孫扣忠，胡 彬，蔣建雄,3

(1.鹽城市新洋農業(yè)試驗站，江蘇 鹽城 224049； 2.湖南農業(yè)大學 生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；3.江蘇大學 環(huán)境與安全工程學院/生物質能源研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

芒花粉活力及柱頭可授性研究

孫扣忠1，胡 彬2，蔣建雄2,3

(1.鹽城市新洋農業(yè)試驗站，江蘇 鹽城 224049； 2.湖南農業(yè)大學 生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；3.江蘇大學 環(huán)境與安全工程學院/生物質能源研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

采用I2-KI染色法和離體萌發(fā)法測定芒(Miscanthussinensis)花粉活力以及不同保存條件下的花粉壽命，并利用H2O2法檢測雌蕊柱頭的可授性。結果表明：芒花粉量大，平均花粉量/胚珠比(P/O值)達到5445±2883，屬于專性異交性植物，且花粉初始活力較高，平均為78.68%±17.46%，但離體花粉的活力喪失快，室溫干燥和濕潤條件下保存的花粉壽命分別為70 min和100 min。不同基因型在花粉量、花粉活力及壽命上存在變異。雌蕊柱頭可授性較高，活性可持續(xù)8 d，最佳授粉期為開花前1 d至開花后1 d。

芒；花粉活力；柱頭可授性；P/O值

芒屬(Miscanthus)植物為禾本科C4類多年生高大草本纖維素類植物，主要分布在東亞、東南亞和太平洋群島等地區(qū)，我國是世界芒屬植物資源的分布中心[1-3]。芒屬植物具有生物質產量高、抗逆性強、適應性廣等特點，可用于造紙、制藥、水土保持和生態(tài)修復等[4-5]。近年來，芒屬作為一種具有重要開發(fā)利用前景的能源植物而受到國內外的廣泛關注[6]。芒(Miscanthussinensis)是芒屬的一個廣布種，在日本、朝鮮半島以及我國從吉林南部到海南三亞等地區(qū)均有分布，其類型多樣，蘊藏著豐富的基因資源，是目前在歐美地區(qū)被廣泛研究和栽培的優(yōu)良三倍體自然雜交種M.xgiganteus的親本種之一[7-9]。

傳粉是植物授粉受精過程的一個重要環(huán)節(jié)，花粉粒由傳粉媒介(昆蟲、風或其他媒介)傳送到雌蕊柱頭而完成傳粉過程。為保證授粉成功，必須使花粉在具有生活力時到達適宜的柱頭。因此，植物花粉活力與柱頭可授性評價是繁殖生物學的重要研究內容[10-11]。目前國內外對于芒的繁殖生物學研究鮮有報道，嚴重限制了對該類植物資源的開發(fā)利用。因此，通過對芒的花粉活力以及柱頭可授性開展系統(tǒng)的研究，旨在闡明該物種的繁殖生物學特征，為進一步開展芒的遺傳學分析和遺傳改良方面的研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

采集野外的芒種質資源，其原產地信息見表1。采集根狀莖種植于試驗圃中，進入盛花期后取樣進行測定分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉活力測定 I2-KI染色法[12]測定不同基因型芒花粉活力以及花藥散粉后不同時段的花粉活力變化情況，每隔2 h取樣測定1次。散粉當天采集花粉，置于載玻片上，加1～2滴I2-KI溶液，在Olympus普通光學顯微鏡(100×)下觀察，花粉粒顯現藍黑色即為有活力。每次隨機觀測100個花粉粒，計算染色百分率，3次重復，取平均值。

離體萌發(fā)法 參考Brewbaker & Kwack液體培養(yǎng)基配方[13]，并在此基礎上稍作改動：A 無機鹽母液：HBO30.1 g，Ca(NO3)2·4H2O 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，KNO30.1 g，加蒸餾水至100 mL。

B 應用培養(yǎng)基：無機鹽母液 1 mL，蔗糖2 g，蒸餾水9 mL。

花期選取正常開花植株，將花序中上部小穗剪下(穎片已展開但花藥尚未開裂)。每個樣本收集30個花藥放在干凈玻璃片上，分別置于鋪有干燥濾紙和濕潤濾紙的培養(yǎng)皿，室溫(25℃)條件下保存?zhèn)溆?。待花藥自然開裂,花粉粒散出，每隔10 min用毛筆將花粉均勻散在置有培養(yǎng)基的凹面載玻片上，置于25℃暗培養(yǎng)30 min，在Olympus光學顯微鏡(100×)下觀察，每次選取5個視野(每個視野花粉粒數大于50)測定花粉活力，以花粉管長度超過花粉粒直徑2倍視為萌發(fā)，3次重復，統(tǒng)計其平均萌發(fā)率?；ǚ勖劝l(fā)率即代表其活力。持續(xù)測定直至萌發(fā)率值下降至零為止。

表1 試驗材料的來源信息

1.2.2 柱頭可授性測定 采用Dafni的過氧化氫法[14]對芒雌蕊柱頭的可授性進行測定：早上6∶00～8∶00，對當天開花小穗進行標記，連續(xù)標記10 d，取不同開花天數的雌蕊柱頭測定其可授性。將收集到的柱頭置于凹面載玻片中，滴加現配的3%過氧化氫溶液，5～10 min后在Olympus光學顯微鏡(40×)下觀察柱頭表面產生氣泡的情況。若柱頭表面有大量氣泡則判定為可授，柱頭表面僅有微量氣泡冒出或無氣泡則為不可授。根據氣泡數量將柱頭可授性強度分為4個等級。每40個柱頭為一組，統(tǒng)計具有可授性的柱頭數占供檢柱頭總數的比例，3次重復，取平均值。

1.2.3 花粉量/胚珠比(P/O)測定 在開花當天，隨機選取即將開放、花藥尚未開裂的小穗，放入2 mL離心管中，每個離心管1個小穗(3個花藥)，室溫條件下靜置待花藥前端自然裂開散粉，加入1 mL碘液，在振蕩器下振蕩30s混勻后用移液槍吸取5 μL花粉溶液于載玻片上，在Olympus光學顯微鏡(40×)下直接觀察記數，測量的數值乘以200，即為一個小穗中的花粉?？倲?，3次重復，最后計算平均值。芒的一個小穗中胚珠數為1，因此，其P/O值等于一個小穗中的花粉?？倲?。

1.2.4 數據統(tǒng)計與分析 數據的平均值采用Microsoft Excel進行，利用DPS軟件進行方差分析和多重比較分析，百分率數據經轉換后進行方差分析(Duncan法)。

2 結果與分析

2.1 花粉活力的測定

2.1.1 I2-KI染色法 I2-KI染色法判斷花粉是否具有生活力的主要依據是花粉內含物淀粉遇碘發(fā)生變色反應。芒花粉經I2-KI染色后顏色較深，說明其花粉中的淀粉含量較高(圖1)。對10份不同基因型芒的花粉活力進行測定，結果表明，不同基因型植株的花粉初始活力均較高，平均為78.68%±17.46%。

圖1 I2-KI染色法檢測芒基因型Mis06的花粉活力Fig.1 The pollen viability in M.sinensis genotype Mis06 determined with I2-KI staining method

測定芒小穗開花散粉后不同時間的花粉活力，發(fā)現散粉后不同時間段的花粉染色率較高，均達78%以上，差異不顯著(圖2)。實際而言，花粉在室溫下離體保存數小時后已經完全失去活力，但由于花粉細胞內的淀粉仍然存在，故仍被染色，采用I2-KI染色法對花粉活力跟蹤測定可能無法做出正確判斷。

圖2 I2-KI染色法測定的不同離體保存時間下芒基因型Mis06花粉活力Fig.2 The variation of pollen viability in M.sinensis at different in vitro storage duration determined by I2-KI staining method

2.1.2 離體萌發(fā)法 通過對Brewbaker & Kwack培養(yǎng)基中蔗糖的濃度進行篩選，發(fā)現20%的蔗糖濃度對芒花粉的萌發(fā)及花粉管生長較為適宜。

在室溫(25℃)干燥和室溫濕潤兩種條件下，利用離體萌發(fā)法對不同基因型(n=10)的芒花粉活力進行測定。結果表明，不同基因型的花粉活力存在明顯差異(圖3，表2)。不同保存條件下，花粉活力隨著離體時間的延遲不斷下降，最后完全失活，干燥條件下較濕潤條件下花粉活力的下降更快。花藥剛開裂時，花粉的平均萌發(fā)率為64.56%±15.86%，離體保存10 min后，濕潤條件下平均萌發(fā)率下降至57.67%±17.57%，而干燥條件下則降至44.38%±14.73%；濕潤條件下保存70 min后，平均萌發(fā)率為18.62%±7.90%，100 min后降低至0，而干燥保存條件下保存70 min后花粉活力完全喪失，萌發(fā)率為0(表2)。所以，室溫干燥條件下芒的花粉壽命約為70 min，濕潤條件下花粉壽命不超過100 min。

圖3 不同基因型芒花粉生活力的離體萌發(fā)檢測Fig.3 The determination of pollen viability in M.sinensis with in vitro germination method注：A.基因型Mis02 (58.22%);B.基因型Mis06(86.29%)

離體時間/min干燥最大值最小值平均值濕潤最大值最小值平均值090．0031．7164．56±15．8690．0031．7164．56±15．861078．6917．7444．38±14．7398．0825．6457．67±17．572072．458．3331．5±15．7983．0815．6650．05±15．293050．826．4119．89±13．1268．5721．6243．67±13．014055．062．1716．89±14．2068．7521．3338．94±12．155015．316．1011．47±3．3760．267．4732．16±13．346011．594．947．41±2．6956．529．7128．18±12．25700．000．000．0036．734．7218．62±7．90800．000．000．0030．435．1714．26±7．4890---18．751．6911．95±5．34100---0．000．000．00

對不同基因型花粉活力的檢測結果進行方差分析，結果顯示，不同基因型、不同保存時間及不同保存條件之間存在極顯著差異，表明它們對花粉活力均有極顯著影響(P<0.01)；基因型×保存時間×保存條件互作存在極顯著差異，表明不同基因型芒的花粉對不同保存時間和不同保存條件具有特殊的適應性(表3)。

2.2 柱頭可授性

在自然條件下，芒雌蕊柱頭活力最高值出現在開花前一天(-1 DPA)和開花當天(0 DPA)，柱頭可授性為100%；1 DPA時，柱頭可授性隨時間變化開始下緩慢下降，4 DPA時降低至50%；到7 DPA時只有極少數柱頭具可授性，8 DPA時完全喪失(表4)。由此可知，芒的柱頭可授期約為8 d，最佳可授期為-1～1 DPA。從柱頭可授性強弱分析，-1～1 DPA的柱頭呈現出強可授性，柱頭表面產生大量氣泡；從2～5 DPA柱頭呈現較強可授性，產生較多氣泡；到6 DPA，柱頭可授性逐漸減弱，產生少數氣泡(圖4)。

表3 芒花粉活力方差分析

注：****表示0.000 1極顯著水平

表4 開花后不同時間芒柱頭可授性

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；-表示柱頭不具可授性；+表示柱頭具可授性；++表示柱頭具較強可授性；+++表示柱頭具強可授性

從柱頭顏色變化來看，最初穎片未展開時花蕾中的柱頭呈白色，此時的柱頭不具備可授性；而-1 DPA和0 DPA的柱頭顏色為鮮艷的紫紅色；2～7 DPA后柱頭顏色逐漸由紫紅色變?yōu)榘底霞t色，極少數柱頭呈現棕色甚至黑色。

圖4 基因型Mis06雌蕊柱頭在開花后不同天數的可授性強弱比較Fig.4 The comparison of stigma receptivity of genotype Mis06 at different days post-anthesis注：A.1 DPA時的柱頭可授性;B.6 DPA時的柱頭可授性

2.3 花粉量/胚珠比(P/O)

為了闡明芒屬于哪種類型的繁育系統(tǒng)，統(tǒng)計了其花粉量與胚珠比(P/O)，芒的每個小穗中包含3個花藥和一個胚珠，通過對其花粉量測定，發(fā)現不同基因型的單個小穗中平均花粉量存在較大的變異，但在花序同一位置上兩個孿生小穗的花粉量差異不大。每個小穗中的花粉量介于2 162±228～11 720±912，平均值為5 445±2 883。因為芒每個小穗中的胚珠數目為1，因此芒的平均P/O值為5445±2883(圖5)。根據Cruden劃分的繁育系統(tǒng)標準[15 ]，芒是屬于專性異交性植物。

圖5 不同基因型芒的平均P/O值Fig.5 The average P/O values of different M.sinensis genotypes

3 討論

研究采用I2-KI染色法和離體萌發(fā)法對芒的花粉活力進行測定，其中I2-KI染色法的測定值與離體萌發(fā)法相比偏高，在煙草(Nicotianatabacum)等植物的花粉活力測定中也存在類似現象[16]。離體萌發(fā)法的測定值能更真實地反映花粉的活力變化規(guī)律，但其操作步驟耗時費力，一般適用于花粉萌發(fā)需時較短的植物，如金魚草、煙草和百合等[13]；I2-KI染色法不能實時地反映花粉活力，但該方法操作步驟簡單，效率高，可用于花粉活力的初步篩查，特別是大樣本的花粉活力普查。

花粉量與胚珠比(P/O)是鑒定植物繁育系統(tǒng)的關鍵指標之一，芒的P/O平均值為5 445±2 883，屬于專性異交性植物，這與目前認為芒為自交不親和性植物的觀點相一致。本研究表明，不同基因型芒植株花粉初始萌發(fā)活力及花粉壽命的差異明顯，室溫條件下的花粉平均萌發(fā)率為64.56%±15.86%，散粉后70～100 min內其活力完全喪失，且干燥條件下活力下降比濕潤條件下更快，這是傳粉或授粉過程中的不利因素，極大地限制了傳粉距離和授粉時間。禾本科植物的花粉通常為三細胞花粉，壽命短，但有研究表明，較低溫度和較高濕度通常有利于花粉活力的保持，有利于植株的結實率[17]。李要民等[18]也發(fā)現低溫高濕(5℃、80%)條件下，水稻、玉米和狼尾草3種禾本科植物的花粉活力保持的時間可達30 d以上。芒的同一圓錐花序上小穗是從花序中部向上部和下部依次開放，整個花序開放時間持續(xù)數天，而雌蕊柱頭的可授性能持續(xù)8 d，可以有效緩解花粉壽命短對傳粉造成的壓力，因此，柱頭和花粉的活性不是限制芒植株自交結實的因子。

蕾期人工授粉通常是克服植物自交不親和性的一種有效途徑與方法[19-20]。研究表明，芒雌蕊柱頭在開花前一天(-1 DPA)已具備了較高的可授性，這為采用蕾期人工授粉方法以獲得其自交種子及培育純系提供了可能。純系的培育可以為進一步開展芒的遺傳學分析、雜種優(yōu)勢利用以及全基因組測序等研究奠定材料基礎。

4 結論

芒屬于專性異交性植物，在開花期內其花粉和雌蕊柱頭的活性均能維持較高水平，而且兩者的成熟期可以相遇，說明它們并不是導致芒發(fā)生自交不親和性的原因。此外，利用芒繁育系統(tǒng)的特點開展不同基因型之間的人工雜交育種是十分可行的。

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Study on pollen viability and stigma receptivity ofMiscanthussinensis

SUN Kou-zhong1,HU Bin2,JIANG Jian-xiong2,3

(1.XinyangAgriculturalExperimentStationofYanchengCity,Yancheng224049,China; 2.CollegeofBioscience&Biotechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China; 3.BiofuelsInstitute,CollegeofEnvironmentandSafetyEngineering,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China)

The pollen viability for differentMiscanthussinensisgenotypes and the pollen life-span under dry or wet storage conditions were evaluated by in vitro pollen germination method and I2-KI staining method,and the stigma receptivity was also determined with H2O2method.Results showed that the anther ofM.sinensishad a large number of pollen grains with a mean pollen-ovule ratio (P/O) up to 5445±2883,belonging to a reproduction system of oligate xenogamy.The average initial pollen viability was 78.68%±17.46%,but at room temperature (25℃),the pollen viability for all tested genotypes only lasted around 70 minutes under dry storage condition and 110 minutes under wet condition,respectively.The different genotypes kept a higher stigma receptivity until 8 days post-anthesis (8 DPA),and the optimal period to receive pollen grains was from -1 DPA to 1 DPA.

Miscanthussinensis;pollen viability;stigma receptivity;P/O

2016-07-05；

2016-10-31

江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目 (CX(15)1005) 和國家863課題(2012AA10180104)資助

孫扣忠(1965-)，女，江蘇阜寧人，助理研究員，研究方向為植物遺傳育種研究。 E-mail：sunkouzhong@126.com 蔣建雄為通訊作者。

Q 944.58

A

1009-5500(2017)01-0014-06