楊麗美姚和瑞劉玉潔*

抑制miR-223表達(dá)促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2型激活

楊麗美1姚和瑞2劉玉潔2*

目的觀察microRNA-223（miR-223）在巨噬細(xì)胞M2型激活中的表達(dá)及作用。方法運(yùn)用慢病毒載體感染的方式在巨噬細(xì)胞中過表達(dá)或敲低miR-223的表達(dá)；應(yīng)用qPCR檢測不同激活狀態(tài)及轉(zhuǎn)染狀態(tài)巨噬細(xì)胞中miR-223的表達(dá)；應(yīng)用Elisa及流式細(xì)胞術(shù)檢測M2型巨噬細(xì)胞的激活狀態(tài)；應(yīng)用Transwell遷移實驗和劃痕實驗檢測乳腺腫瘤細(xì)胞的遷移情況。結(jié)果miR-223在單核/巨噬細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于腫瘤細(xì)胞，在單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化過程中miR-223表達(dá)下調(diào)，且IL-4或與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)激活的巨噬細(xì)胞下調(diào)顯著。敲低miR-223的表達(dá)而不是增加其表達(dá)能夠促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CCL18、IL-10和CD206的表達(dá)，并促進(jìn)共培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的遷移。結(jié)論miR-223可作為靶向腫瘤微環(huán)境調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移的靶點。

microRNA-223；巨噬細(xì)胞；乳腺腫瘤

0 前言

乳腺癌已經(jīng)成為威脅女性生命健康的首位惡性腫瘤。特別是對于中晚期的病例，即使經(jīng)過根治性的手術(shù)治療，多個療程的放療、化療和內(nèi)分泌治療，仍有相當(dāng)大部分病人會發(fā)生復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，危及生命。因此，探討乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制已成為目前研究的熱點之一。

實體腫瘤組織由腫瘤細(xì)胞和許多非腫瘤的間質(zhì)細(xì)胞組成，這些細(xì)胞連同血管淋巴管構(gòu)成腫瘤的微環(huán)境。在腫瘤微環(huán)境中這些細(xì)胞相互作用從而影響著腫瘤的生長、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和血管生成［1］。其中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associatedmacrophages，TAMs）在腫瘤進(jìn)展中的重要作用近年來已得到廣泛共識，在乳腺癌中，TAMs占到細(xì)胞組分的50%以上，并且80%的臨床研究顯示TAMs的密度與腫瘤的不良預(yù)后呈正相關(guān)［2］。在腫瘤組織中，根據(jù)局部組織微環(huán)境中存在的因子不同，巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)不同的激活狀態(tài)或表型。細(xì)菌脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）或干擾素γ（interferonγ，IFN-γ）可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的“經(jīng)典激活”，呈現(xiàn)M1表型，表達(dá)高水平的促炎因子和MHCⅡ，能夠殺死微生物和腫瘤細(xì)胞。而TH2細(xì)胞因子，例如白介素-4（interleukin4，IL-4）和IL-13，促進(jìn)巨噬細(xì)胞進(jìn)入“選擇性激活”途徑，呈現(xiàn)M2表型，通過產(chǎn)生血管生成因子，基質(zhì)分解因子和下調(diào)抗腫瘤免疫反應(yīng)等從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展［3，4］。

MicroRNA（miRNA）是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類具有內(nèi)源性調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長約20～25個核苷酸。MiRNA通過部分堿基互補(bǔ)配對的方式，識別靶mRNA的3′UTR，并指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯［5］。越來越多的證據(jù)表明microRNA能轉(zhuǎn)錄后調(diào)控多項細(xì)胞生物學(xué)特性，從而決定細(xì)胞命運(yùn)。已有研究發(fā)現(xiàn)LPS能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)多種miRNAs的表達(dá)，參與M 1型巨噬細(xì)胞的促炎反應(yīng)［6］。雖然miRNA在M1型巨噬細(xì)胞激活中的作用已有定論，然而，microRNA是否也在IL-4/IL-13促進(jìn)的M2型巨噬細(xì)胞激活中發(fā)揮作用，目前的研究還較少［7］。

MiR-223是一種高度保守的miRNA，幾乎專一性地在髓系細(xì)胞中表達(dá)［8］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞能夠通過分泌外泌體（exosome）的方式將miR-223包裹其中并傳遞到乳腺腫瘤細(xì)胞中，通過靶向腫瘤細(xì)胞中的Mef2c-β-catenin通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［9］。本研究結(jié)果及前期研究均發(fā)現(xiàn)miR-223在單核/巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，那么miR-223是否在巨噬細(xì)胞的激活中發(fā)揮作用，目前還沒有定論。因此，本研究旨在體外探索miR-223對巨噬細(xì)胞激活狀態(tài)的影響，及對腫瘤轉(zhuǎn)移功能的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購自ATCC；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶、胎牛血清（Fetalbovine serum，F(xiàn)BS）購自life technology；CCL18、IL-10 Elisa試劑盒購于ebioscience公司；CD206-FITC及其同型抗體購于BD公司；0.4μm及8μm transwell小室購自Corning；攜帶miR-223 mimics、inhibitor及NC的慢病毒載體病毒液購自上海吉瑪；qPCR試劑盒購自Takara；Trizol購自life technology；Tumor dissociation kit購自美天旎，CompomatG4全自動血液成分分離機(jī)購自德國費(fèi)森尤斯。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、SK-3rd、BT-474應(yīng)用DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)，置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中。

人外周血單核細(xì)胞（human peripheral blood monocyte cells，PBMC）分離方法參考之前文獻(xiàn)報道［10］等。血液標(biāo)本選擇廣州血液中心采集的獻(xiàn)血者400mL四聯(lián)袋全血，進(jìn)行以下操作：①接駁；②血液的初次離心和分離：將四聯(lián)袋采集的新鮮（4～6 h內(nèi)）400mL全血，以2100 g、12min、22℃為離心條件，進(jìn)行重離心，離心后的血袋置于CompomatG4全自動血液成分分離機(jī)上，按照預(yù)先編制的程序，自動分離含血小板的血漿，分離完畢，機(jī)器自動將紅細(xì)胞血漿熱合封口；③將分離出的含血小板的血漿袋室溫懸掛靜置1～1.5 h；④含血小板血漿進(jìn)行第2次離心和分離：將靜置后含血小板和空轉(zhuǎn)移袋的二聯(lián)袋，以400 g、8 min、22℃為離心條件進(jìn)行輕離心（Sorval1.RE-12BP型離心機(jī)）；⑤用分血夾板通過虹吸法緩慢分離出上層血漿（含血小板），下層即為制備的白膜層（白細(xì)胞）。將白膜層吸出，重懸于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，以5×106細(xì)胞/孔的密度種于24孔板中，1 h后去掉懸浮細(xì)胞，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基。所獲得細(xì)胞95%以上為CD14+細(xì)胞，即為單核-巨噬細(xì)胞（此部分結(jié)果未顯示，參考前期實驗結(jié)果［9，11，12］）。未激活的巨噬細(xì)胞（Con mac）繼續(xù)在RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，LPS激活的巨噬細(xì)胞（LPS mac）在培養(yǎng)基中加入LPS（25μg/mL），IL-4激活的巨噬細(xì)胞（IL-4 mac）在培養(yǎng)基中加入IL-4（45 ng/mL）培養(yǎng)4天。MDA-MB-231細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)（Cocu）應(yīng)用0.4μm transwell小室，將巨噬細(xì)胞置于上室，腫瘤細(xì)胞種于下室。MiR-223 mimics、inhibitor及其NC采用慢病毒載體感染巨噬細(xì)胞。

人原代TAMs從原代切除的乳腺腫瘤組織中分離。分離方法采用美天旎公司Tumordissociation kit及gentleMACSTMDissociators儀。操作步驟參考說明書，腫瘤組織消化后獲得的細(xì)胞懸液同上應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液分離TAMs，95%以上細(xì)胞表達(dá)CD14。

1.3 qPCR

細(xì)胞總RNA提取采用Trizol提取，miR-223及內(nèi)參照U6 snRNA引物由上海吉瑪合成。qPCR過程參考試劑說明書。實驗中使用的引物序列如下：

miR-223上游引物：5CATTGTCAGTTTGTCAA ATACC3′；

miR-223下游引物：5′CCATGAGAGATCCCTA GCG3′；

U6 snRNA上游引物：5′ATTGGAACGATACAG AGAAGAT3′；

U6 snRNA下游引物：5′GGAACGCTTCACGAA TTT3′。

1.4 Transwell細(xì)胞遷移和劃痕實驗

MDA-MB-231細(xì)胞80%融合后胰酶消化，PBS沖洗后用100μL無血清培養(yǎng)基重懸1×105細(xì)胞，并置于8μm transwell上室，同時下室加入500μL不同處理組巨噬細(xì)胞作為趨化劑來誘導(dǎo)細(xì)胞遷移。繼續(xù)培養(yǎng)5 h后，擦掉小室上層細(xì)胞，PBS沖洗掉細(xì)胞碎片后，用4%多聚甲醛固定20min，然后0.1%結(jié)晶紫染色，200倍光學(xué)顯微鏡下拍照并隨機(jī)取10個視野計數(shù)。實驗獨立重復(fù)三次。

在劃痕試驗中，按照上述共培養(yǎng)方法，將MDA-MB-231細(xì)胞置于下室，80%融合后劃線，PBS輕輕沖洗掉細(xì)胞碎片，然后加入無血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)12 h，同時上室加入不同處理巨噬細(xì)胞。劃痕后0 h和12 h分別在顯微鏡下相同位置拍照。

1.5 Elisa

IL-10和CCL18的表達(dá)通過Elisa實驗檢測。實驗操作參考試劑說明書。細(xì)胞因子的絕對濃度通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算。實驗獨立重復(fù)三次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)

巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物CD206的表達(dá)情況通過流式細(xì)胞術(shù)檢測。巨噬細(xì)胞通過不同處理后，消化收集細(xì)胞沉淀，冷PBS沖洗后離心，50μL PBS重懸并加入5μL CD206-FITC或其同型抗體，冰上孵育30min后，PBS洗兩遍，流式細(xì)胞儀檢測平均熒光密度。

1.7 統(tǒng)計與繪圖

Originlab 7.5軟件處理數(shù)據(jù)，不同處理組間差異采用單因素ANOVA方差分析（大于等于三組）和t檢驗（兩組），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Originlab 7.5及Adobe illumistrator CS2軟件進(jìn)行繪圖。

圖1 miR-223在乳腺腫瘤細(xì)胞及不同激活狀態(tài)巨噬細(xì)胞中的表達(dá)情況

2 結(jié)果

2.1 M2型激活的巨噬細(xì)胞中miR-223表達(dá)下調(diào)

既往研究發(fā)現(xiàn)miR-223在髓系細(xì)胞中高表達(dá)，我們的研究比較乳腺腫瘤細(xì)胞株MDA-MB-231、SK-3rd、BT-474及單核細(xì)胞中miR-223的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞中miR-223的表達(dá)較腫瘤細(xì)胞高約400倍（圖1A）。結(jié)果提示miR-223可能在單核/巨噬細(xì)胞中發(fā)揮重要功能。

根據(jù)之前的研究報道，IL-4處理或間質(zhì)型乳腺腫瘤細(xì)胞與單核細(xì)胞共培養(yǎng)可將之激活為促腫瘤表型的M2型巨噬細(xì)胞［12］，而LPS是經(jīng)典的M1型巨噬細(xì)胞激活因子。我們將新鮮分離的單核細(xì)胞分為四組：未處理組，LPS（25μg/mL）激活組，IL-4（45 ng/mL）激活組及腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)組，處理四天后檢測巨噬細(xì)胞中miR-223的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)miR-223的表達(dá)都有不同程度的降低，但LPS處理組與對照組間無顯著性差異，而IL-4處理組和共培養(yǎng)組巨噬細(xì)胞中miR-223的表達(dá)顯著下調(diào)（圖1B）。為了驗證是否M2型激活的巨噬細(xì)胞中miR-223表達(dá)下調(diào)，我們分離乳腺腫瘤患者的外周血單核細(xì)胞和同一患者的TAMs，qPCR檢測發(fā)現(xiàn)在TAMs中，miR-223的表達(dá)下調(diào)更加顯著（圖1C）。

2.2 降低miR-223的表達(dá)促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2型激活

為了檢測巨噬細(xì)胞的M2型激活與miR-223表達(dá)下調(diào)的關(guān)系，我們在巨噬細(xì)胞中過表達(dá)或敲低miR-223。由于巨噬細(xì)胞屬于較難轉(zhuǎn)染細(xì)胞，我們采用慢病毒感染的方法，能夠較好的增加或降低miR-223的表達(dá)（圖2A）。然后我們檢測增加或降低miR-223的表達(dá)對巨噬細(xì)胞的激活狀態(tài)的影響。由于miR-223主要在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，我們分別采用Elisa的方法檢測M2型巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子CCL18和IL-10，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物CD206的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-223與其NC相比不增加CCL18，IL-10及CD206的表達(dá)，而感染了miR-223 inhibitor的巨噬細(xì)胞CCL18，IL-10及CD206的表達(dá)上調(diào)。應(yīng)用IL-4處理后，這些因子表達(dá)都顯著上調(diào)，而miR-223 inhibitor處理組中，CCL18，IL-10及CD206的表達(dá)較其對照組進(jìn)一步上升（圖2B，C，D）。這些結(jié)果提示單獨抑制miR-223的表達(dá)能激活巨噬細(xì)胞的M2表型，同時應(yīng)用IL-4后進(jìn)一步增加M2型標(biāo)志物的表達(dá)。應(yīng)用miR-223mimics與對照組相比不能顯著改變M2型標(biāo)志物的表達(dá)。

圖2 miR-223inhibitor促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M 2型激活

2.3 抑制miR-223的表達(dá)促進(jìn)共培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞遷移

我們之前的研究發(fā)現(xiàn)IL-4激活的巨噬細(xì)胞及TAMs能夠促進(jìn)乳腺腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［11］。我們檢測敲低巨噬細(xì)胞中的miR-223表達(dá)后，對腫瘤細(xì)胞移動能力的影響。取相同數(shù)量的巨噬細(xì)胞分別感染miR-223mimics、inhibitor或其NC，4天后在上室種MDA-MB-231細(xì)胞觀察腫瘤細(xì)胞遷移情況。我們發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后都能增加MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力，而低表達(dá)miR-223的巨噬細(xì)胞促M(fèi)DA-MB-231細(xì)胞遷移的能力更強(qiáng)（圖3）。

此外，我們采用劃痕實驗進(jìn)一步證實miR-223 inhibitor感染的巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響。我們發(fā)現(xiàn)單獨只有MDA-MB-231組，細(xì)胞的遷移能力最弱，與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后都能增加乳腺腫瘤細(xì)胞的遷移。與Transwell遷移實驗一致，巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-223 inhibitor而不是mimics后顯著促進(jìn)劃痕傷口的愈合（圖4）。這些結(jié)果與敲低miR-223促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2型激活相關(guān)。

圖3 Transwell實驗顯示miR-223 inhibitor感染的巨噬細(xì)胞促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移

圖4 細(xì)胞劃痕實驗顯示miR-223敲低的巨噬細(xì)胞促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞遷移

3 討論

盡管已有較多研究報道了巨噬細(xì)胞的激活機(jī)制，然而microRNA對這一過程的調(diào)控作用，特別是對M2型巨噬細(xì)胞的激活作用，目前還不明確。MiR-223是髓系細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)因子，對于它參與調(diào)控巨噬細(xì)胞激活并不意外，但是目前的研究對miR-223調(diào)控的方向尚有較多爭議。

在單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化過程中，多種microRNA的表達(dá)下調(diào)，包括miR-15、miR-16和miR-223等［13］，這與我們本研究的結(jié)果相一致。我們發(fā)現(xiàn)無論是LPS誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞激活還是IL-4或腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞激活，其miR-223的表達(dá)都下調(diào)，其中M2型巨噬細(xì)胞的下調(diào)較顯著。在IL-4激活的巨噬細(xì)胞模型中，Zhou等［14］、Laura等［15］和Viviana等［16］都曾報道IL-4激活的巨噬細(xì)胞中miR-223表達(dá)下調(diào)。此外，本實驗室前期的研究發(fā)現(xiàn)IL-4激活的巨噬細(xì)胞能夠分泌較多的miR-223通過exosome包裹傳遞到腫瘤細(xì)胞，這個結(jié)果從側(cè)面說明由于miR-223大量分泌到巨噬細(xì)胞外，導(dǎo)致M2型激活的巨噬細(xì)胞中miR-223表達(dá)降低［9］。然而，有部分研究發(fā)現(xiàn)M2型激活的巨噬細(xì)胞中miR-223的表達(dá)較M1型巨噬細(xì)胞上調(diào)，這些不一致的原因主要來自于所觀察細(xì)胞的來源不同，miR-223表達(dá)上調(diào)的巨噬細(xì)胞主要來自于小鼠骨髓細(xì)胞。其次，IL-4處理的時間和濃度不同。TAMs代表著促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的巨噬細(xì)胞類型，有研究認(rèn)為其為M2的表型，最近也有學(xué)者主張不用M1，M2來界定巨噬細(xì)胞的激活狀態(tài)，其原因在于TAMs由于受到腫瘤微環(huán)境的影響，其表面標(biāo)志物及細(xì)胞因子的表達(dá)更加復(fù)雜。相比較單純IL-4激活的巨噬細(xì)胞，TAMs代表著更加促腫瘤的狀態(tài)［17］。我們收集臨床患者的外周血單核細(xì)胞，并與同一患者分離的TAMs相比較，發(fā)現(xiàn)miR-223的表達(dá)在TAMs中顯著下調(diào)約10倍，下調(diào)幅度超過IL-4激活的巨噬細(xì)胞。這些結(jié)果顯示miR-223的降低程度與巨噬細(xì)胞促腫瘤的能力相關(guān)。

關(guān)于miR-223在巨噬細(xì)胞激活中的作用，目前較多的研究發(fā)現(xiàn)miR-223高表達(dá)抑制M1型巨噬細(xì)胞的激活［18］。一項在RAW264.7巨噬細(xì)胞系中的研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-223抑制LPS誘導(dǎo)的IL-6和IL-1β的釋放［19］。在肥胖模型中，Zhuang等發(fā)現(xiàn)miR-223通過靶向Pknox1抑制巨噬細(xì)胞的促炎激活，抑制飲食誘導(dǎo)的脂肪組織炎癥反應(yīng)和系統(tǒng)性胰島素抵抗［20］。此外，在其他炎性相關(guān)疾病模型如風(fēng)濕［21］和敗血癥模型中［22］，都發(fā)現(xiàn)抑制miR-223的表達(dá)促進(jìn)炎癥的發(fā)生和臨床癥狀的惡化。至于miR-223在M2型巨噬細(xì)胞激活調(diào)控中的作用，研究比較少。一項在脂肪組織代謝的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-223可以通過靶向不同的靶點分別調(diào)控M1或M2型的激活，降低miR-223的表達(dá)抑制PPARγ依賴的選擇性巨噬細(xì)胞激活［23］。這項研究的結(jié)果與本研究內(nèi)容相矛盾，分析其原因可能有三方面：①實驗?zāi)Ｐ筒煌?；②實驗?xì)胞不同；③誘導(dǎo)因素不同；④miR-223mimics或inhibitor的轉(zhuǎn)染條件不同。由于巨噬細(xì)胞屬于難轉(zhuǎn)染細(xì)胞，本研究采用病毒感染的方式將相應(yīng)的microRNA轉(zhuǎn)到巨噬細(xì)胞中，miR-223的增加或降低比較可靠。而其他研究僅采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式，難以確保有效的miR-223的敲低或增加。在一項關(guān)于IL-4誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞融合的研究中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用IL-4處理巨噬細(xì)胞后降低miR-223的表達(dá)。在巨噬細(xì)胞中過表達(dá)miR-223后抑制IL-4促進(jìn)的巨噬細(xì)胞融合，而在miR-223敲除小鼠或miR-223缺失的巨噬細(xì)胞中展示出細(xì)胞融合的增加。這項研究表明miR-223負(fù)向調(diào)控IL-4誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞生物學(xué)功能，與我們的研究趨勢一致。

我們實驗室前期的研究發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞特異性大量分泌趨化因子CCL18，通過結(jié)合到乳腺腫瘤細(xì)胞上的PITPNM3受體促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［11］。我們的研究發(fā)現(xiàn)降低miR-223的表達(dá)促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型標(biāo)記物IL-10，CCL18和CD206的表達(dá)。同時，Transwell遷移實驗和劃痕實驗都表明敲低巨噬細(xì)胞中miR-223的表達(dá)促進(jìn)共培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的遷移，這與趨化因子CCL18的表達(dá)趨勢一致。由于CCL18能夠促進(jìn)共培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，我們推測miR-223降低誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CCL18分泌促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的遷移。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-223在IL-4誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞及TAMs中表達(dá)下調(diào)，敲低miR-223在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)能促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)增加，并促進(jìn)共培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。本研究為靶向腫瘤微環(huán)境控制腫瘤轉(zhuǎn)移提供治療靶點。然而microRNA的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，一個microRNA有不止一個靶基因，因此miR-223調(diào)控巨噬細(xì)胞M2型激活的機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。此外，本項研究的臨床意義也有待進(jìn)一步收集臨床標(biāo)本進(jìn)行驗證。

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MiR-223 inhibitor promotes the M2 polarization of macrophage

YANG Limei1，YAO Heri2，LIU Yujie2.
1Blood Components Preparation Department，Guangzhou Blood Center，Guangzhou 510095，China.2Breast Tumor Center，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China.Corresponding author：LIU Yujie，liuyujie554@163.com

ObjectiveTo investigate the expression and roles of miR-223 in regulating M2 polarization of macrophage.MethodsThe expression of miR-223 was detected by using qPCR.The phenotype of miR-223 adjusted macrophage was assayed by flow cytometry and Elisa.The ability of MDAMB-231 cellmigration was evaluated by transwelland wound-healing assay.ResultsMiR-223 was highly expressed inmonocytes than in breast cancer cells.The expression of miR-223 was downregulated duringmonocytes differentiation stimulated by Lipopolysaccharides（LPS），IL-4 or cocultured with MDAMB-231 cells.And the extent of miR-223 decrease in IL-4 and coculture group was greater than that in LPS treated group.Knockdown of miR-223 level increasesd the expression of M2 typemacrophagemarkers CCL18，IL-10 and CD206，as well as themotility of cocultured MDA-MB-231 cells.ConclusionMiR-223 could serve as a potential target to improve tumor microenvironment and prevent breast tumormetastasis.

microrna-223；macrophage；breast cancer

R73-37

A

10.3969/j.issn.1009-976X.2017.01.002

2016-12-13）

國家自然科學(xué)基金（81102022）；高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金（新教師類）（20110171120082）

1510095廣州廣州血液中心成分制備部；2510120廣州中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院乳腺腫瘤醫(yī)學(xué)部

*通訊作者：劉玉潔，E-mail：liuyujie554@163.com