劉 娜，李文強，高成偉

(武漢大學人民醫(yī)院急診科，武漢 430060；*通訊作者，E-mail:wenqiang67@sohu.com；#共同通訊作者，E-mail:gaochengweihubei@163.com)

冬凌草甲素通過下調NF-κB/COX-2表達抑制結腸癌LoVo細胞增殖

劉 娜，李文強*，高成偉#

(武漢大學人民醫(yī)院急診科，武漢 430060；*通訊作者，E-mail:wenqiang67@sohu.com；#共同通訊作者，E-mail:gaochengweihubei@163.com)

目的 觀察天然植物冬凌草提取物冬凌草甲素對結腸癌LoVo細胞增殖、凋亡的作用，并分析其可能的作用機制。 方法 體外培養(yǎng)LoVo細胞，用不同濃度冬凌草甲素(0-240 μmol/L)分別處理24，48，72 h，MTT法檢測細胞活力的改變。冬凌草甲素(終濃度為0，30，60，120 μmol/L)分別處理LoVo細胞48 h，流式細胞儀檢測細胞凋亡率的變化，ELISA法檢測細胞上清液中PGE2的含量；Western blot檢測細胞蛋白環(huán)氧合酶-2(COX-2)、p-NF-κB(p65)、Bcl-2及Bax的表達的改變。 結果 冬凌草甲素(15-240 μmol/L)能顯著抑制LoVo細胞活力(P<0.05)，呈劑量、時間依賴性。冬凌草甲素(終濃度為0,30，60，120 μmol/L)處理LoVo細胞48 h后，細胞凋亡率分別為8.83%,15.5%，22.64%和25.86%；冬凌草甲素處理LoVo細胞48 h后，細胞Bax蛋白表達上調，Bcl-2蛋白表達下調(P<0.05)，同時p-NF-κB(p65)、COX-2蛋白的表達及PGE2合成降低(P<0.05)。 結論 冬凌草甲素可通過抑制p-NF-κB、COX-2表達及PGE2合成，繼而上調促凋亡蛋白Bax表達，下調抗凋亡蛋白Bcl-2表達，抑制LoVo細胞增殖并誘導細胞凋亡。

冬凌草甲素； LoVo細胞； 細胞凋亡； 環(huán)氧合酶-2； 前列腺素E2

大腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率居惡性腫瘤的第3位，死亡率則高居惡性腫瘤相關死亡的第2位[1]；每年全球有超過120萬新增病例，有超過60萬病例死亡[2]。治療大腸癌的有效性取決于能否早期診斷，其治療措施包括手術切除、放療或化療等各種組合的綜合治療。不幸的是，在大腸癌的早期階段，其發(fā)病隱匿，即使早期有癥狀，因其非特異性也未引起患者重視，導致早期診斷困難。事實上，大多數大腸癌患者就醫(yī)時都已經屬于中晚期?；熑允沁M展期大腸癌的主要治療方式，然而常規(guī)化療藥物毒副作用大，易耐藥。因此，迫切需要尋找新的治療方法和策略。

冬凌草甲素(oridonin)，又稱延命草寧，是從冬凌草中提取的以貝殼杉烯(ent-kaurene)為骨架的四環(huán)二萜類化合物，是冬凌草中最主要的活性成分。前期研究已經證實，其具有抗炎、抗氧化、調解免疫、抗菌等多種藥理活性[3]。近年來，大量資料證實，冬凌草甲素也具有抗腫瘤活性，對食管癌、膀胱癌及肺癌等多種腫瘤細胞的均有抑制作用[4-7]。本研究擬觀察冬凌草甲素對結腸癌細胞系LoVo細胞增殖、凋亡的影響，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

結腸癌LoVo細胞由中國科學院上海細胞庫提供；冬凌草甲素購自上海詩丹德生物技術有限公司(純度>98%)，用DMSO 配制成10 mmol/L(DMSO的終濃度小于0.1%)的母液，-20 ℃保存；胎牛血清購自GBICO；培養(yǎng)板購于Corning公司；PGE2 ELISA試劑盒購自美國BPB公司；Bax、Bcl-2、COX-2、p-NF-κB(p65)及β-actin抗體購自Cell Signaling Technology公司。RPMI1640培養(yǎng)液、辣根酶標記山羊抗兔或山羊抗鼠IgG購自碧云天生物技術研究所。

1.2 主要儀器

臺式低溫離心機購自日本Hitachi公司；微量精密移液器購自德國Eppendorf公司；細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；正置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；電子分析天平購自上海精密儀器儀表有限公司；普通冰箱購自海爾集團；超低溫冰箱購自美國ThermoForma公司；脫色搖床購自金壇市正基儀器有限公司；ZP-200恒溫振蕩器購自常州國華電器有限公司；手提壓力式蒸汽滅菌器購自上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；電熱恒溫干燥箱購自天津泰斯特儀器有限公司；自動三重純水蒸餾器購自上海亞榮生化儀器廠；流式細胞儀購自美國Berkman公司；超凈工作臺(SW-CJ-IFD型)購自蘇州真田潔凈設備有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng)及分組

用含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2條件細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)LoVo細胞，取生長狀態(tài)良好的并處于對數期的細胞進行實驗。實驗分為4組：對照組(0 μmol/L冬凌草甲素)、30 μmol/L冬凌草甲素組、60 μmol/L冬凌草甲素組和120 μmol/L冬凌草甲素組。

1.4 細胞活力測定

取3塊96孔板，同時準備好細胞計數板；取對數生長期的細胞備用；調整細胞濃度為5×104/ml，每組設3個復孔，每孔加培養(yǎng)基150 μl，鋪板過程中確保每個孔接種的細胞數目一致，鋪板完成后將培養(yǎng)板放培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育；細胞貼壁后各組分別加入冬凌草甲素終濃度為0,15,30，60，120,240 μmol/L的培養(yǎng)液，3塊培養(yǎng)板分別培養(yǎng)24，48，72 h，在培養(yǎng)終止前4 h，每孔內加入10 μl 5 mg/ml的MTT，繼續(xù)孵育4 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μl的DMSO終止反應。將96孔板置于振蕩器上振蕩10 min后，在酶標儀上檢測490 nm的A值。細胞活力(%)計算公式：(實驗組平均A值-調零孔A值)/(對照組平均A值-調零孔A值)]×100%。

1.5 細胞凋亡率檢測

取對數生長期細胞，接種于6孔板中，貼壁后棄上清。冬凌草甲素組分別加入含不同濃度冬凌草甲素(終濃度為30，60，120 μmol/L)的培養(yǎng)液，對照組加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，將6孔板置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)上清于5 ml離心管中，用D-Hanks液洗滌細胞1次，胰酶消化細胞，收集細胞于同一5 ml離心管中。4 ℃條件下1 500 r/min離心5 min，棄上清，收集細胞。用1×的binding buffer液洗滌細胞，4 ℃條件下1 500 r/min，離心5 min，收集細胞，加入staining buffer液，充分混勻，重懸細胞，調整細胞密度為5×106cell/ml。取5 μl annexin V-APC加入100 μl細胞懸液進行染色，室溫下避光放置10 min，將染色后的細胞懸液用流式細胞儀檢測，每組設3個復孔。

1.6 ELISA法檢測PGE2

按照預定分組處理48 h后，吸取培養(yǎng)基離心后將上清液移至高壓消毒的EP管中備用。加入標準品至酶標板中，設置梯度，分別取各組上清液樣品100 μl，加入至酶標板中，再分別將每孔加入酶標液50 μl，室溫放置90 min。具體操作步驟根據試劑盒要求進行，根據標準品曲線計算樣品中PGE2濃度。

1.7 Western blot檢測COX-2及p-NF-κB(p65)蛋白表達

消化離心收集各組處理48 h后的細胞，預冷PBS液洗滌，加入預冷蛋白裂解液200 μl，4 ℃裂解30 min，置于冰上超聲裂解；4 ℃，12 000 r/min離心10 min，小心吸取上清，移至高壓消毒過的EP管中，分裝后于-80 ℃儲存。采用BCA法測定蛋白質；取40 μg樣品并加入等體積上樣緩沖液，SDS-PAGE電泳，再轉膜至PVDF膜，37 ℃條件下用5% BSA封閉1 h，分別加入兔抗人COX-2、p-NF-κB(p65)抗體，4 ℃搖床上孵育過夜；TBST洗膜，加入稀釋比例為1 ∶1 000的辣根酶標記的山羊抗兔二抗，37 ℃條件下孵育2 h，TBST洗膜，暗室曝光、顯影定影，分析結果。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析數據，所有計量資料以均數±標準差表示，兩樣本間參數比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 冬凌草甲素對LoVo細胞活力的影響

冬凌草甲素在15-240 μmol/L范圍內均可抑制LoVo細胞的增殖(見圖1)，抑制作用呈時間和濃度依賴性，藥物濃度越高、作用時間越長，其發(fā)揮抗腫瘤作用效果亦越好。

圖1 冬凌草甲素對LoVo細胞增殖的影響Figure 1 The effect of oridonin on the cell proliferation of LoVo colorectal cancer cells

2.2 冬凌草甲素對LoVo細胞凋亡的影響

冬凌草甲素(濃度分別為0，30，60，120 μmol/L)處理LoVo細胞48 h后，細胞凋亡率分別為8.83%,15.5%,22.64%和25.86%(見圖2)，隨著藥物濃度的增加，細胞凋亡率逐漸增加。提示冬凌草甲素能誘導LoVo細胞凋亡。

2.3 冬凌草甲素對LoVo細胞凋亡相關蛋白Bax及Bcl-2蛋白表達的影響

0，30，60，120 μmol/L的冬凌草甲素處理LoVo細胞48 h后，Western blot結果顯示隨著藥物濃度的升高，促凋亡蛋白Bax表達量逐漸升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達量逐漸降低(P<0.05,見圖3)。

2.4 冬凌草甲素對LoVo細胞COX-2的影響

0，30，60，120 μmol/L濃度的冬凌草甲素處理LoVo細胞48 h后，COX-2表達逐漸降低(P<0.05,見圖4)，表明冬凌草甲素可下調LoVo細胞COX-2表達。

圖2 冬凌草甲素對LoVo細胞凋亡率的影響Figure 2 The effect of oridonin on the cell apoptosis of LoVo colorectal cancer cells

圖3 冬凌草甲素對LoVo細胞Bax和Bcl-2蛋白表達的影響Figure 3 The effect of oridonin on the expression of Bax and Bcl-2 in LoVo colorectal cancer cells

圖4 冬凌草甲素對LoVo細胞COX-2蛋白表達的影響Figure 4 The effect of oridonin on the expression of COX-2 in LoVo colorectal cancer cells

2.5 冬凌草甲素對LoVo細胞PGE2產生的影響

PGE2作為COX-2的催化產物，與COX-2表達水平及活性密切相關。進一步探討了30，60，120 μmol/L濃度的冬凌草甲素分別處理LoVo細胞48 h后對細胞上清液中PGE2濃度的影響，結果表明隨著藥物濃度的增加，細胞上清液中PGE2濃度明顯降低(見圖5)，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖5 冬凌草甲素對LoVo細胞PGE2合成的影響Figure 5 The effect of oridonin on the synthesis of PGE2 in LoVo colorectal cancer cells

2.6 冬凌草甲素對LoVo細胞NF-κB表達的影響

作為炎癥反應的調控基因，NF-κB參與調控COX-2的表達，因此本實驗進一步探討冬凌草甲素對NF-κB/p65表達的作用，不同濃度的冬凌草甲素處理LoVo細胞48 h后，細胞核內p-NF-κB(p65)表達量減少，呈濃度依賴性(見圖6)。

圖6 冬凌草甲素對LoVo細胞核內p-NF-κB表達的影響Figure 6 The effect of oridonin on the expression of p-NF-κB within nucleus in LoVo colorectal cancer cells

3 討論

本實驗結果顯示，冬凌草甲素可抑制LoVo細胞的增殖，且抑制作用呈時間和濃度依賴性，藥物濃度越高、作用時間越長，其發(fā)揮抗腫瘤作用效果亦越好。同時，本實驗結果顯示冬凌草甲素處理后可顯著誘導細胞凋亡，呈濃度依賴性。這些結果表明，冬凌草甲素可能通過激活細胞凋亡通路抑制細胞增殖。

本實驗檢測了冬凌草甲素對凋亡相關蛋白Bcl-2及Bax表達的影響。結果顯示冬凌草甲素可下調LoVo細胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，同時上調促凋亡蛋白Bax的表達?？沟蛲龅鞍譈cl-2主要存在于線粒體、內質網和核膜上，研究顯示在多種腫瘤細胞中Bcl-2均成過表達狀態(tài)，引起細胞持續(xù)增殖。Bcl-2可通過增強線粒體膜電位，保持線粒體內外膜的完整性，及抑制Ca2+釋放，阻止核酸內切酶活化等多種機制抑制細胞凋亡，在腫瘤發(fā)生及發(fā)展中扮演著重要角色[8,9]；此外，Bcl-2還可通過與ERK等通路相互作用，調節(jié)細胞凋亡[10]。研究顯示下調Bcl-2的表達可促進細胞凋亡，并可延長中路患者的生存期[11]；促凋亡蛋白Bax也屬于Bcl-2家族，但其作用與Bcl-2相反，Bax即可與自身形成同源二聚體，又可與Bcl-2相互結合形成異源二聚體，Bcl-2表達上調時可促進自身與Bax結合形成異源二聚體，發(fā)揮抗凋亡作用，Bcl-2表達下調時，則出現(xiàn)相反的效應[12]。

包括結腸癌在內的多種腫瘤均高表達COX-2。作為PGE2合成過程的重要限速酶，過表達的COX-2又大量產生PGE2，二者共同參與腫瘤增殖、凋亡、侵襲及轉移[13,14]。抑制COX-2及PGE2表達后可促進細胞凋亡、抑制血管新生、促進細胞免疫而發(fā)揮抗腫瘤作用。研究發(fā)現(xiàn)，COX-2抑制劑在一定程度上可預防胃腸道腫瘤及其他腫瘤[15,16]。由于COX-2在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，COX-2被認為是腫瘤治療的潛在靶點。本實驗結果顯示冬凌草甲素能顯著降低LoVo細胞COX-2蛋白表達，并抑制PGE2的合成。

此外，NF-κB作為COX-2在炎癥反應過程中的上游調控基因，本實驗檢測了冬凌草甲素對NF-κB/p65表達的影響。Western blot結果提示冬凌草甲素可降低細胞核內p-NF-κB(p65)表達，即冬凌草甲素可抑制LoVo細胞NF-κB的核內移位。

綜上所述，冬凌草甲素可降低結腸癌LoVo細胞增殖，并誘導細胞凋亡，其作用機制可能是通過抑制p-NF-κB(p65)轉錄，下調COX-2表達和PGE2合成。

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Oridonin inhibits proliferation of LoVo colorectal cancer cells through inhibiting the expression of NF-κB/COX-2

LIU Na,LI Wenqiang*,GAO Chengwei#

(DepartmentofEmergency,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China;*Correspondingauthor,E-mail:wenqiang67@sohu.com；#Co-correspondingauthor,E-mail:gaochengweihubei@163.com)

ObjectiveTo explore the effect of oridonin on the cell proliferation and apoptosis of LoVo colorectal cancer cells and its possible mechanisms.MethodsLoVo cells were culturedinvitroand treated with different concentrations(0-240 μmol/L) of oridonin for 24,48 and 72 h,respectively,and then the cell activity was determined by MTT assay. After treated with 0，30，60，120 μmol/L oridonin for 48 h, the cell apoptosis rate was detected by flow cytometry, the expression of PGE2 in the culture medium was detected by ELISA, and Bcl-2,Bax,COX-2 and p-NF-κB(p65) protein expression was detected by Western blot.ResultsMTT result showed that the cell proliferation of LoVo cells was inhibited by oridonin in a dose-dependent and time-dependent manner(P<0.05). After treated with 0, 30，60，120 μmol/L oridonin, the cell apoptosis rate of LoVo cells was 8.83%,15.5%,22.64%,and 25.86%,respectively. ELISA result showed that the PGE2 synthesis was inhibited after treated with oridonin. The oridonin promoted the expression of pro-apoptotic factor Bax, and suppressed the expression of anti-apoptotic factor Bcl-2(P<0.05). Western blot showed that oridonin decreased the expression of COX-2 and p-NF-κB,and PEG2 synthesis(P<0.05).ConclusionOridonin could inhibit the cell proliferation and induce cell apoptosis in LoVo cells by inhibition of the expression of p-NF-κB for up-regulating Bax and down-regulating Bcl-2.

oridonin; LoVo cells; cell apoptosis; COX-2; PGE2

劉娜，女，1981-07生，本科，主治醫(yī)師，E-mail：371264709@qq.com

2016-12-19

R735.35

A

1007-6611(2017)03-0251-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.03.011