馮立娟+焦其慶+尹燕雷+楊雪梅+程云

摘要：本研究以‘泰山紅石榴果實(shí)為試材，利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆果皮中POD基因cDNA片段，利用BLAST和ORF Finder分析其核苷酸序列，并利用ProtParam、SPOMA、DANMAN等軟件分析其氨基酸序列。結(jié)果表明，克隆得到1 092 bp的cDNA片段，該基因含828 bp的CDS序列，編碼276個(gè)氨基酸。該基因核苷酸序列與煙草、茜草、花生二倍體雜生種和潘那利番茄等植物的相似性分別為77%、77%、76%和76%；氨基酸序列與荔枝、克萊門柚、蘋果和白梨的相似性分別為89%、87%、84%和84%；GenBank登錄號(hào)為KY129694。預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)理論分子量為30 582.59 D，等電點(diǎn)（pI）為8.83，具有過(guò)氧化物酶完整的保守結(jié)構(gòu)域，含有Cd00693和 Cl00196兩個(gè)保守功能域，為親水性蛋白；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)則卷曲（38.41%）、α-螺旋（37.68%）、延伸鏈（13.77%）和β-轉(zhuǎn)角（10.14%）組成。該研究結(jié)果為揭示石榴果實(shí)褐變機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：石榴；POD基因；RT-PCR；克隆；序列分析

中圖分類號(hào)：S665.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：-4942（2017）03-0016-05

AbstractThe cDNA sequence of POD was cloned from Taishanhong pomegranate peel by RT-PCR and RACE technique. The nucleotide sequence of POD was analyzed by BLAST and ORF Finder. The amino acid sequence of POD was analyzed by ProtParam， SPOMA and DANMAN softwares. The results indicated that 1 092 bp cDNA sequence of POD was obtained. It contained 828 bp CDS sequence and encoded 276 amino acids. The similarity of POD nucleotide sequence in pomegranate with Nicotiana tabacum， Rubia cordifolia， Arachis ipaensis and Solanum pennellii was 77%， 77%， 76% and 76%， respectively. Based on the deduced amino acid sequences of POD genes， the similarity of pomegranate with Litchi chinensis， Citrus clementina， Malus domestica and Pyrus bretschneideri was 89%， 87%， 84% and 84%， respectively. The GenBank accession number was KY129694. The theoretical molecular mass of POD protein was 30 582.59 D， and the isoelectric point was 8.83. The protein of POD gene was hydrophilic protein， which had the complete conservative structure domain of peroxidase， and contained two conservative functional domains， Cd00693 and Cl00196. The secondary structure of POD protein was composed by random coil （38.41%）， α-helix （37.68%）， extended strand （13.77%） and β-turn （10.14%）. The results established a theoretical foundation for revealing the mechanism of peel browning in pomegranate fruit.

KeywordsPomegranate； POD gene； RT-PCR； Cloning； Sequence analysis

過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）是植物中普遍存在的一類氧化還原酶，它既可以還原細(xì)胞內(nèi)積累的H2O2，也可以降解逆境和生長(zhǎng)條件下的活性氧[1，2]。POD由一大類基因家族編碼，通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸?shù)狡渌M織細(xì)胞或亞細(xì)胞部位，調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育[3，4]。大量研究表明， POD在植物形態(tài)建成[5]、木質(zhì)素代謝[6]、組織褐變[7]和逆境響應(yīng)[8]等方面起重要作用。

石榴（Punica granatum L.）是我國(guó)重要的果樹(shù)樹(shù)種之一，其果實(shí)富含可溶性酚類物質(zhì)，保健功能強(qiáng)，越來(lái)越受到消費(fèi)者青睞[9]。果實(shí)褐變是石榴極易發(fā)生的生理病害，嚴(yán)重影響其商品價(jià)值，制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展[10]。石榴褐變是酚類物質(zhì)在多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和POD等一系列酶作用下，酶與底物區(qū)域化被解除而發(fā)生的[11]。從生理生化角度已證實(shí)，POD是荔枝和龍眼果實(shí)褐變的主導(dǎo)酶類[12]，其與石榴果皮褐變也存在密切正相關(guān)關(guān)系[13]。但在分子水平關(guān)于石榴果實(shí)POD基因與褐變關(guān)系方面的研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。目前，GenBank登錄的POD基因序列有1 000多個(gè)，已從數(shù)百種物種中克隆到POD基因，如荔枝（Litchi chinensis Sonn）[7]、山楂（Crataegus pinnatifida）[14]和鴨梨（Pyrus bretschneideri Rehd cv. Yali）[15]等多種果樹(shù)作物的POD基因已被分離出，但石榴POD基因及相關(guān)信息還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以‘泰山紅石榴為試材，利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆其POD基因cDNA片段，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為從分子水平揭示石榴果實(shí)褐變機(jī)理提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

以山東主栽石榴品種‘泰山紅幼果（果實(shí)直徑2～3 cm）為試材，果實(shí)洗凈擦干后，用削皮刀取果皮，液氮速凍后放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1總RNA提取和cDNA第一鏈的合成采用RNA prep Pure Plant Kit試劑盒（DP441，北京天根生化有限公司）提取石榴果皮總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，采用Nanodrop 紫外分光光度計(jì)測(cè)其OD值。采用TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0（Code No. DRR019S）合成cDNA第一鏈。

1.2.2石榴POD基因的克隆根據(jù)已知物種POD基因同源序列中間片段設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物F1和R1（表1），以合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系總體積50 μL：2 × Ex Taq buffer 25 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，上、下游引物各1.5 μL，cDNA 5 μL，Ex Taq酶1 μL，滅菌蒸餾水15 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃保溫10 min，4℃保存。

分別設(shè)計(jì)3′ RACE引物和5′ RACE引物（表1），進(jìn)行3′ RACE 和5′ RACE 擴(kuò)增，步驟參照SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（634923，Clontech）和5′ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0（18374-058，Invitrogen）試劑盒說(shuō)明。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，膠回收純化目的片段，并連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，測(cè)序獲得包含ORF的基因序列。

1.2.3生物信息學(xué)分析利用DNAMAN對(duì)克隆獲得的中間片段、3′ RACE和5′ RACE序列進(jìn)行拼接，并進(jìn)行多序列比對(duì)和同源性分析；利用ORF Finder預(yù)測(cè)拼接序列的開(kāi)放閱讀框和編碼的蛋白質(zhì)序列；利用NCBI的BLASTN和BLASTP分析拼接序列核苷酸和氨基酸序列的相似性；用CDD進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析；利用Expasy Protparam分析該蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；利用ProtScale分析蛋白質(zhì)的疏水性/親水性；利用SOPMA對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1石榴POD基因cDNA片段克隆

以天根RNA prep Pure Plant Kit試劑盒提取石榴果皮RNA，以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，利用簡(jiǎn)并引物F1和R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在350 bp左右出現(xiàn)特異性條帶，測(cè)序結(jié)果顯示該序列長(zhǎng)313 bp （圖1A）。用3′ RACE特異引物進(jìn)行3′端序列擴(kuò)增，獲得約400 bp的3′端序列，測(cè)序結(jié)果表明3′端為351 bp （圖1B）。用5′ RACE特異引物進(jìn)行5′端序列擴(kuò)增，獲得約500 bp的5′端序列，測(cè)序結(jié)果表明5′端為477 bp。

將中間片段、3′端和5′端序列進(jìn)行拼接，得到一條長(zhǎng)度為1 092 bp的cDNA片段。該基因含828 bp的CDS序列，編碼276個(gè)氨基酸。BLAST分析表明，該基因片段的核苷酸序列與煙草（Nicotiana tabacum）（XM_016619089.1）、茜草（Rubia cordifolia）（HM807270.1）、花生二倍體雜生種（Arachis ipaensis）（XM_016328124.1）和潘那利番茄（Solanum pennellii）（XM_015208577.1）等植物的相似性為77%、77%、76%和76%；編碼的氨基酸序列與荔枝（Litchi chinensis）、克萊門柚（Citrus clementina）和胡楊（Populus euphratica）的相似性分別為89%、87%和86%，與白梨（Pyrus bretschneideri）、蘋果（Malus domestica）、巨桉（Eucalyptus grandis）的相似性均為84%，與葡萄（Vitis vinifera）和梅花（Prunus mume）的相似性均為83%，與碧桃（Prunus persica）的相似性為82%（圖2）。這表明克隆到的片段為石榴果皮POD基因，GenBank登錄號(hào)為KY129694。

2.2保守結(jié)構(gòu)域分析

CDD分析表明，石榴POD蛋白具有過(guò)氧化物酶完整的保守結(jié)構(gòu)域，包括血紅結(jié)合位點(diǎn)、活性位點(diǎn)、底物結(jié)合位點(diǎn)、鈣離子結(jié)合位點(diǎn)（圖3）。還含有兩個(gè)保守功能域Cd00693（secretory peroxidase，分泌性過(guò)氧化物酶）和 Cl00196（plant-peroxidase-like superfamily，植物過(guò)氧化物酶超家族）。進(jìn)一步證明所獲得基因是石榴的過(guò)氧化物酶基因。

2.3蛋白理化性質(zhì)分析

ProtParam分析表明，石榴POD編碼蛋白的分子質(zhì)量為30 582.59 D，等電點(diǎn)（pI）為8.83，分子式為C1334H2120N390O411S12；負(fù)電荷氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）為28，正電荷氨基酸殘基總數(shù)（Arg+Lys）為33，不穩(wěn)定系數(shù)為41.19，是一類不穩(wěn)定蛋白，脂溶性指數(shù)為79.17，親水性平均數(shù)為-0.389。

ProtScale分析表明，POD蛋白存在明顯的疏水區(qū)和親水區(qū)，其中第133位最高，為2.122，第44位最低，為-2.733，為親水性蛋白（圖4）。

2.4二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析

利用SOPMA 軟件預(yù)測(cè)石榴POD編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)表明，有104個(gè)氨基酸參與形成α-螺旋（alpha helix），占總氨基酸的37.68%；有106個(gè)氨基酸參與形成無(wú)規(guī)則卷曲（random coil），占總氨基酸的38.41%；有38個(gè)氨基酸參與形成延伸鏈（extended strand），占總氨基酸的13.77%；有28個(gè)氨基酸參與形成β-轉(zhuǎn)角（beta turn），占總氨基酸的10.14%（圖5）。這說(shuō)明，石榴POD基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有豐富的α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲。

3討論與結(jié)論

POD是一種由單一肽鏈與卟啉構(gòu)成的血紅素蛋白，大約由300個(gè)氨基酸殘基組成，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)[14]。本研究利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆得到石榴果皮POD基因cDNA片段，含828 bp的CDS序列，編碼276個(gè)氨基酸，但未獲得POD基因全長(zhǎng)，這主要是由于石榴果皮富含酚類、鞣質(zhì)、糖酸等物質(zhì)，RNA純度低及部分序列發(fā)生降解使獲得的5′端序列不完整。下一步將改進(jìn)試驗(yàn)方案，提高RNA純度，降低RNA降解率，進(jìn)一步克隆得到POD基因全長(zhǎng)序列。

研究表明，POD分為三類，第Ⅰ類存在于線粒體、葉綠體及細(xì)菌中，第Ⅱ類存在于真菌中，第Ⅲ類是植物中典型的過(guò)氧化物酶，含有4個(gè)保守的二硫鍵和2個(gè)保守的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)[16]。本試驗(yàn)克隆的石榴POD蛋白具有過(guò)氧化物酶完整的保守結(jié)構(gòu)域，屬于植物血紅素依賴的過(guò)氧化物酶，是第Ⅲ類過(guò)氧化物酶的成員。石榴POD蛋白具有Cd00693和 Cl00196兩個(gè)保守功能域，是分泌過(guò)氧化物酶，這與鴨梨[15]和荔枝[16]上的研究結(jié)果一致。蛋白質(zhì)的功能在很大程度上取決于其空間結(jié)構(gòu)，本研究中，POD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，這為深入研究該酶的功能奠定了理論基礎(chǔ)。

前人對(duì)POD基因表達(dá)與荔枝果皮褐變間的關(guān)系[7，17]進(jìn)行了探索，但石榴果皮褐變與POD基因表達(dá)的關(guān)系尚不可知。因此，筆者在獲得石榴果皮POD基因cDNA序列的基礎(chǔ)上，下一步將重點(diǎn)探討不同石榴品種果實(shí)發(fā)育期果皮褐變與POD基因表達(dá)的關(guān)系，擬從分子水平揭示石榴果皮褐變機(jī)理。

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