馬 龍，胡存利 ，桂士良，陳大印， 程 亮，杜從林， 曹會峰

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江 佳木斯 154003)

2型糖尿病大鼠陰莖組織GSH與iNOS相關(guān)性研究①

馬 龍，胡存利 ，桂士良，陳大印， 程 亮，杜從林， 曹會峰

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：探究2型糖尿病大鼠陰莖組織GSH及iNOS表達變化及其相關(guān)性。方法：30只SD健康雄性大鼠，隨機抽取20只大鼠作為糖尿病組(DM組)，高脂高糖飲食4周后腹腔小劑量注射鏈脲佐菌素建立2型糖尿病模型，剩余10只多為正常對照組(Control組)。繼續(xù)喂養(yǎng)4周后行APO試驗，測定陰莖海綿體內(nèi)壓；采集陰莖組織，測定GSH含量，用蛋白印跡法、免疫組織化學(xué)法檢測iNOS的表達及含量。結(jié)果：DM組大鼠勃起功能普遍降低；DM組大鼠陰莖組織中GSH含量明顯低于Control組(P<0.05)；蛋白印跡及免疫組織化學(xué)法檢測發(fā)現(xiàn)DM組大鼠陰莖組織中iNOS含量高于Control組(P<0.05)；Pearson相關(guān)分析顯示，GSH與iNOS表達水平呈負相關(guān)(r=-0.796,P<0.05)。結(jié)論：糖尿病大鼠陰莖組織中GSH含量下降，iNOS表達升高，并且兩者呈負相關(guān)，共同參與糖尿病陰莖勃起功能障礙的發(fā)病機制。

2型糖尿??；GSH；iNOS

勃起功能障礙(erectiledysfunction,ED)是糖尿病(diabetesmellitus,DM)的常見并發(fā)癥，并且隨著DM的病程延長而逐漸增加；據(jù)研究顯示，糖尿病性勃起功能障礙(diabetesmellituserectiledysfunction,DMED)的發(fā)病率高達57%，10年以上DM病史者，就有50%患者并發(fā)ED,但DMED的具體機制并未明確[1，2]。本研究建立2型糖尿病大鼠病理模型，檢測大鼠勃起功能變化，同時測定陰莖組織中的GSH和iNOS，探究二者在糖尿病發(fā)病過程中的變化、關(guān)系以及與DMED發(fā)病機制的聯(lián)系。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

鏈脲佐菌素(streptorotocin,STZ,Sigma公司)，阿撲嗎啡(apomorphine,APO,Sigma公司)，血糖儀及試紙(三諾生物技術(shù)傳感股份有限公司)，GSH檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，兔抗大鼠iNOSIgG(SantaCruzBiotechnology公司)，HRP標(biāo)記的鼠抗兔IgG(SantaCruzBiotechnology公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，bio-tek多功能酶標(biāo)儀(美國Biotek公司)，iNOS生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，Pclab-UE生物醫(yī)學(xué)信號采集系統(tǒng)。

1.2 實驗動物及糖尿病建模

8周齡健康SD雄性大鼠30只(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心)，體重(233±12)g。所有大鼠充足飲水，室溫(26±2)℃，濕度(60±5)%，半天光照，半天黑暗。高脂高糖飼料(配方：5%蔗糖+10%豬油+1.5%膽固醇，由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司配制)飲食喂養(yǎng)4周后小劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(40mg/kg)。注射3d后測血糖，未成模者半劑量追加給藥。以血糖大于16.7mmol/L為建模成功。

1.3APO實驗

暗室適應(yīng)10min，頸項部皮膚松軟處注射APO(濃度40μg/mL)，劑量100μg/kg，觀察30min內(nèi)大鼠陰莖勃起次數(shù)。以龜頭充血及陰莖體增長為勃起1次。每組陰莖勃起者所占百分比為該組陰莖勃起率。

1.4 海綿體內(nèi)壓測定

用10%的水合氯醛(0.35mL/100g)腹腔注射麻醉，仰臥固定在解剖板上。于大鼠下腹部做一正中切口，并小心剝離出陰莖海綿體神經(jīng)。游離坐骨海綿肌，暴露陰莖腳，用充滿肝素的頭皮針穿刺陰莖海綿體，測定海綿體內(nèi)壓。設(shè)置參數(shù)(刺激電壓5V，頻率15Hz，波幅5ms，持續(xù)時間50s)。

1.5 采集標(biāo)本并測定陰莖組織中GSH含量

大鼠處死后，采集陰莖組織，去掉龜頭、白膜，并用PBS液漂洗，去除組織中的血液，液氮下研磨陰莖組織后測定GSH含量。

1.6 蛋白印跡法測定陰莖組織中eNOS含量

陰莖組織稱重后，液氮下充分研磨。BCA法測定蛋白濃度。制備濃縮膠、分離膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗(1:500稀釋)孵育過夜，二抗(1：5000稀釋)孵育，顯色曝光，掃描膠片，結(jié)果以eNOS/β-actin進行分析。

1.7 免疫組化法定位定量測定陰莖組織中eNOS含量

陰莖組織固定，包埋，石蠟切片，行SP法組織染色，顯微鏡下觀察eNOS的表達分布。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

糖尿病組大鼠造模期間因低血糖死亡8只，對照組大鼠未有死亡。12只大鼠血糖持續(xù)大于16.7mmol/L，造模成功。成模后大鼠逐漸出現(xiàn)糖尿病典型的“三多一少”癥狀，隨著病情的進展，DM大鼠逐漸表現(xiàn)出毛色干枯萎黃、體重下降、反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象。

2.2 兩組大鼠體重、血糖、ICPmax/MAP和陰莖組織GSH水平的比較

實驗結(jié)果顯示，DM組大鼠的體重、血糖明顯高于Control組大鼠；DM組大鼠ICPmax/MAP值、GSH含量明顯低于Control組。

2.3 蛋白印跡、免疫組化測定陰莖組織中的iNOS

Westernblot法檢測陰莖組織iNOS顯示，DM組大鼠陰莖組織中iNOS表達較Control組增加(P<0.05)；免疫組織化學(xué)結(jié)果進一步顯示iNOS表達明顯升高，并主要表達于血管內(nèi)皮細胞，平滑肌組織細胞亦有表達。見圖1。

圖1 各組應(yīng)用Western blotting和免疫組化法分析陰莖組織中iNOS含量比較及其分布(×400)

2.4GSH含量與iNOS表達水平的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，DM組大鼠陰莖組織GSH含量顯著降低；而iNOS累計光密度值(2.13±0.15)明顯高于正常大鼠(1.68±0.25)(P<0.05)，且GSH含量與iNOS表達水平呈負相關(guān)(r= -0.796,P=0.02)。見圖2。

圖2 陰莖組織中GSH含量與iNOS表達水平相關(guān)性分析及散點圖(r= -0.796,P<0.05)

3 討論

近期流行病學(xué)調(diào)查顯示東南亞國家糖尿病的發(fā)病率為37.5%[3]，中國人群肥胖和糖尿病的發(fā)病率逐年增高，并且日趨年輕化，據(jù)統(tǒng)計80%的糖尿病伴有肥胖癥。

人體中一氧化氮合酶(NOS)存在三種亞型：神經(jīng)型一氧化氮合酶(neuronalNOS,nNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelialNOS,eNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducibleNOS,iNOS)[4]。iNOS是鈣離子和鈣調(diào)蛋白非依賴性酶，其激活不需要Ca2+濃度的升高，正常狀況下，細胞不表達iNOS。本研究結(jié)果顯示，糖尿病組大鼠勃起功能較對照組明顯下降，這與之前相關(guān)報道相符。糖尿病大鼠陰莖組織中GSH含量與正常組大鼠比較顯著下降(P<0.05)；而糖尿病大鼠陰莖組織中的iNOS含量較正常對照組明顯升高(P<0.05)。二者行相關(guān)性分析顯示呈負相關(guān)(r= -0.796,P<0.05)。長期的高血糖狀態(tài)，導(dǎo)致機體的炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)iNOS的高表達，有研究顯示iNOS在2型糖尿病血管病變中起著重要作用，證實iNOS與胰島素抵抗(IR)關(guān)系密切[5,6]。糖尿病患者，高血糖使還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)大量消耗，導(dǎo)致氧化型谷胱甘肽轉(zhuǎn)換呈還原型谷胱甘肽受阻，GSH生成不足，氧化還原平衡打破，使糖尿病患者體內(nèi)氧自由基大量積累。而糖尿病慢性炎癥使iNOS生成持續(xù)增加，致使NO過量，與活性氧產(chǎn)生有細胞毒性的過氧亞硝酸鹽，最終導(dǎo)致糖尿病性勃起功能障礙。

業(yè)已證實氧化應(yīng)激是導(dǎo)致糖尿病性勃起功能障礙重要因素，而持續(xù)的高血糖和低水平的GSH確是最終導(dǎo)致機體氧化應(yīng)激罪魁禍首[7]。在眾多的抗氧化劑中，還原型谷胱甘肽(reducedglutathione，GSH)是最重要的抗氧化劑，是保持細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)和蛋白質(zhì)功能完整性的重要物質(zhì)。GSH還與多種生理過程相關(guān)，如脫氧核苷酸的合成和調(diào)節(jié)、白三烯和前列腺素的代謝、半胱氨酸的儲存和轉(zhuǎn)運等。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)血糖升高時，活性氧簇(reactiveoxygenspecies,ROS)生成明顯增加，同時機體的自由基清除酶和抗氧劑的水平降低，致使O2-過量積累，O2-可以抑制eNOS的活性[8]，同時O2-同激活轉(zhuǎn)錄因子核因子NFB，使iNOS表達增加[9]。激活后的iNOS持續(xù)催化生成NO，其結(jié)果是內(nèi)皮細胞NO大量積累，直至底物耗竭或細胞死亡，最終導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷[10]。此外NO與ROS反應(yīng)生成更強的氧化劑過氧亞硝酸陰離子(Peroxynitrite,ONOO-)，能夠氧化包括糖類、蛋白質(zhì)、脂類等多種物質(zhì)，使DNA遭到破壞，導(dǎo)致細胞死亡[11]。

由此可知GSH水平、iNOS的表達共同參與DMED的發(fā)病機制，但GSH是否是DMED的始動因素，還有待進一步深入研究。針對升高GSH的水平，并阻斷iNOS的持續(xù)表達藥劑研制，將會是DMED的治療新途徑。

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The correlation analysis of GSH and iNOS in penile tissue of type-2 diabetes mellitus

MALong,HUCun-li,GUIShi-liang,CHENDa-yin,CHENGJiang,DUCong-lin,CAOHui-feng

(Department of Urology, the First Hospital Affiliated to Jiamusi University, Jiamusi 154003, China)

Objective: To research the changes of the expressions of GSH and inducible nitric oxide synthase (iNOS) in penile tissue of type-2 diabetes mellitus rats as well as the correlation of the expression levels of GSH and iNOS. Methods: 20 rats were selected randomly from 30 healthy male Sprague Dawley (SD) rats aged 8 weeks into the diabetic model group (DM group), which were raised with high calorie and high sugar diet for 4 weeks. The rest of rats were divided into the control group (Control group). After 4 weeks penile erections, the rats were observed in order to evaluate their erectile function. All rats were killed for measurement of the maximal intracavernous pressure/mean arterial blood pressure(ICPmax/MAP)by electrostmulation. The determination of the GSH in penile tissue were detected. The expression of iNOS in the penile corpus cavernosum was detected by Immunohistochemistry and Western blot. Results: The erectile functions of the rats in DM group declined compared with control group, and the GSH expression level decreased in penile tissue of DM model rats(P<0.05).TheexpressionofiNOSincreasedinpeniletissueofDMrats(P<0.05).PearsoncorrelationanalysisshowedtherewasanegativerelationshipofthedensityofGSHwiththeexpressionlevelofiNOS(r= -0.796,P<0.05). Conclusion: When the expression of GSH decreased, the expression of iNOS goes higher. They are negatively correlated. The negative relationships is an important pathological mechanism in diabetes mellitus induced erectile dysfunction.

type2 diabetes mellitus;GSH; iNOS

1.黑龍江省自然科學(xué)基金項目，編號：H2015073；2.黑龍江省教育廳科學(xué)研究項目，編號：12521542；3.佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)重點項目，編號：2013-005。

馬龍(1985～)男,山東臨沂人,在讀碩士研究生。

曹會峰(1967～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail: 13845451056@163.com。

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A

1008-0104(2017)01-0017-03

2015-12-04)