陳美一 邵茵 馬利國

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占女性惡性腫瘤的第2位，僅次于乳腺癌。在我國，每年約有13萬新發(fā)病例，約占世界宮頸癌新發(fā)病例總數(shù)的28%[1]，且宮頸癌發(fā)病逐漸趨于年輕化。目前針對(duì)年輕的宮頸癌患者，在標(biāo)準(zhǔn)的手術(shù)治療之后通常進(jìn)行術(shù)后放療。這種治療策略，雖然能夠提高治愈率，但放療會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷卵巢組織。卵巢是女性重要的生殖和內(nèi)分泌器官，能夠產(chǎn)生性激素及生成卵子，在調(diào)節(jié)激素代謝和內(nèi)分泌中發(fā)揮重要作用。年輕女性失去卵巢功能，不僅會(huì)因性激素分泌下降出現(xiàn)圍絕經(jīng)期癥狀，且會(huì)影響全身脂肪、鈣和磷代謝，導(dǎo)致心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及基礎(chǔ)代謝的異常[2]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。因此，在進(jìn)行放療前行手術(shù)將卵巢取出后進(jìn)行冷凍保存，待放療結(jié)束后選擇適當(dāng)時(shí)機(jī)進(jìn)行卵巢組織自體移植術(shù)，對(duì)保存和恢復(fù)患者的卵巢功能有很大的臨床價(jià)值。本研究通過觀察冷凍卵巢組織自體移植于患者前臂后對(duì)卵巢內(nèi)分泌功能的影響，探討冷凍保存卵巢組織移植術(shù)恢復(fù)卵巢內(nèi)分泌功能的可行性，為人類卵巢組織冷凍移植研究提供依據(jù)。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象：8例卵巢組織標(biāo)本取自年輕宮頸癌患者手術(shù)切除的正常卵巢組織?；颊吣挲g28～42歲，均未絕經(jīng)。臨床分期：Ⅰ b1期2例，Ⅰ b2期4例，Ⅱ a2期2例。病理診斷：1例Ⅱ a2期為宮頸腺癌，其他7例均為宮頸非角化型鱗狀細(xì)胞癌。手術(shù)方式：患者均行經(jīng)腹或腹腔鏡下廣泛全子宮切除術(shù)+單側(cè)卵巢懸吊術(shù)+單側(cè)卵巢組織凍存。術(shù)后病理結(jié)果報(bào)8例患者病變均累及宮頸深肌層，其中1例累及宮頸全層，2例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，全部病例術(shù)后僅接受放射治療。8例患者隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組(3例)和凍存卵巢組織移植組(5例)。實(shí)驗(yàn)獲得深圳市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，所有患者均簽署知情同意書。

2.主要試劑及儀器設(shè)備：二甲基亞砜(DMSO)、人白蛋白(HSA)、蔗糖購自Sigma公司，TCM-199培養(yǎng)基購自Hyclone公司。CL-8800冷凍儀，澳大利亞Cryologic公司。Beckman Coulter UniCel DxI 800化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)。

3.慢速冷凍方法冷凍和解凍卵巢組織：將卵巢組織迅速置于預(yù)冷的TCM-199培養(yǎng)基中，置于冰壺內(nèi)，在離體30分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室。在無菌超凈工作臺(tái)內(nèi)，用含青、鏈霉素的TCM-199培養(yǎng)基反復(fù)清洗2、3次，除去壞死組織及血跡。在×10體視顯微鏡下，用眼科鑷、眼科剪去卵巢髓質(zhì)，僅留下卵巢皮質(zhì)，切割為1.0 cm×1.0 cm×1.0 mm大小的組織塊。將卵巢組織塊放入盛有1 ml冷凍液(含1.5 mol/L DMSO+0.1 mol/L蔗糖+5% HSA的TCM-199培養(yǎng)基)的凍存管中，4 ℃平衡30 min后放入程序冷凍儀中，從4 ℃開始以2 ℃/min的速度降至-7 ℃，滲透10 min后植冰，持續(xù)10 min，然后以0.3 ℃/min速度降至-40 ℃，再以10 ℃/min速度降至-140 ℃，保持10 min，投入液氮并放入液氮罐保存。每例患者保存卵巢組織片10片。

解凍時(shí)取出凍存管，空氣中停留30 s后置于37 ℃水浴2～3 min，將卵巢組織置于含1.0 mol/L DMSO+0.1 mol/L蔗糖+1% HSA的TCM-199培養(yǎng)基中5 min，然后按濃度梯度依次洗脫冷凍保護(hù)劑：0.5 mol/L DMSO+0.1 mol/L蔗糖、0.25 mol/L DMSO+0.1 mol/L蔗糖和0.1 mol/L蔗糖各停留5 min。

4.凍存卵巢組織自體移植手術(shù)：移植組在完成放療半年，除外病變復(fù)發(fā)后，將5～6片卵巢皮質(zhì)組織扇形展開平鋪包埋于血管較豐富的前臂肱橈肌筋膜下，縫合筋膜及皮膚。

5.性激素測(cè)定：采用Beckman Coulter UniCel DxI 800化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)進(jìn)行性激素的測(cè)定。對(duì)照組為完成放射治療后半年為時(shí)間起點(diǎn)，在此后的1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月及12個(gè)月進(jìn)行檢測(cè)；卵巢凍存移植組在完成放射治療后半年進(jìn)行卵巢凍存組織移植，移植術(shù)后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月及12個(gè)月分別進(jìn)行性激素及卵巢移植部位彩超檢查。

結(jié)果

1.卵巢內(nèi)分泌激素水平：對(duì)照組3例在術(shù)后的放療及隨訪過程中均出現(xiàn)不同程度的圍絕經(jīng)期癥狀和卵巢內(nèi)分泌功能異常。在術(shù)后3個(gè)月時(shí)E2分泌水平顯著降低，F(xiàn)SH和LH也呈現(xiàn)高值水平，隨訪1年期間激素水平無改善。其中1例患者術(shù)后9個(gè)月出現(xiàn)E2明顯下降<20 pg/ml，F(xiàn)SH顯著升高>40 U/L，LH顯著升高>50 U/L，提示其卵巢功能衰竭(表1)。凍存卵巢組織移植5例在放療結(jié)束后行前臂凍存卵巢組織自體移植術(shù)，在移植后6個(gè)月后出現(xiàn)了卵巢內(nèi)分泌功能的逐漸恢復(fù)。其中3例術(shù)后9個(gè)月E2分泌水平恢復(fù)正常，F(xiàn)SH和LH分泌量顯著降低，但1例術(shù)后1年失隨訪(表2)。

表1 對(duì)照組患者術(shù)前、術(shù)后性激素水平情況

表2 凍存卵巢組織自體移植術(shù)患者術(shù)前、術(shù)后性激素水平情況

2.移植部位卵巢超聲結(jié)果：凍存卵巢組織移植5例患者術(shù)后1個(gè)月移植部位卵巢大小、形態(tài)正常，內(nèi)部有少量及點(diǎn)狀血流信號(hào)。術(shù)后6個(gè)月，移植部位卵巢內(nèi)部可見血流信號(hào)和小卵泡發(fā)育，但是卵巢組織體積較前均出現(xiàn)縮小，其中2例縮小明顯(表3)。

表3 凍存卵巢組織移植術(shù)后移植部位超聲檢查結(jié)果

討論

隨著宮頸癌篩查體系的逐步完善及診治水平的不斷提高，宮頸癌患者5年生存率已顯著提高。臨床上，針對(duì)年輕的宮頸癌患者，通常在標(biāo)準(zhǔn)的手術(shù)治療之后行輔助性放療和(或)化療。放化療在極大程度緩解癌癥病情的基礎(chǔ)上，卻對(duì)卵巢組織造成了嚴(yán)重的不可逆轉(zhuǎn)的損傷，導(dǎo)致卵巢早衰，使得年輕女性患者在獲得長期存活的同時(shí)，也失去了卵巢內(nèi)分泌功能及生育能力。近年來，隨著冷凍保存技術(shù)、血管吻合技術(shù)和輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，凍存卵巢組織移植技術(shù)已成為解決年輕宮頸癌患者卵巢早衰、保存和恢復(fù)生殖內(nèi)分泌功能的有效選擇[3]。目前凍存卵巢組織的移植主要包括異位移植和原位移植兩種。異位移植是將卵巢的皮質(zhì)片移植到皮下，例如前臂和腹壁。原位移植通常是將卵巢的皮質(zhì)片移植到保留的卵巢、卵巢韌帶或是卵巢窩附近[4-5]。Okaty等[6]為1例35歲III B期宮頸癌患者行前臂皮下凍存卵巢移植，術(shù)后18個(gè)月每個(gè)月都有優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育，并經(jīng)皮吸收能夠獲得成熟的卵母細(xì)胞。Radwan等[7]報(bào)道一位28歲宮頸浸潤性腺癌患者行廣泛子宮切除術(shù)，并將每個(gè)卵巢切取一半進(jìn)行冷凍保存。在術(shù)后行輔助性放療，患者出現(xiàn)典型的圍絕經(jīng)期癥狀，E2分泌量為2 pg/ml，F(xiàn)SH分泌量為96.25 U/ml，LH分泌量為37.55 U/ml。隨后將凍融的卵巢組織自體移植到前腹壁，9周后卵巢內(nèi)分泌功能開始逐漸恢復(fù)，24周后卵巢內(nèi)分泌功能恢復(fù)到正常水平。多個(gè)團(tuán)隊(duì)也報(bào)道了凍存卵巢組織自體移植后可恢復(fù)和維持卵巢功能，能夠獲得成熟卵母細(xì)胞，并成功生產(chǎn)新生兒[8-11]。

目前卵巢組織冷凍技術(shù)可根據(jù)凍存速度的不同分為快速凍存和慢速凍存兩種。慢速凍存，即程序化法(conventional freezing)，需要通過程序冷凍儀實(shí)現(xiàn)逐步地、程序化地降溫直至進(jìn)入液氮。快速凍存，即玻璃化法(vitrification)，是一種把卵巢組織直接投入液氮的方法，它利用高濃度的冷凍保護(hù)劑所產(chǎn)生的玻璃態(tài)或無定形態(tài)在冷凍過程中可避免冰晶形成。這兩種方法均可用于卵巢組織的冷凍保存，慢速凍存作為一種常規(guī)方法被普遍采用，保存效果穩(wěn)定。玻璃化凍存是一個(gè)新的、不成熟的技術(shù),也是當(dāng)前的一個(gè)研究熱點(diǎn)，但其對(duì)冷凍保護(hù)劑的要求高，目前沒有統(tǒng)一的操作規(guī)程，而且存在解凍后的卵巢組織被液氮中微生物污染的潛在危險(xiǎn)，安全性不如慢速法。在冷凍保護(hù)劑選擇方面，二甲基亞砜和丙二醇被認(rèn)為是冷凍卵巢組織效果最好的[12]。

本研究中8例宮頸癌患者行廣泛全子宮切除術(shù)后均需行輔助性放療，在手術(shù)同時(shí)行單側(cè)卵巢懸吊術(shù)和單側(cè)卵巢組織凍存。其中3例患者未進(jìn)行卵巢組織移植，在術(shù)后3個(gè)月E2分泌水平顯著降低，F(xiàn)SH和LH也呈現(xiàn)高值水平。其中1例患者術(shù)后9個(gè)月出現(xiàn)E2明顯下降<20 pg/ml，F(xiàn)SH顯著升高>40 U/ml，LH顯著升高>50 U/L，提示其卵巢功能衰竭；另外2例患者在隨訪1年內(nèi)卵巢內(nèi)分泌功能逐漸降低，提示其卵巢功能受損。卵巢對(duì)放射性即為敏感，育齡期婦女盆腔放射劑量為單次4Gy或10天內(nèi)照射總劑量15Gy，絕經(jīng)前婦女5～10Gy便可導(dǎo)致卵巢功能受損甚至衰竭[13]。Toman等[14]測(cè)量了不同位點(diǎn)的卵巢接受盆腔外照射時(shí)射線劑量及對(duì)其功能的損傷程度的關(guān)系，指出只有放射野邊緣2.5 cm以外的區(qū)域是相對(duì)安全區(qū)域，建議至少將卵巢移植于髂前上棘之上3.5 cm。但也有報(bào)道指出由于放射線的散射作用，約有總劑量的5%可散射到放射野外4 cm范圍內(nèi)[15]。本研究中3例行單側(cè)卵巢懸吊術(shù)的患者將卵巢移植于髂前上棘之上3～3.5 cm皮下，在術(shù)后隨訪過程中均出現(xiàn)了不同程度的性激素釋放異常和圍絕經(jīng)期癥狀，提示單純的卵巢懸吊術(shù)式雖然能夠保留卵巢功能，但仍不能完全避免放療對(duì)卵巢組織的損傷，仍有一定的概率出現(xiàn)卵巢早衰。

本研究中另外5例患者在放療結(jié)束后選擇適當(dāng)時(shí)機(jī)行凍存卵巢組織前臂自體移植術(shù)。在移植后6個(gè)月出現(xiàn)了卵巢內(nèi)分泌功能的恢復(fù)，其中2例患者術(shù)后1年與未行卵巢移植的對(duì)照組性激素釋放水平相當(dāng)，并未恢復(fù)正常水平。另外3例患者術(shù)后9個(gè)月E2分泌水平恢復(fù)正常，F(xiàn)SH和LH分泌量顯著降低；更有1例28歲的年輕患者在術(shù)后9個(gè)月性激素的釋放恢復(fù)到與廣泛全子宮清除術(shù)前相當(dāng)?shù)乃剑堰B續(xù)出現(xiàn)2次雌激素的明顯升高，但1年后失隨訪。5例患者移植術(shù)后1個(gè)月移植部位卵巢大小、形態(tài)正常，內(nèi)部有少量及點(diǎn)狀血流信號(hào)。術(shù)后6個(gè)月，移植部位卵巢內(nèi)部可見血流信號(hào)和小卵泡發(fā)育，但是卵巢組織體積較前均出現(xiàn)縮小，其中2例患者縮小明顯。卵巢組織凍存移植后功能的恢復(fù)已經(jīng)得到國內(nèi)外研究的廣泛證實(shí)，但是長期維持是目前此項(xiàng)技術(shù)研究的難點(diǎn)和焦點(diǎn)。目前關(guān)于移植后卵巢功能維持時(shí)間的長短報(bào)道不一，且多為個(gè)例報(bào)道。Baird等[16-17]對(duì)羊凍存卵巢組織移植后卵泡存活和發(fā)育情況進(jìn)行長期觀察發(fā)現(xiàn)，卵巢內(nèi)分泌功能維持了近1年。Oktay等[18]將卵巢組織移植到前臂皮下，2例患者卵巢功能分別維持了21個(gè)月和超過2年。本研究雖然樣本量較小，但是仍為需術(shù)后放療的年輕宮頸癌患者卵巢移植術(shù)式的選擇提供了依據(jù)。在提高生存率的同時(shí)，行單側(cè)卵巢懸吊術(shù)合并單側(cè)卵巢冷凍保存，待輔助性放療結(jié)束后選擇適當(dāng)時(shí)機(jī)行凍存卵巢組織自體移植術(shù)，能夠最大限度地保留卵巢正常功能，提高患者術(shù)后生活質(zhì)量。

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