楊 娜, 梁 簫,, 彭莉華, 沈和定,, 楊金龍,

(1. 上海海洋大學(xué) 海洋生物科學(xué)國際聯(lián)合研究中心, 上海 201306; 2. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306; 3. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 上海 201306)

厚殼貽貝(Mytilus coruscus), 隸屬于軟體動物門(Mollusca), 瓣鰓綱(Lamellibranchia), 貽貝目(Mytilodia), 貽貝科(Mytilidae), 是我國沿海人工養(yǎng)殖的重要水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類[1]。與其他許多水產(chǎn)無脊椎動物類似, 厚殼貽貝幼蟲經(jīng)過浮游階段后, 浮游末期的成熟眼點(diǎn)幼蟲會經(jīng)歷一個(gè)附著的過程, 變態(tài)成為稚貝[2]。在稚貝生長為成貝過程中, 當(dāng)外界生活條件不利時(shí),稚貝就會放棄原足絲, 重新選擇合適的附著基再分泌新足絲進(jìn)行附著[3]。海洋環(huán)境中, 一旦把表面潔凈的物體放入水體中, 海洋細(xì)菌將會很快附著在其表面進(jìn)行生長繁殖, 并隨后與硅藻、真菌、原生動物及無機(jī)顆粒和有機(jī)碎屑等共同形成一層微生物被膜[4-5]。研究表明微生物被膜可以不同水平地誘導(dǎo)或抑制水產(chǎn)無脊椎動物的附著過程[6-7]。近些年來, 厚殼貽貝的野生資源日益匱乏, 大規(guī)模養(yǎng)殖技術(shù)尚未完善, 苗種供不應(yīng)求[8]。研究厚殼貽貝幼蟲和稚貝附著及其生長發(fā)育則顯得尤為重要。

動物體內(nèi)棲息著數(shù)量大、種類多的細(xì)菌群落, 而以腸道內(nèi)的細(xì)菌群落最多, 且與宿主互相依賴、彼此制約, 因此會在宿主腸道內(nèi)形成一種穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)[9]。宿主與細(xì)菌的關(guān)系大致有3種: 致病、互利共生和同食共生[10], 通常狀況下, 宿主與腸道細(xì)菌是互利共生的。研究表明腸道細(xì)菌在宿主的生長發(fā)育、免疫和營養(yǎng)代謝的過程中發(fā)揮重要作用。Sommer和Backhed[11]研究發(fā)現(xiàn), 與正常小鼠相比, 在無菌小鼠腸道中, 腸絨毛長而細(xì), 沒有復(fù)雜的血管網(wǎng), 腸隱窩較淺, 增生干細(xì)胞略少且黏液厚度較薄。在研究斑馬魚無菌腸道的發(fā)育時(shí)期時(shí), 對比斑馬魚正常的腸道, Bates等[12]發(fā)現(xiàn)斑馬魚無菌腸道的上皮細(xì)胞的分化受到阻礙。Zokaeifar等[13]研究表明, 凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的腸道細(xì)菌, 如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)能夠分泌某些胞外消化酶從而提高蝦體腸道內(nèi)的消化酶活性。另有研究闡明, 腸道細(xì)菌的種類和數(shù)量隨著季節(jié)的變化而發(fā)生變化, Al-Harbi和Uddin[14]測定了夏、秋、冬3個(gè)季節(jié)羅非魚和奧尼羅非魚(Oreochromis niloticus × Oreochromis aureus)腸道中細(xì)菌的數(shù)目和種類, 發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)的腸道細(xì)菌具有很大的差異。腸道同樣作為厚殼貽貝重要的消化吸收器官之一, 腸道細(xì)菌形成的微生物被膜是否會促進(jìn)厚殼貽貝稚貝的附著, 腸道中的細(xì)菌與厚殼貽貝的生長發(fā)育是否有關(guān)等問題均尚未有研究明確報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過從厚殼貽貝的腸道中分離并鑒定腸道細(xì)菌, 探究腸道細(xì)菌對其稚貝附著的作用, 確定腸道細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育地位, 了解其遺傳距離和細(xì)菌種屬與稚貝誘導(dǎo)活性之間的關(guān)系, 為進(jìn)一步研究腸道細(xì)菌與各個(gè)發(fā)育階段的厚殼貽貝幼蟲和稚貝之間的相互作用奠定基礎(chǔ), 也對人工養(yǎng)殖(例如稚貝中間培育)具有重要的理論指導(dǎo)意義。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的野生厚殼貽貝以及其稚貝均來源于浙江省嵊泗縣枸杞島。其中稚貝殼長為(1.80 ±0.05)mm, 殼高為(1.17 ± 0.03)mm。在實(shí)驗(yàn)室恒溫培養(yǎng)箱18℃條件下充氣且暫養(yǎng)1周后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。每天按時(shí)換水, 并投喂湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)。成體厚殼貽貝殼長為(8.5 ± 0.3)cm,殼高為(4.4 ± 0.4)cm, 在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行暫養(yǎng), 養(yǎng)殖期間不進(jìn)行餌料投喂, 以便排空腸道, 充氣培養(yǎng)48 h后用于正式實(shí)驗(yàn)。

1.2　腸道細(xì)菌的分離鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

1.2.1腸道細(xì)菌的分離

用無菌鏟刀將厚殼貽貝成體解剖, 并用無菌剪刀和鑷子分離出完整腸道(整個(gè)解剖操作在冰上進(jìn)行); 隨后將整個(gè)腸道放入盛有50 mL滅菌的過濾海水(autoclaved filtered sea water, AFSW)的燒杯中, 用無菌剪刀將其剪碎并用無菌玻璃棒攪拌, 制成懸浮液, 涂布在 ZoBell 2216E固體培養(yǎng)基平板上。在黑暗、25℃條件下, 倒置培養(yǎng)48 h。然后在固體平板上用接種環(huán)挑取菌落進(jìn)行分離, 并最終獲得單株的腸道細(xì)菌, 再加入 15%的丙三醇(甘油)溶液, 放于–80℃冰箱保存。OLYMPUS相機(jī)(DIGITAL CAMERA MODEL NO.E-620)用于拍攝記錄每種腸道菌株的表型。

1.2.2腸道細(xì)菌16S rDNA基因的測序

按照DNA提取試劑盒上的標(biāo)準(zhǔn)流程提取單株腸道細(xì)菌的DNA。后續(xù)PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系、程序和引物均參考楊金龍等[3]。用 1.0%的瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)檢測PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物送公司進(jìn)行16S rDNA基因測序。將基因序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫, 獲得細(xì)菌菌名、上傳序列號等基本信息。

1.2.3比對序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

得到的細(xì)菌測序序列與其近源物種的 16S rDNA基因序列使用MEGA 6.06程序進(jìn)行比對。系統(tǒng)發(fā)育分析分別基于最大簡約法(MP)、最小進(jìn)化法(ME)和鄰接法(NJ)進(jìn)行1 000次重復(fù)構(gòu)建, 物種間遺傳距離使用Jukes-Cantor法。構(gòu)建細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹, 選取大腸桿菌(Escherichia coli)(序列號AONF01000005.1)作為外群序列。

1.3　微生物被膜的形成與特性分析

1.3.1微生物被膜形成

挑取分離純化得到的單株腸道細(xì)菌到80 mL液體的ZoBell 2216E培養(yǎng)基中, 黑暗條件下25℃培養(yǎng)24 h之后, 在3 500 r/min的條件下離心15 min, 倒掉培養(yǎng)液, 再用 AFSW 清洗 3次, 最后加入 50 mL AFSW均勻混合至懸浮液。在無菌培養(yǎng)皿(經(jīng)160, 2 h℃

滅菌)中先放入無菌載玻片, 再加入一定量的菌體懸浮液, 最后加入適量的AFSW使其定容至20 mL, 從而使每株腸道細(xì)菌的初始密度分別是1×109、1×1010、1×1011和 5×1011個(gè)/L。每株細(xì)菌 4個(gè)不同的初始密度分別設(shè)置 12個(gè)平行, 空白對照組設(shè)置 9個(gè)平行,將其全部置于黑暗、18℃條件下的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h, 最終形成微生物被膜。

1.3.2微生物被膜的密度計(jì)數(shù)

將培養(yǎng)48 h的微生物被膜在5%甲醛中固定24 h,置于 0.1%吖啶橙染液中 5 min, 再放于熒光顯微鏡(奧林巴斯BX51)×1 000倍下進(jìn)行觀察, 同時(shí)隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野, 每株細(xì)菌的4個(gè)密度梯度分別設(shè)置3個(gè)平行, 從而確定4個(gè)初始細(xì)菌密度下微生物被膜的最終密度, 其計(jì)算公式參照楊金龍等[3]。

1.3.3微生物被膜形態(tài)及厚度分析

微生物被膜經(jīng)5%甲醛溶液固定24 h, 然后在黑暗條件下, 用5 mg/L的碘化丙啶(PI)溶液染色15 min, 在蔡司激光共聚焦掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy, CLSM)630×放大倍率下拍照。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行組, 每個(gè)平行組隨機(jī)選取 10個(gè)視野用于成像和分析。

1.4　稚貝附著實(shí)驗(yàn)

玻璃培養(yǎng)皿經(jīng)高溫滅菌后, 緩慢地放入附有微生物被膜的玻片, 再加20 mL AFSW和10個(gè)稚貝, 在恒溫18℃的無光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6、12、24和48 h后,記錄稚貝在微生物被膜上的附著率, 各株細(xì)菌的每個(gè)密度梯度分別設(shè)置 9個(gè)平行組; 對照組為無微生物被膜的載玻片。根據(jù)楊金龍等[3]計(jì)算稚貝的附著率以及評價(jià)其誘導(dǎo)活性的高低。

1.5　數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的差異統(tǒng)計(jì)分析和相關(guān)性檢驗(yàn)使用JMP軟件(版本 10.0.0)。使用 Spearman’多元分析方法分析細(xì)菌密度與稚貝誘導(dǎo)活性之間的相關(guān)性, 其中, P為檢驗(yàn)值, 在P<0.05時(shí)說明具有顯著性的差異; r為相關(guān)性系數(shù), 在r<0.5時(shí)說明低等水平顯著相關(guān), 在0.5≤r≤0.7時(shí)說明中等水平顯著相關(guān), 在 r>0.7時(shí)說明極其顯著相關(guān)[3]。

2　結(jié)果

2.1　腸道細(xì)菌的測序與定名

本實(shí)驗(yàn)的10株腸道細(xì)菌的菌名和上傳序列號等信息見表1。結(jié)果顯示, 10株腸道細(xì)菌共分屬9個(gè)不同的菌屬, 其中Tenacibaculum sp. 4、Winogradskyella sp.1和Nonlabens sp. 1屬于擬桿菌門, Bacillus sp. 6和Bacillus sp. 5屬于厚壁菌門, 而其他所有5株細(xì)菌均屬于變形菌門(其中Paracoccus sp. 1、Roseovarius sp.1和Ruegeria sp. 1屬于α-變形菌綱, Alteromonas sp.3和Vibrio sp. 5屬于γ-變形菌綱)。不同腸道細(xì)菌的表型如圖1。

表 1 腸道細(xì)菌16S rDNA基因序列分析Tab. 1 16S rDNA gene sequence analysis of the intestinal bacterial strains

圖1　不同腸道細(xì)菌的表型Fig. 1 Phenotypes of the different gut bacterial strains

2.2　不同的細(xì)菌初始密度下微生物被膜的形成

在不同的細(xì)菌初始密度條件下, 隨著細(xì)菌初始密度的增加, 微生物被膜的最終密度則呈現(xiàn)不同程度的增加(圖2)。在初始密度為1.0×109個(gè)/L和1.0×1010個(gè)/L時(shí), Ruegeria sp. 1形成的微生物被膜的最終密度均最高, 分別為 9.1×1010個(gè)/m2和 1.4×1011個(gè)/m2,且與所有其他細(xì)菌的微生物被膜的最終密度均表現(xiàn)出顯著性的差異(P < 0.05); Alteromonas sp. 3形成的微生物被膜的最終密度均最低, 分別為1.2×1010個(gè)/m2和 2.2×1010個(gè)/m2; 其中在初始細(xì)菌密度為 1.0×109個(gè)/L時(shí), Alteromonas sp. 3形成的微生物被膜的最終密度與 Nonlabens sp. 1之間沒有表現(xiàn)出顯著性的差異(P > 0.05), 但與其他細(xì)菌微生物被膜的最終密度均具有顯著性差異(P < 0.05); 在初始細(xì)菌密度為1.0×1010個(gè)/L時(shí), Alteromonas sp. 3與其他細(xì)菌形成的微生物被膜的最終密度均有顯著性差異(P < 0.05)。

圖2　不同初始細(xì)菌密度下形成微生物被膜的密度變化Fig. 2 The density of monospecific bacterial biofilms under different initial densities不同字母表示差異顯著(P < 0.05)。后同

在初始細(xì)菌密度為1.0×1011個(gè)/L和5.0×1011個(gè)/L時(shí), Tenacibaculum sp. 4形成的微生物被膜的最終密度均最高, 分別為 5.4×1011個(gè)/m2和 9.1×1011個(gè)/m2,且與其他所有細(xì)菌微生物被膜的最終密度均具有顯著性的差異(P < 0.05); Winogradskyella sp. 1形成的微生物被膜的最終密度均最低, 分別為 6.2×1010個(gè)/m2和 9.1×1010個(gè)/m2, 且與其他所有細(xì)菌微生物被膜的最終密度均具有顯著性的差異(P < 0.05)。結(jié)果表明,相對于其他8株細(xì)菌, Ruegeria sp. 1和Tenacibaculum sp. 4具有相對較高的微生物被膜形成能力。

2.3　腸道細(xì)菌對稚貝附著的影響

不同種屬腸道細(xì)菌所形成的微生物被膜在 24 h和48 h時(shí)間段對厚殼貽貝稚貝附著的結(jié)果與12 h時(shí)的結(jié)果無明顯差異, 12 h時(shí)間段的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。研究結(jié)果表明, 與空白對照組的稚貝誘導(dǎo)活性(14%±3%)相比, 所有試驗(yàn)的腸道細(xì)菌對稚貝的附著均具有不同程度的誘導(dǎo)活性。

Paracoccus sp. 1、Tenacibaculum sp. 4和 Bacillus sp. 6等3株細(xì)菌對稚貝的附著均具表現(xiàn)出中等程度的誘導(dǎo)作用, 其中初始細(xì)菌密度在 1.0×1010個(gè)/L時(shí),Bacillus sp. 6表現(xiàn)出最高誘導(dǎo)活性52%; 在初始細(xì)菌密度為1.0×1011個(gè)/L時(shí), Paracoccus sp. 1表現(xiàn)出最高誘導(dǎo)活性 61%; 而在初始細(xì)菌密度為 5.0×1011個(gè)/L時(shí), Tenacibaculum sp. 4對稚貝附著具有最高誘導(dǎo)活性 53%, 其余 7株腸道細(xì)菌誘導(dǎo)稚貝的附著率均在50%以下, 表現(xiàn)出低誘導(dǎo)活性。

2.4　微生物被膜的不同密度對厚殼貽貝稚貝附著的誘導(dǎo)作用

圖3　不同腸道細(xì)菌對厚殼貽貝稚貝附著的誘導(dǎo)作用Fig. 3 Percentages of settlement of M. coruscus plantigrades on the different monospecific intestinal bacterial biofilms

圖4　單一菌株形成微生物被膜的不同密度對厚殼貽貝稚貝附著的誘導(dǎo)作用Fig. 4 Percentages of settlement of M. coruscus plantigrades on monospecific bacterial biofilms of varying densities

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 隨著微生物被膜細(xì)菌密度的增多, Tenacibaculum sp. 4、Roseovarius sp. 1和Winogradskyella sp. 1等3株腸道細(xì)菌對稚貝的誘導(dǎo)活性逐漸升高(圖4), 而其余7株腸道細(xì)菌對稚貝的誘導(dǎo)活性則先升高到達(dá)最大值, 然后再降低。根據(jù)相關(guān)性分析, 其中 5株腸道細(xì)菌的稚貝附著率與形成的微生物被膜密度之間具有顯著相關(guān)性(P < 0.05)(表 2),其中, Tenacibaculum sp. 4、Roseovarius sp. 1和Winogradskyella sp. 1的微生物被膜密度和稚貝的誘導(dǎo)活性呈正顯著性相關(guān)(P < 0.05), 而Nonlabens sp. 1和Bacillus sp. 5則呈負(fù)顯著性相關(guān)(P < 0.05); 其余5株腸道細(xì)菌的稚貝誘導(dǎo)活性與形成的微生物被膜密度之間并沒有表現(xiàn)出顯著性相關(guān)(P > 0.05)。在5株顯著性相關(guān)的腸道細(xì)菌中, Tenacibaculum sp. 4、Roseovarius sp. 1、Winogradskyella sp. 1和Nonlabens sp.1所形成的微生物被膜密度與稚貝的誘導(dǎo)活性呈中等水平顯著性相關(guān)(0.5≤|r|≤0.7), 而 Bacillus sp. 5的稚貝誘導(dǎo)活性與微生物被膜密度之間的相關(guān)性相對較弱(|r| < 0.5)。

2.5　腸道細(xì)菌形成的微生物被膜的形態(tài)和厚度

高誘導(dǎo)活性和低誘導(dǎo)活性的兩株腸道細(xì)菌的聚集狀態(tài)和分布狀態(tài)顯著不同(圖 5A)。具有高誘導(dǎo)活性的Paracoccus sp. 1形成的微生物被膜比低誘導(dǎo)活性的Bacillus sp. 5形成的微生物被膜的分布更加密集(圖5A), 而且前者形成的微生物被膜膜厚(6.15 μm ±0.12 μm)顯著大于后者形成的微生物被膜膜厚(3.37 μm ±0.07 μm)(P < 0.05, 圖 5B)。

表2　微生物被膜的細(xì)菌密度與誘導(dǎo)活性之間的相關(guān)性分析Tab. 2 Correlation analyses between the bacterial density of biofilms and their inducing activity

圖 5 激光共聚焦掃描顯微鏡下Paracoccus sp. 1和Bacillus sp. 5形成的微生物被膜圖像(A)及膜厚(B)Fig. 5 CLSM reveals biofilm images (A) and biofilm thickness (B) of Paracoccus sp. 1 and Bacillus sp. 5

2.6　腸道細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

采用最大簡約法、最小進(jìn)化法和鄰接法等 3種不同的方法分析得到的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果基本一致,所以這里僅呈現(xiàn)由鄰接法分析得到的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)和遺傳距離(表 3)。結(jié)果顯示, 同屬于芽孢桿菌屬的Bacillus sp. 6和 Bacillus sp. 5之間的遺傳距離最近, 為 0.055, 兩者先聚類在一起, 但前者的誘導(dǎo)活性顯著高于后者(P < 0.05)。而后與同屬于γ-變形菌綱的兩株腸道細(xì)菌Alteromonas sp. 3和Vibrio sp. 5聚為一支, 兩者的誘導(dǎo)活性沒有顯著差異(P > 0.05),但形成微生物被膜的終密度具有顯著性差異(P < 0.05);這一分支再與同屬于 α-變形菌綱的 Paracoccus sp.1、Roseovarius sp. 1和Ruegeria sp. 1三株細(xì)菌聚為另一分支, 其中 Paracoccus sp. 1的誘導(dǎo)活性最高;而 Tenacibaculum sp. 4、Nonlabens sp. 1和 Winogradskyella sp. 1三株腸道細(xì)菌同屬于擬桿菌門, 三者先聚為一簇, 但Tenacibaculum sp. 4的誘導(dǎo)活性顯著高于另外兩株細(xì)菌(P < 0.05); 這一簇再與前一個(gè)分支聚類, 最后與外群細(xì)菌大腸桿菌聚類。由此可見,本研究中不同腸道細(xì)菌之間的親緣進(jìn)化關(guān)系符合系統(tǒng)發(fā)育的規(guī)律。

3　討論

3.1　厚殼貽貝腸道細(xì)菌的種屬

單一細(xì)菌微生物被膜是海洋無脊椎動物附著過程中極其關(guān)鍵的化學(xué)誘導(dǎo)因子[15], 本研究首次證明分離自厚殼貽貝腸道的細(xì)菌所形成微生物被膜可以有效提高其稚貝的附著率。

從野生厚殼貽貝的腸道中分離純化的腸道細(xì)菌分屬于 Paracoccus、Nonlabens、Winogradskyella、Bacillus、Roseovarius、Alteromonas、Vibrio、Tenacibaculum和Ruegeria等9個(gè)菌屬。在浸沒于嵊泗海域由三甲氧基硅烷處理的附著基表面形成的自然微生物被膜的研究[15]中, 其分離的海洋附著細(xì)菌分屬于Tenacibaculum、Staphylococcus、Vibrio、Cobetia、Pseudoalteromonas和 Bacillus等 6個(gè)菌屬; 其中,Tenacibaculum、Vibrio和Bacillus等3個(gè)菌屬在本研究中也同樣存在。研究表明, 在浸沒于自然海區(qū)的載玻片表面和野生厚殼貽貝貝殼體表形成的自然微生物被膜中, 也存在分屬于Vibrio和Tenacibaculum等2個(gè)菌屬的海洋細(xì)菌[16-17]。周軒等[6]在浸沒于嵊泗自然海域的低濕度附著基表面的自然微生物被膜中同樣分離出了Bacillus和Alteromonas 2種海洋附著細(xì)菌屬。由此可見, 一些相同的細(xì)菌菌屬分別存在于厚殼貽貝腸道的細(xì)菌類群中和自然微生物被膜的細(xì)菌類群中, 但同時(shí)兩者也具有一定的差異。此外, 研究表明[18-22], 分屬于 Paracoccus、Nonlabens、Winogradskyella、Roseovarius和Ruegeria等5個(gè)菌屬的細(xì)菌也分離自不同的自然海洋環(huán)境中。根據(jù)以上結(jié)果可推測, 從野生厚殼貽貝腸道中分離純化的10株細(xì)菌很可能來源于所處的自然海域環(huán)境。以往研究表明,腸道細(xì)菌群落源于宿主生存的外界環(huán)境[23-25], 宿主所攝食的餌料可能其腸道細(xì)菌的可能來源[24]。由此推論, 本研究中厚殼貽貝生存的外界環(huán)境在一定程度上影響了其體內(nèi)腸道中的細(xì)菌類群。

圖6　細(xì)菌16S rDNA用NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 6 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequences from bacterial isolates using the Neighbor-Joining method

表3　所測腸道細(xì)菌的遺傳距離Tab. 3 Genetic distances of the intestinal bacterial strains tested

不同種屬的細(xì)菌對海洋無脊椎動物幼蟲及稚貝的附著過程也是不一樣的。Bao等[26]研究地中海紫貽貝(Mytilus galloprovincialis)幼蟲在應(yīng)對交替單胞菌Alteromonas sp. 1的附著變態(tài)反應(yīng)時(shí), 發(fā)現(xiàn)交替單胞菌Alteromonas sp. 1對該種幼蟲的附著變態(tài)具有誘導(dǎo)作用, 同時(shí)其分泌的化學(xué)信號分子參與了幼蟲的附著變態(tài)。本研究中, 同屬于交替單胞菌屬的Alteromonas sp. 3對厚殼貽貝稚貝的附著也起到了一定的誘導(dǎo)作用。因此推測該菌屬依靠自身分泌的化學(xué)信號分子可能對不同貽貝附著都有著或高或低的誘導(dǎo)作用, 但作用機(jī)制需要進(jìn)一步的探討。張朝霞等[7]研究發(fā)現(xiàn)弧菌屬的 H-4抑制了冠瘤海鞘(Styela conopus Savigny)幼蟲的附著和變態(tài), 但本研究中發(fā)現(xiàn)弧菌屬Vibrio sp. 5卻對厚殼貽貝稚貝的附著具有一定的誘導(dǎo)作用, 因此海洋無脊椎動物幼蟲及稚貝的附著變態(tài)可能與細(xì)菌種屬并無特異性關(guān)系。此外,同屬于芽孢桿菌屬的Bacillus sp. 5和Bacillus sp. 6這兩株腸道細(xì)菌在厚殼貽貝稚貝的附著過程中具有顯著不同的誘導(dǎo)作用, 而不同種屬的Paracoccus sp.1、Tenacibaculum sp. 4和Bacillus sp. 6卻均能起到中等水平的誘導(dǎo)作用。因此, 本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了細(xì)菌種屬與海洋無脊椎動物幼蟲及稚貝的附著變態(tài)過程沒有必然的聯(lián)系, 這與之前的研究結(jié)論基本相同[17]。

3.2　厚殼貽貝腸道細(xì)菌微生物被膜的形成能力

本研究結(jié)果表明, 所有測試的腸道細(xì)菌均有形成微生物被膜的能力, 且微生物被膜的最終密度受到初始細(xì)菌密度的顯著影響。Huang和 Hadfield[27]研究表明, 細(xì)菌的微生物被膜終密度與初始密度具有顯著相關(guān)性; 此外, Tran和Hadfield[28]的研究同樣表明細(xì)菌的初始密度對微生物被膜的最終密度具有一定的影響, 這均與本研究結(jié)果一致。本研究表明,不同厚殼貽貝腸道細(xì)菌具有不同的微生物被膜形成能力, 其中Ruegeria sp. 1和Tenacibaculum sp. 4均具有較高的微生物被膜形成能力。根據(jù) Fuqua等[29]之前的研究, 細(xì)菌分泌的某些化學(xué)信號分子或其他參與群體感應(yīng)的信號物質(zhì)在微生物被膜的形成和調(diào)控過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用, 而本研究中特定菌株的成膜能力也可能與細(xì)菌分泌的化學(xué)信號物質(zhì)具有密切的關(guān)系, 但具體的作用方式及機(jī)理仍需要進(jìn)一步的深入研究。

本研究已證明, 與對照組相比所有測試腸道細(xì)菌形成的微生物被膜均對厚殼貽貝稚貝的附著具有不同程度的誘導(dǎo)活性。其中, 在初始細(xì)菌密度為1.0×1011個(gè)/L時(shí), Paracoccus sp. 1的誘導(dǎo)活性最高, Bacillus sp. 5的誘導(dǎo)活性最低。很多研究[3,6,15-17]表明, 在相同的初始細(xì)菌密度下, 不同菌株對厚殼貽貝稚貝附著的誘導(dǎo)活性不同; 在不同的初始細(xì)菌密度下, 相同菌株對厚殼貽貝稚貝的誘導(dǎo)活性也不同。這可能與上述所說的菌株自身的成膜能力或細(xì)菌自身分泌的信號分子有關(guān)。

3.3　微生物被膜形成特性與貽貝附著相互關(guān)系

微生物被膜的密度與海洋無脊椎動物的附著過程具有十分密切的關(guān)系。在單一菌株形成微生物被膜的研究中, Li等[16]發(fā)現(xiàn), 在所測試的10株海洋細(xì)菌中, 厚殼貽貝稚貝的附著過程與 9株細(xì)菌的微生物被膜密度具有顯著的相關(guān)性。而孫俊杰等[14]研究的9株測試菌株中有7株細(xì)菌的微生物被膜密度與稚貝的附著呈顯著相關(guān)。除此之外, 海洋細(xì)菌的微生物被膜密度與厚殼貽貝稚貝的誘導(dǎo)活性同樣具有顯著相關(guān)性[3]。然而, Tran和Hadfield[28]研究發(fā)現(xiàn), 鹿角杯形珊瑚(Pocillopora damicornis)幼蟲的附著僅與1株細(xì)菌(具有高誘導(dǎo)作用)的密度有顯著相關(guān)性, 其余細(xì)菌密度與其幼蟲的附著均沒有相關(guān)性。本研究所試驗(yàn)的10株腸道細(xì)菌中, 只有5株形成的微生物被膜密度與厚殼貽貝稚貝的誘導(dǎo)活性具有顯著的相關(guān)性, 說明雖然微生物被膜密度在稚貝的附著過程中具有重要的作用, 但不是適用于所有的細(xì)菌。本研究還表明, 隨著細(xì)菌密度的增加, 腸道細(xì)菌對稚貝的誘導(dǎo)活性并非完全逐漸升高, 而是可能呈先升高達(dá)到最大值后再降低的趨勢, 且最適密度取決于細(xì)菌種類。研究表明, 特定海洋細(xì)菌分泌的化學(xué)誘導(dǎo)信號分子在海洋無脊椎動物幼蟲的附著變態(tài)過程中可能發(fā)揮著一定的作用[17,28-30]。因此, 本實(shí)驗(yàn)中貽貝腸道菌株所分泌的某些化學(xué)信號分子很可能對結(jié)果產(chǎn)生一定的影響, 但具體程度及其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

微生物被膜厚度、分布和聚集狀態(tài)與海洋無脊椎動物的附著變態(tài)過程具有一定的相關(guān)性。根據(jù)Yang[17]等的研究發(fā)現(xiàn), Tenacibaculum sp. 1形成的微生物被膜的膜厚明顯大于其他細(xì)菌, 包括 Pseudoalteromonas sp. 1, 盡管這兩株細(xì)菌均呈中等的誘導(dǎo)活性; Shewanella sp. 1的誘導(dǎo)活性遠(yuǎn)高于 Pseudoalteromonas sp. 4的誘導(dǎo)活性, 但這兩株細(xì)菌形成的微生物被膜的膜厚并沒有差異性, 細(xì)菌的聚集狀態(tài)和分布狀態(tài)也不相同。在本研究中, 高誘導(dǎo)活性的Paracoccus sp. 1形成的微生物被膜比低誘導(dǎo)活性的Bacillus sp. 5形成的微生物被膜分布更加密集, 且前者的膜厚比后者厚。由此推測, 細(xì)菌的誘導(dǎo)活性可能與微生物被膜膜厚沒有相關(guān)性, 可能與其菌株自身有關(guān), 例如其分泌的胞外多糖等, 因此有必要進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析。

綜上所述, 厚殼貽貝的腸道細(xì)菌能夠不同程度地誘導(dǎo)厚殼貽貝稚貝的附著, 說明腸道細(xì)菌在厚殼貽貝的生長發(fā)育過程中具有一定的作用。同時(shí), 本研究成果為今后更深入地探討腸道細(xì)菌與厚殼貽貝之間的相互作用奠定基礎(chǔ), 也對厚殼貽貝健康生態(tài)養(yǎng)殖及該過程中相關(guān)技術(shù)的提高具有一定的指導(dǎo)意義。

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