霍天龍，楊碩，孫燕萍，潘峰，胡立寶，康鈺，趙赟赟

北京大學(xué)人民醫(yī)院 放射科，北京100044

腫瘤特異性成像中固相萃取對(duì)Gd-DOTAOCT小分子探針構(gòu)建的影響

霍天龍，楊碩，孫燕萍，潘峰，胡立寶，康鈺，趙赟赟

北京大學(xué)人民醫(yī)院 放射科，北京100044

目的探討“一步法”構(gòu)建Gd-DOTA-OCT小分子MR探針，并用固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）對(duì)其進(jìn)行分離。方法采用商品化DOTA-OCT直接用GdCl3螯合，并用SPE進(jìn)行分離和提純，對(duì)分子探針進(jìn)行紫外分光光度檢測(cè)、質(zhì)譜檢測(cè)和MR信號(hào)檢測(cè)。結(jié)果“一步法”可以成功合成Gd-DOTA-OCT，并用SPE進(jìn)行成功分離，經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)與理論分子量相同，紫外分光光度法檢測(cè)探針和MR信號(hào)檢測(cè)證明分子探針完整。結(jié)論Gd-DOTA-OCT小分子探針可以用一步法成功構(gòu)建，并可用SPE方便地進(jìn)行分離和純化，為腫瘤特異性成像奠定基礎(chǔ)。

分子成像；分子探針；固相萃??；質(zhì)譜檢測(cè)；Gd-DOTA-OCT；MR信號(hào)檢測(cè)

分子影像學(xué)是多種影像技術(shù)交叉和多種學(xué)科融合的前沿學(xué)科，它針對(duì)發(fā)生病變的細(xì)胞或分子進(jìn)行成像，目前已迅速成為最具魅力和活力的影像領(lǐng)域，有望在多種疾病的早期診斷，尤其是癌癥和神經(jīng)退行性疾病的早期診斷方面發(fā)揮巨大作用[1]。在多種成像方式中，MR因其兼具有組織分辨力高和相對(duì)敏感的特點(diǎn)而成為分子影像研究和突破的熱點(diǎn)。

分子成像的關(guān)鍵是分子探針構(gòu)建。分子探針的構(gòu)建基礎(chǔ)是特異性分子的選擇，即針對(duì)發(fā)生病變的靶組織和靶分子設(shè)計(jì)特異性探針。圍繞特異性分子，在雙功能連接劑存在或特異性分子直接與成像核耦合，即可構(gòu)建特異性分子探針。

構(gòu)建簡(jiǎn)單、性質(zhì)穩(wěn)定的分子探針是獲得最佳成像效果的重要前提，本研究遵循分子探針構(gòu)建模式，選擇奧曲肽（Octreotide，OCT）作為特異性分子，與穴窩狀的雙功能連接劑 DOTA（四氮雜環(huán)十二烷）進(jìn)行偶聯(lián)后，用GdCl3標(biāo)記，通過(guò)SPE分離標(biāo)記物，可得到MR分子探針，為下一步成像奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 探針合成

準(zhǔn)備商品化的DOTA-OCT（分子量1422，上海默息生物），每次將5 μmol DOTA-OCT溶于10 mL 0.2 mol Tris-HCl（pH 6～7）緩沖液中，將上述液體加熱（水浴 60℃）10 min；取分析純過(guò)量GdCl3（北京國(guó)藥）10 μmol以上，加入溶液中，室溫靜置120 min，待螯合完全后進(jìn)行分離。

1.2 探針?lè)蛛x

采用固相萃?。⊿olid Phase Extract，SPE）方法進(jìn)行探針?lè)蛛x。Sep Pak C-18固相萃取小柱（Waters，USA），上樣容積6 mL。上樣前活化，用5 mL 無(wú)水乙醇（北京國(guó)藥集團(tuán)，分析純）、5 mL生理鹽水和5 mL空氣依次過(guò)柱，反應(yīng)混合物上柱前經(jīng)過(guò)Na2HPO4沉淀，超速離心去沉淀后將上清液上柱，用1.5 mL Ep管收集液體，每管1 mL，用負(fù)壓抽吸泵調(diào)（圖1）至流速1 mL/s；然后用5 mL生理鹽水對(duì)小柱進(jìn)行淋洗，每管收集1 mL；最后用80%無(wú)水乙醇（無(wú)水乙醇加雙蒸水稀釋?zhuān)┫疵撔≈?，每? mL收集洗脫液體，保持流速1 mL/s。各管進(jìn)行編號(hào)以備檢測(cè)。

圖1 固相萃取負(fù)壓抽吸裝置

1.3 繪制分子探針洗脫曲線(xiàn)

使用紫外分光光度法檢測(cè)各組分。將SPE過(guò)柱后各組分分別用紫外分光光度計(jì)（TU-1901）檢測(cè)，用260 nm進(jìn)行光度掃描，測(cè)量3次，取平均值。利用各組分A260 nm數(shù)據(jù)繪制分子探針洗脫曲線(xiàn)。

1.4 質(zhì)譜檢測(cè)

將商品化DOTA-OCT 100 μg（理論分子量 1422），加蒸餾水200 μL溶解，取100 μL進(jìn)行MAITI-TOF檢測(cè)。再取100 μL分離后分子探針，進(jìn)行MAITI-TOF檢測(cè)。質(zhì)譜檢測(cè)由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部中心實(shí)驗(yàn)室有機(jī)質(zhì)譜室完成。

1.5 MR 信號(hào)檢測(cè)

將SPE后各組分在1.5 mL Ep管內(nèi)進(jìn)行MR（MR750w，GE 公司）信號(hào)檢測(cè)，樣本固定在Ep管專(zhuān)用塑料管架中，各組分按照收集順序擺放，圖2。采用膝關(guān)節(jié)線(xiàn)圈掃描，掃描參數(shù)：常規(guī)T1WI和T2WI掃描，F(xiàn)OV 24 cm，層厚2 mm，間距0.2 mm。

圖2 分子探針各組分MR信號(hào)檢測(cè)擺放草圖

2 結(jié)果

2.1 探針構(gòu)建

按照標(biāo)準(zhǔn)步驟，用“一步法”可以簡(jiǎn)便、穩(wěn)定和可重復(fù)性地合成Gd-DOTA-OCT。

2.2 探針紫外檢測(cè)結(jié)果

用260 nm檢測(cè)分組分紫外分光光度值，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 各組分紫外分光光度檢測(cè)結(jié)果條形圖

2.3 探針質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果

商品化的 DOTA-OCT理論分子量為1422，預(yù)先檢測(cè)DOTA-OCT完整性，用MOLTI-TOF實(shí)際檢測(cè)為分子量1421（圖4A），證明DOTA-OCT完整。Gd原子量為157，Gd-DOTA-OCT理論分子量為1579，經(jīng)MOLTI-TOF質(zhì)譜檢測(cè)，Gd-DOTA-OCT 實(shí)際分子量最高頻度值為1576，與理論分子量符合（圖4B）。

2.4 MR信號(hào)檢測(cè)

MR掃描顯示，各組分各管的MR信號(hào)表明，洗脫組分含有較多的Gd組分，見(jiàn)圖5。

參照擺放草圖，從左到右為分別為上樣組分、鹽洗組分和洗脫組分，從上到下為樣本編分別為1～5，1～10，1～15。從圖可以看出，上樣組分MR信號(hào)較高，提示含有較高濃度的；鹽洗組分開(kāi)始MR信號(hào)較高，第10管信號(hào)減低很明顯，提示Gd成分明顯減少；洗脫組分MR信號(hào)又開(kāi)始增高，提示Gd成分再次增多，增高趨勢(shì)和紫外分光光度結(jié)果一致（檢測(cè)OCT成分），說(shuō)明洗脫組分既含有較高濃度Gd，又含有較高濃度OCT，因此再次證明洗脫組分含有Gd-DOTA-OCT 分子探針。

圖4 質(zhì)譜檢測(cè)圖

圖5 SPE后各組分MRT1W掃描圖像

3 討論

3.1 Gd-DOTA-OCT分子探針構(gòu)建策略

分子探針的構(gòu)建是分子成像的關(guān)鍵和前提條件。根據(jù)Gd3+化學(xué)性質(zhì)，采用化學(xué)選擇性策略，將雙功能螯合劑DOTA的一端和針對(duì)SSTR的特異性分子OCT進(jìn)行偶聯(lián)，然后用Gd3+螯合標(biāo)記，可形成穩(wěn)定的Gd-DOTA-OCT螯合物，即特異性MR分子探針。理論上，用于成像的Gd具有MR成像能力，而且金屬離子不直接與特異性分子相連，不改變其分子結(jié)構(gòu)，不會(huì)影響特異性分子與相應(yīng)受體的結(jié)合。

3.2 Gd-DOTA-OCT MR 探針信號(hào)檢測(cè)

對(duì)分子探針進(jìn)行體外 MR 信號(hào)測(cè)量是驗(yàn)證探針是否有效的必要措施。本研究對(duì)純化的分子探針進(jìn)行了檢測(cè)。體外信號(hào)的強(qiáng)弱可以推測(cè)體內(nèi)成像效果。小分子容易通過(guò)體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)屏障到達(dá)靶組織，因此，在構(gòu)建分子探針時(shí)，小分子要比大分子更優(yōu)越。Gd類(lèi)探針?lè)肿恿枯^小，有利于體內(nèi)尋靶。

探針是否能夠產(chǎn)生可見(jiàn)的MR信號(hào)是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。MR信號(hào)強(qiáng)弱與Gd含量相關(guān)。本研究中，上樣組分的的MR信號(hào)稍高，說(shuō)明含有Gd3+成分。游離的Gd3+不被C-18柱保留，因此上樣組分中游離Gd3+含量的多少直接與反應(yīng)后未螯合Gd3+含量的多少相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)前GdCl3過(guò)量不多，混合物游離Gd3+成分較少，因此上樣組分MR信號(hào)增高不明顯。鹽洗組分游離Gd3+含量極微，MR信號(hào)不高。從上樣到鹽洗，各樣本信號(hào)變化不大。80%乙醇洗脫組分MR信號(hào)明顯變化，原液的信號(hào)極低（尤其是第1和第2洗脫管），而1:50的稀釋液信號(hào)非常高。根據(jù)前期馬根維顯稀釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明Gd成分非常多-與上樣組分和鹽洗組分不同的是，這些Gd成分不再是游離的Gd3+，而是螯合態(tài)的Gd，即Gd-DTPA-OCT。因此，通過(guò)SPE分離后MR信號(hào)的檢測(cè)，證明80%乙醇洗脫組分內(nèi)含有大量分子探針。

3.3 Gd3+的安全性和應(yīng)對(duì)策略

與螯合狀態(tài)的金屬離子不同，游離的Gd3+有毒，如何減低或避免游離Gd3+產(chǎn)生關(guān)系到分子探針在體內(nèi)是否安全。Gd類(lèi)對(duì)比劑作為非特異性細(xì)胞外對(duì)比劑，已廣泛應(yīng)用于臨床。但近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，某些Gd類(lèi)對(duì)比劑可導(dǎo)致腎源性系統(tǒng)纖維化/腎源性皮膚硬化癥（NSF/NSD）[2-3]。通常認(rèn)為當(dāng)腎功能不全時(shí)，對(duì)比劑排泄緩慢，加上酸中毒，離子交換，使Gd3+大量解離，沉積在組織間隙內(nèi)，引起組織廣泛纖維化。螯合劑，即linker的選擇非常重要。螯合劑一方面穩(wěn)定螯合金屬離子，減輕毒性，另一方面避免金屬離子直接與特異性多肽相連，以免影響多肽生理活性?，F(xiàn)階段常用的螯合劑中，DOPA是個(gè)穴窩狀化合物，DOTA 作為一種環(huán)形配體較DTPA等線(xiàn)性配體螯合穩(wěn)定常數(shù)更大，它的螯合物最穩(wěn)定，因而使螯合的Gd不易解離。有關(guān)對(duì)比劑使用的臨床大量統(tǒng)計(jì)資料表明，在常用的8種Gd類(lèi)對(duì)比劑中，以DOTA作為螯合劑的對(duì)比劑，目前還沒(méi)有收到NSF相關(guān)報(bào)告[4]。因此，DOTA等環(huán)狀雙功能螯合劑是目前構(gòu)建分子探針的最佳選擇。即便如此，在合成分子探針時(shí)應(yīng)采取以下措施增加分子探針安全性：① 在合成螯合物時(shí)，Gd3+是過(guò)量的，這樣有利于充分螯合，但Gd3+不能過(guò)量太多；② 分離純化時(shí)，一定要充分洗脫游離的Gd3+。

3.4 特異性分子的選擇-生長(zhǎng)抑素受體

特異性分子的選擇也是研究重點(diǎn)，本研究選用小分子多肽，因?yàn)樾》肿佣嚯淖鳛樘禺愋苑肿?，沒(méi)有抗原性，制備相對(duì)簡(jiǎn)單，成本較低，形成的復(fù)合物分子較小，目標(biāo)-本底信號(hào)比 值高，代謝快，顯像時(shí)間相對(duì)短，是構(gòu)建探針的理想選擇。生長(zhǎng)抑素是一種存在于人腦、下丘腦、胃腸、胰腺等部位內(nèi)分泌細(xì)胞中的活性多肽，具有廣泛的生理作用，能抑制生長(zhǎng)激素、消化道激素等激素的分泌，抑制胰腺和胃的外分泌，作為 中樞神經(jīng)內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)，還可調(diào)節(jié)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的分化增殖，具有抗增殖作用。生長(zhǎng)抑素在體內(nèi)是通過(guò)與生長(zhǎng)抑素受體（Somatostatin Receptor，SSTR）結(jié)合而發(fā)揮生理功能的。生長(zhǎng)抑素受體有五種亞型（subtype），分別稱(chēng)為SSTR1-5。正常情況下，SSTR表達(dá)很少。與正常組織相比，腫瘤組織SSTR表達(dá)顯著增多。大多數(shù)腫瘤如肝細(xì)胞癌主要表達(dá)SSTR2或SSTR5亞型[5]。

天然的生長(zhǎng)抑素與所有五種亞型都具有很高的親和力，但在體內(nèi)受肽酶的作用，半衰期過(guò)短（1～3 min）[6]，制約了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。OCT是一種人工合成的、由8個(gè)氨基酸組成的活性多肽，是生長(zhǎng)抑素的擬似物，它不但保留了天然生長(zhǎng)抑 素的藥理學(xué)活性，而且特異性更高，作用更強(qiáng)。與天然生長(zhǎng)抑素不同，人工合成的生長(zhǎng)抑素?cái)M似物OCT與不同的亞型有不同的結(jié)合活性[7]。OCT與SSTR2和SSTR5有很高的親和力，與SSTR3的親和力較低，并且不與SSTR1和SSTR4結(jié)合[8]。

因此，利用OCT可以設(shè)計(jì)分子探針對(duì)高表達(dá)SSTR2的腫瘤進(jìn)行特異性顯像。

3.5 SPE 在分子探針質(zhì)量控制中的作用

分離純化是保證實(shí)驗(yàn)有效的關(guān)鍵之一。文獻(xiàn)中多采用HPLC和SPE進(jìn)行分離純化[9-14]。HPLC可以分離純化出純度很高的分子探針，帶有紫外檢測(cè)器，可以檢測(cè)組分的分離情況。SPE是一種在制藥領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的樣品前處理技術(shù)，它的基本原理和HPLC相同，就是利用各組分對(duì)固相支持物的結(jié)合力大小，對(duì)溶解在液相中的物質(zhì)進(jìn)行分離。其基本組成和HPLC一樣，是用C-18或25填料的柱芯，配以輔助裝置，如加壓器或負(fù)壓泵等，即可完成分離工作。多肽因含有疏水側(cè)鏈，因此在液體流過(guò)柱芯時(shí)，可以暫時(shí)保留在柱子上，而其他無(wú)機(jī)離子、小分子等不能或幾乎很少保留，則被淋洗下來(lái)?？梢杂脴O性弱一些的溶劑對(duì)保留有多肽的小柱進(jìn)行洗脫，收集洗脫物，就可以得到想要的分子探針。紫外分光光光度法是一種常用的測(cè)量溶液中具有特定吸光度物質(zhì)的方法。測(cè)量吸光度之前，可以對(duì)溶液進(jìn)行光譜掃描，根據(jù)吸收曲線(xiàn)可以判斷吸收峰的數(shù)目、位置、相對(duì)強(qiáng)度以及吸收峰的。常見(jiàn)的物質(zhì)是多肽和蛋白等大分子物質(zhì)，因其內(nèi)部還有共軛雙鍵，可以吸收一定波長(zhǎng)的紫外線(xiàn)[15-16]。根據(jù)朗伯-比爾定律就可以估算出溶液中待測(cè)物質(zhì)的含量。紫外檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、迅速、不需要復(fù)雜和昂貴的設(shè)備，不消耗樣品，測(cè)定后仍能回收使用，低濃度的鹽和大多數(shù)緩沖溶液不干擾測(cè)定。缺點(diǎn)：準(zhǔn)確度和靈敏度差一點(diǎn)。干擾物質(zhì)多，樣品中含有其他吸收紫外基團(tuán)時(shí)，結(jié)果不太準(zhǔn)確。但是可以通過(guò)嚴(yán)格的控制減少干擾。多肽和蛋白在260 nm和280 nm也有相應(yīng)的較強(qiáng)吸收，而且在這一范圍內(nèi)，小分子鹽類(lèi)和有機(jī)物，如甲醇、乙醇、乙腈等干擾很小，所以測(cè)量結(jié)果更準(zhǔn)確。一般來(lái)說(shuō)，紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃 度范圍為0.1～1.0 mg/mL，在這一濃度范圍內(nèi)，濃度與吸光度具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，測(cè)量結(jié)果比較準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的分子探針的多肽濃度在這一范圍內(nèi)。采用光譜掃描的方法可以 對(duì)各組分進(jìn)行檢測(cè)，以確定是否含有多肽，就可以明確分子探針在什么組分內(nèi)。所以，SPE分離純化加上紫外分光光度檢測(cè)，是一個(gè)進(jìn)行質(zhì)量控制簡(jiǎn)便可行的方法。

4 結(jié)論

本文給出了一種簡(jiǎn)單、有效的MR分子構(gòu)建方法，并利用SPE法對(duì)構(gòu)建的多肽類(lèi)小分子探針構(gòu)建進(jìn)行質(zhì)量控制。分子探針質(zhì)量控制的關(guān)鍵是構(gòu)建過(guò)程簡(jiǎn)單和方法穩(wěn)定，分子探針構(gòu)建的核心是分子探針質(zhì)量控制，分子探針構(gòu)建是分子成像的前提。因此，本研究提供的方法可以為構(gòu)建其他分子探針進(jìn)行分子成像奠定基礎(chǔ)。

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Efficacy of Brain Tumor Specific Imaging Solid Phase Extraction in the Construction of Gd-DOTA-OCT Small Molecular Imaging Probe

HUO Tian-long, YANG Shuo, SUN Yan-ping, PAN Feng, HU Li-bao, KANG Yu, ZHAO Yun-yun
Department of Radiology, Peking University Poeple’s Hospital, Beijing 100044, China

ObjectiveTo discuss the effect of “one step method” on constructing Gd-Tetraazacyclododecane-Octreotide (Gd-DOTA-OCT) small molecular MR imaging probe by adopting Solid Phase Extraction （SPE）method to isolate it from the mixture.MethodsThe commercial DOTA-OCT was chelated with GdCl3 directly, and the mixture was isolated and purified with SPE method, then all the isolated fractions were underwent ultraviolet spectrophotometric detection, mass spectrometric detection and MR signal detection respectively.ResultsGd-DOTA-OCT was synthesized with “one step method” and isolated with SPE method successfully. The actual molecular weight of the probe detected by MALTI-TOF was consistent with the theoretic molecular weight, and the Gd-DOTA-OCT MR probe was intact after being verified by the ultraviolet spectrophotometric detection and MR signal detection.ConclusionGd-DOTA-OCT small molecular MR probe can be successfully constructed with “one step method” and can be isolated and purified with SPE method, which lays a foundation for brain tumor specific imaging.

molecular imaging; molecular probe; solid phase extraction; mass spectrometric detection; Gd-tetraazacyclododecane-octreotide; MR signal detection

TP333.3；R445.2

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2017.03.002

1674-1633(2017)03-0006-04

2017-01-13

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金新教師類(lèi)（2011000 1120083）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81372363）。

霍天龍，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)榉肿佑跋駥W(xué)。

通訊作者郵箱：huotianlong@bjmu.edu.cn