMT5造成沉默的對稱的二甲基化（H4R3me2s）。總的來說，PRMT1/5和MBD2之間的合作可以調(diào)節(jié)MBD2在轉(zhuǎn)錄控制中的活性[17]。

2.3 核小體重塑 核小體定位可以暴露或隱藏DNA區(qū)域，從而決定調(diào)節(jié)蛋白與DNA相互作用的可行性。NuRD/Mi-2是一種染色質(zhì)重塑復合物，具有重塑核小體的能力，由Mi-2亞基（SWI/SNF復合物中ATP酶依賴的組件）特異激活[18]。這個活動對MBD2介導的基因沉默機制至關(guān)重要，因為通過干擾MBD2和Mi-2亞基之間的相互作用，可能會增加染色質(zhì)的可獲性及有效預防B細胞中mb-1基因的沉默[19]。核小體重新定位和MBD蛋白之間的聯(lián)系并不限于MBD2-NuRD/Mi-2。MeCP2-Sin3A/HDAC2與另一個SWI/SNF家族成員BRM的相互作用，進一步表明了MBD家族成員參與核小體重塑和組蛋白去乙酰化活動[18]。

2.4 DNA甲基化 在結(jié)腸癌細胞中，MBD3-NuRD/Mi-2復合物內(nèi)的MBD3可以通過招募DNMT1和DNMT3b到抑癌基因的啟動子，來調(diào)整組蛋白去乙?；⑹笵NA重新甲基化[20]。例如，原癌基因轉(zhuǎn)錄因子FBI-1通過招募MBD3-NuRD/Mi-2可以沉默p21WAF/CDKN1A啟動子，從而協(xié)調(diào)組蛋白去乙?；虳NA甲基化[21]。同樣，在白血病細胞株中也觀察到，PML-RARα融合蛋白招募MBD3-NuRD/Mi-2到靶基因的啟動子引起組蛋白去乙?；?，然后分別招募DNMT3A和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶復合體PRC2來啟動DNA甲基化和沉默H3K27me3[22]。MBD2-NuRD/Mi-2相互作用也直接影響DNMT1/DNMT3B對DNA甲基化位點的活性，允許MBD2保持并潛在蔓延甲基化[20]。MBD4的DNA修復能力也依賴于與DNMT1和DNMT3B的相互作用，由于MBD4可以修復甲基化CpG位點mC→T的轉(zhuǎn)換，因此可推測其與DNMT的相互作用允許重新修復的CpG位點再次發(fā)生甲基化，并維持其甲基化狀態(tài)[23]。

2.5 染色質(zhì)組織 染色質(zhì)組織是一種高階形式的染色質(zhì)調(diào)控，它控制著染色質(zhì)纖維的三維結(jié)構(gòu)并影響了各種細胞功能包括轉(zhuǎn)錄和基因組調(diào)控。三維結(jié)構(gòu)包括染色質(zhì)固縮和染色質(zhì)循環(huán)，即將疏遠的調(diào)控元件的位點放在一起，控制轉(zhuǎn)錄活性[24]。MeCP2不僅有組蛋白修飾中的位點特異性作用，似乎還具有總體的染色質(zhì)組織功能，通過與SUV39H1-HP1相互作用在異染色質(zhì)聚集中發(fā)揮作用。除此之外，MeCP2還具有類似于HP1的連接組蛋白樣功能，可以壓縮核小體和染色質(zhì)[25]。體外研究顯示，無論是甲基化還是非甲基化的DNA，MeCP2在高濃度時均可以形成并穩(wěn)定核小體陣列[26]。然而，對MeCP2突變體的體內(nèi)研究顯示，具有功能性的MBD區(qū)域能增加MeCP2對染色質(zhì)的停留時間并提高染色質(zhì)聚集的穩(wěn)定性，說明甲基化的DNA對MeCP2穩(wěn)定誘導大規(guī)模染色質(zhì)組織必不可少[27]。

2.6 重新編程、多潛能性及分化能力 發(fā)育階段也許是定義MBD-NuRD/Mi-2在DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄活性作用方面的一個關(guān)鍵因子。全長型MBD2在體細胞中表達水平較高，而MBD3在小鼠的ESCs中更加豐富，MBD3-NuRD/Mi-2可能是ESCs中NuRD的主要種類，這表明MBD2、MBD3在ESCs發(fā)育過程中具有不同的作用[28]。MBD2a和MBD2t水平之間的平衡對于ESCs的重組和分化非常重要。二者都能結(jié)合和調(diào)節(jié)多潛能性基因OCT4和NANOG的表達[29]。MBD3基因敲除小鼠具有胚胎致死性，表明不同于其他的MBD家族成員，MBD3對于胚胎發(fā)育是必不可少的。人成纖維細胞敲低MBD3后NuRD極大地提高了誘導多潛能干細胞的重組效率，暗示MBD3可能對細胞分化十分關(guān)鍵[30]。

3 MBD蛋白家族與疾病的關(guān)系

MBD蛋白家族作為表觀基因“讀者”的作用具有重要的意義，它們參與改變DNA甲基化模式和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，潛在性地導致轉(zhuǎn)錄調(diào)控的紊亂。通過異常的表達與翻譯后修飾，破壞與蛋白結(jié)合伴侶的相互作用和定位，構(gòu)成人類疾病發(fā)生的潛在機制。最早被報道與MBD蛋白直接相關(guān)的疾病是由MeCP2基因突變引起的雷特綜合征[3]。另外，MBD蛋白還涉及許多神經(jīng)源性疾病，如自閉癥、精神分裂癥、普拉德-威利綜合征和天使綜合征[31]。

基因組測序技術(shù)的出現(xiàn)，更好地闡明了不同類型癌癥中MBD蛋白家族成員的突變頻率。腫瘤基因圖譜（The Cancer Genome Atlas, TCGA）數(shù)據(jù)顯示，每個MBD蛋白在不同組織類型的腫瘤中突變頻率明顯不同。總的來說，胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和子宮癌的MBD基因突變頻率總數(shù)最高，皮膚癌、膀胱癌和肺癌總突變率達到10%以上。MBD5和MBD6是MBD蛋白中突變頻率最高的成員，MBD5在皮膚癌、結(jié)腸癌和子宮癌中的突變頻率分別為7.7%、6.5%和7.6%[32]。除了突變，擾亂了的MBD蛋白基因表達在癌癥小鼠模型體內(nèi)也具有致瘤性，這樣的現(xiàn)象在腫瘤細胞株和人類癌癥中也有報道。例如，在胰腺癌中MBD1的過表達與胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增加有關(guān)，這是由于MBD1介導了E-cadherin蛋白的下調(diào)[33]，MBD2的過表達已被證實在膠質(zhì)母細胞瘤和乳腺癌中發(fā)揮作用[34]。也有許多報道顯示MBD在一些癌癥中的表達是下降的，如MBD2、MBD3基因在胃癌組織中下調(diào)[35]。MBD4表達缺失顯示出患癌的易感性增加，在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)MBD4突變常伴有微衛(wèi)星不穩(wěn)定性[36]。

表觀遺傳學對慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB）感染的自然進程也有影響，有研究顯示CHB患者外周血中單個核細胞的MeCP2、MBD1、MBD2和MBD4的mRNA水平較健康對照者明顯增高，MBD1的mRNA水平在免疫耐受期最高，MBD2和MBD4的mRNA水平在免疫清除期最高，病理檢測處于S3和S4期的CHB患者的MeCP2 mRNA最高。提示MBD蛋白家族參與CHB的發(fā)病機制并與疾病進展相關(guān)，暗示其在判斷CHB嚴重程度上具有重要價值[37]。

4 結(jié)論及展望

綜上所述，本文描述了MBD蛋白質(zhì)的家族成員，以及其在基因調(diào)控和細胞生物學方面多元而復雜的作用。最近研究發(fā)現(xiàn)MBD蛋白的新作用，作為DNA甲基化模式的調(diào)整者和更高級別的表觀基因組織，它不只是靜態(tài)的“讀者”，也可以作為DNA甲基化的動態(tài)促進者，在“編輯”和“寫作”中發(fā)揮重要作用。在多種腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)疾病中觀察到MBD蛋白的失調(diào)或突變，提示其對于維持表觀遺傳和細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要性。近期研究結(jié)果顯示MBD蛋白在CHB中更廣泛的作用及臨床意義。未來的研究將揭示MBD蛋白的特異性和基因組的背景，以及它們在維持正常細胞穩(wěn)態(tài)中的功能和在異常的表觀基因組紊亂及疾病預后中的作用，并決定是否以及如何靶向定位MBD蛋白來治療人類疾病。

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（2017-03-11收稿 2017-05-21修回）

（本文編輯 趙雅琳）

Research progress of MBD protein family

YAN Wei-wei, HUANG Ang, DAI Guang-hai*
Graduate School 2014, Medical School of Chinese PLA, Beijing 100835, China *Corresponding author, E-mail: daigh60@sohu.com

Methyl-CpG-binding domain (MBD) protein family plays an important role in transcriptional regulation of genes. MBD protein binding function is achieved through functional MBD region and methylated CpG, and results in gene suppression through heterochromatin formation, histone acetylation and methylation of DNA. However, some MBD proteins also bind to non-methylated DNA, and exert transcriptional activation and multiple differentiation potentials through other regulatory domains or interaction with the nucleosome remodeling deacetylase (NuRD)/Mi-2 complex. The gene mutation or abnormal expression of MBD protein can cause many diseases, including nervous system diseases, cancer and chronic hepatitis B. In this study, the main function of the chief members in MBD protein family and their relationship with diseases were summarized.

methyl binding domain proteins; DNA methylation; cancer; chronic hepatitis B

Q51

A

1007-8134(2017)03-0181-05

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.03.015

國家自然科學基金面上項目（81372286）；國家自然科學基金青年項目（81600453）；北京市科技新星計劃（Z171100001117114）；軍隊醫(yī)學科技青年培育計劃（15QNP084）；解放軍總醫(yī)院2014級博士創(chuàng)新基金（B14015）；解放軍第三〇二醫(yī)院院長創(chuàng)新基金（QNPY2015007）

100835 北京，解放軍醫(yī)學院研究生院2014級（閆偉偉）；100039 北京，解放軍第三〇二醫(yī)院肝臟腫瘤診療與研究中心（閆偉偉），非感染性肝病診療中心（黃昂）；100835 北京，解放軍總醫(yī)院腫瘤內(nèi)二科（戴廣海）

戴廣海，E-mail： daigh60@sohu.com