孫香豐 代燦燦 （青島市動物園 山東 青島 266000）

多表位疫苗構(gòu)建研究進展及其獸醫(yī)臨床應(yīng)用

孫香豐 代燦燦 （青島市動物園 山東 青島 266000）

多表位疫苗(multiepitope vaccine)也稱雞尾酒式疫苗，是一種基于目標(biāo)抗原表位氨基酸序列設(shè)計的新型亞單位疫苗。根據(jù)設(shè)計方法不同，可分為線性串聯(lián)多表位疫苗、多價抗原肽表位疫苗、病毒顆粒樣疫苗等形式。根據(jù)抗原表位類型不同可分為B細(xì)胞表位疫苗、T細(xì)胞表位疫苗、混合型表位疫苗等。本文就近年來多表位疫苗構(gòu)建研究狀況和其在獸醫(yī)臨床應(yīng)用作一綜述。

1 表位的篩選和鑒定

（1）篩選、鑒定抗原表位是研制多表位疫苗的第一步。傳統(tǒng)的表位篩選、鑒定方法有酶法(化學(xué)法)、噬菌體展示技術(shù)、MHC單鏈分子結(jié)合法、合成串聯(lián)重疊肽法等。但這些方法操作復(fù)雜，費時費力成本高。所以，尋求高效低廉的表位預(yù)測方法一度成為研究的熱點。（2）隨著計算機技術(shù)和生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，通過計算機預(yù)測、模擬表位成為高效低廉的替代或輔助方法。根據(jù)已有的表位數(shù)據(jù)，計算機對氨基酸、堿基序列進行分析，從中迅速預(yù)測、篩選出潛在的抗原表位。結(jié)合已知的抗原蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測出線性和構(gòu)象表位，并以直觀圖示出來。不過相比構(gòu)象表位的預(yù)測，目前線性表位的預(yù)測結(jié)果更為精確和成熟。（3）在B細(xì)胞線性表位預(yù)測上，常采用的在線預(yù)測工具有Predicted Antigenic Peptides、BepiPred、ABCPred等。非在線預(yù)測工具中，以DNA Star軟件較為通用，預(yù)測準(zhǔn)確率可達到75%以上。這是基于對抗原性、親水性、可折疊型、表面可及性、電荷分布、二級結(jié)構(gòu)等參數(shù)的綜合分析而得出的預(yù)測結(jié)果[1]。需要注意的是，無論采用何種預(yù)測工具，預(yù)測結(jié)果與實際表位間均有一定偏差。故而，在操作時常需將多種方法結(jié)合起來以求降低預(yù)測的失誤率。（4）在T細(xì)胞線性表位預(yù)測上，基于細(xì)胞表面與MHCⅠ類分子結(jié)合的抗原表位能被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)識別，常用的在線預(yù)測工具有NetCTL、CTLPred等；基于諸如細(xì)菌、病毒抗原和免疫接種蛋白等外源蛋白經(jīng)加工后與MHCⅡ類分子結(jié)合的抗原表位可被輔助T細(xì)胞(Th)識別，常用的在線預(yù)測工具有TEPITOPE、AMPHI等[2]。（5）目前，在線預(yù)測工具對MHC I類分子結(jié)合線性表位的預(yù)測比MHCII類分子結(jié)合非線性表位預(yù)測準(zhǔn)確度高。此外，NetMHCpan、NetMHC對MHCI/Ⅱ結(jié)合表位綜合預(yù)測也有較好的效果。

2 表位疫苗的設(shè)計

在二級結(jié)構(gòu)角度，抗原表位多分布于β折疊和無規(guī)卷曲中。單個表位分子量小，缺乏穩(wěn)定的立體構(gòu)象，易被降解。多次免疫則容易造成免疫耐受[3]?；诖?，表位疫苗的精心設(shè)計顯得舉足輕重。目前常通過多表位串聯(lián)、MAP空間表位展示、脂肽模式等提高抗原抗體的親和力、增加抗原的免疫原性與穩(wěn)定性。

2.1 多表位的串聯(lián) 多表位的串聯(lián)可有效改善單個表位免疫原性弱，易降解的弱點，也能夠避免引入表位載體帶來的不確定影響。林祥梅等利用生物信息學(xué)軟件對口蹄疫病毒(FMDV)結(jié)構(gòu)蛋白VP1-VP3上可能的抗原表位進行了預(yù)測分析，并從中選出8條表位多肽偶聯(lián)載體蛋白進行合成后免疫小鼠。利用該病毒SATⅡ型陽性血清進行ELISA檢測其反應(yīng)原性。結(jié)果顯示，上述多肽均能與該陽性血清結(jié)合，具有良好的反應(yīng)原性，且其中有6組小鼠經(jīng)免后產(chǎn)生了針對該表位多肽的抗體[4]。Alexanders等合成包括10表位的多肽免疫小鼠，檢測發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)出了針對各表位的免疫應(yīng)答。他進一步指出，只有30個以上的氨基酸組成的多肽才具有較好的免疫原性，這對串聯(lián)表位的設(shè)計有一定指導(dǎo)意義[5]。

2.2 MAP空間表位展示 多聚抗原肽(multiple antigen peptides，MAP)能以較小的空間聚集高濃度的抗原表位，進而形成具有立體結(jié)構(gòu)的表位簇，大大提升了多肽數(shù)目和免疫原性。徐小潔等用MAP免疫3只小鼠，抗血清滴度可達到1∶6400～12800[6]；吳姿蓉分別設(shè)計了來自瘧原蟲孢子階段、肝組織和血液的三種瘧原蟲疫苗。然后分別在C57BL/6、BALB/c、A/J系小鼠，HLA-A2基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的C57BL/6小鼠和雜交品系(CD1)小鼠展開抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測。發(fā)現(xiàn)這三種MAP疫苗均能誘導(dǎo)明顯的體液和細(xì)胞免疫[7]。吳玉章等證實合成含有Pre-S2序列的MAP肽，經(jīng)免小鼠后誘發(fā)的免疫反應(yīng)比對照組線性肽強，表明MAP肽的結(jié)構(gòu)與抗原肽的免疫原性呈正相關(guān)[8]。由于目前MAP空間表位展示能夠使多表位有穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)和較強的免疫原性，已開始應(yīng)用于艾滋病病毒(HIV)、禽流感病毒(AIV)等病原體的新型診斷抗原和疫苗研究中，顯示出了其獨特的優(yōu)越性。但不足之處是需化學(xué)合成賴氨酸骨架和純化，制備困難，費用不菲[9]。

2.3 脂肽模式 將具有免疫佐劑活性的脂質(zhì)分子上共價連接抗原表位肽而構(gòu)建的疫苗稱為脂肽模式疫苗。具有親脂性且比較穩(wěn)定的脂質(zhì)分子可迅速被動跨膜將抗原肽導(dǎo)入胞內(nèi)。進而在佐劑作用下激發(fā)機體產(chǎn)生強烈的免疫反應(yīng)。Gallez-Hawkins認(rèn)為脂肽疫苗在抑菌、治療病毒感染及誘發(fā)粘膜免疫方面是理想的選擇[10]；Nardin EH等用脂肽P3C(lipopeptide tripalmitoyl-S-glyceryl cysteine，P3C)核心作為內(nèi)源性佐劑，通過肟鍵將B、T細(xì)胞表位與水溶性的脂肽P3C緊密連接，制成的聚肟疫苗具有四分枝結(jié)構(gòu)，基于此，即便沒有任何外源性佐劑，其依然具有良好免疫原性[11]。

2.4 旁側(cè)序列的修飾 （1）引入間隔序列使表位和表位間有一定間隔，在保證表位獨立性的同時又不產(chǎn)生新的表位，間接提高了蛋白酶的切割效率和抗原呈遞效率。Livingston在表位間插入序列“GPGPG”的柔性肽消除了對表位呈遞的影響，避免了在表位連接處新表位的形成，和對原有表位的影響[12]。Velders等實驗證實，“AAY”氨基酸序列作為間隔肽，是蛋白酶優(yōu)先切割位點，插入到表位間可提高表位被切割的效率[13]。（2）將通用T細(xì)胞表位引入多表位疫苗的側(cè)翼序列中能相對減輕MHC分子限制性，進而在不同個體中誘導(dǎo)出免疫應(yīng)答。石統(tǒng)東等在HBV治療性多表位疫苗中引入“Th+B”細(xì)胞表位以及3個Ala間隔序列，發(fā)現(xiàn)針對CTL表位肽的免疫反應(yīng)增強[14]。（3）MHC分子與表位的結(jié)合是特異性的，可以識別一系列具有某些共同特性的肽段，唐艷將黑色素瘤相關(guān)抗原MART1/Melan A(27-35)(AAGIGILTV)表位的P1位由L替換為A，提高了表位的免疫原性。所以，旁側(cè)序列的修飾對于表位疫苗的研發(fā)有著重要作用[15]。

3 多表位疫苗載體的選擇

單一的表位多肽分子量較小，免疫原性較差，缺少穩(wěn)定的立體構(gòu)象，易被降解，在實際中常需借助一定的載體才能更好的發(fā)揮免疫作用。載體的選擇要安全有效，盡量不破壞原有構(gòu)象或干擾抗原分子的空間結(jié)構(gòu)。常見的載體有蛋白質(zhì)載體、脂質(zhì)載體和一些佐劑類。

3.1 蛋白質(zhì)載體 （1）目前蛋白質(zhì)載體使用最為廣泛，其中以乙肝病毒核心蛋白(HBc)最具代表性。乙肝病毒的核心蛋白N端、C端和主要免疫顯性區(qū)域 (MIR) 允許一定程度的缺失和外源插入，并且能夠?qū)⑼庠葱蛄兄貜?fù)且高密度地暴露在顆粒的表面，從而誘發(fā)強烈的外源序列特異的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)[16]，這些特點為其作為蛋白質(zhì)載體奠定了絕佳的基礎(chǔ)。（2）Gregson AL等在HBc MIR區(qū)的78、79位氨基酸之間插入惡性瘧原蟲免疫顯性B細(xì)胞表位[(NANP)3] 和一個人類白細(xì)胞抗原(HLA)限制性CD4+表位(NANPNVDPNANP)，并在HBc的149位氨基酸后融合一個通用T細(xì)胞表位(326-345AA)，從而實現(xiàn)了ICC-1132抗瘧疾疫苗的研發(fā)成功，并于2008年完成在美國的I期臨床研究[17]。截至目前，人們還發(fā)現(xiàn)了許多有病毒顆粒樣結(jié)構(gòu)(VLPs)的外源抗原表位表達載體系統(tǒng)，如重組桿狀病毒中表達的HIV-1 gag蛋白載體系統(tǒng)、HBV核心抗原(HBcAg)和HBsAg載體系統(tǒng)、輪狀病毒(RV)Vp6蛋白載體系統(tǒng)等。此外，牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)等大蛋白也可作為表位疫苗的蛋白載體。2000年以后，一些特定尺寸的納米材料也在被嘗試用作表位載體[18]。

3.2 脂質(zhì)載體 脂質(zhì)分子作為載體連接在抗原肽的末端，使抗原容易被遞呈細(xì)胞識別，而且本身具有生物學(xué)活性，無毒性易降解。脂質(zhì)載體不僅能避免表位降解而且能增強免疫應(yīng)答反應(yīng)。Kohyama等利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測出冠狀病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp1a的T細(xì)胞表位，再將其偶聯(lián)到脂質(zhì)體后免疫小鼠，檢測發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)冠狀病毒特異性的CTL細(xì)胞和記憶性細(xì)胞的產(chǎn)生[19]。

4 佐劑

氫氧化鋁佐劑和弗氏(完全/不完全)佐劑和是目前常用的疫苗佐劑。Tigno Aranjuez等將兩種MHC I類分子限制性的多肽經(jīng)完全弗氏佐劑(CFA)乳化后免疫C57BL/6J小鼠，發(fā)現(xiàn)CFA作為佐劑能夠誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生明顯的增殖和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，并能誘導(dǎo)產(chǎn)生γ-干擾素、IL-2和IL-17等[20]。Wang等報道將丙肝病毒抗原多肽與氫氧化鋁佐劑混合免疫小鼠，誘導(dǎo)抗體效價可達到1∶51200，還能引起CD19+、CD38+、IL-6、IL-10等的產(chǎn)生[21]。

5 在獸醫(yī)臨床方面的應(yīng)用

多表位疫苗在獸醫(yī)臨床預(yù)防、治療病毒性疾病過程中有著重要作用。

5.1 禽流感病毒(AIV) 禽流感病毒囊膜蛋白可發(fā)生抗原漂移和重組，傳統(tǒng)疫苗很容易無效，多表位疫苗可以克服這一缺點。李崢用原核表達禽流感病毒HA基因3個中和表位(HA92-105、HA127-133、HA183-195)的重組多表位肽，經(jīng)免小鼠和兔子后均產(chǎn)生了高滴度的中和抗體[22]；Thomson構(gòu)建了包含10個CTL抗原表位的真核重組質(zhì)粒，質(zhì)粒免疫小鼠后，這些表位使得CTL應(yīng)答增強并對感染禽流感病毒有較強清除作用[23]。

5.2 口蹄疫病毒(FMDV) 邵軍軍等用化學(xué)法合成了FMDV VP1基因140-160及200-213位肽段基因片段，構(gòu)建串聯(lián)重復(fù)表位于IgG的重鏈恒定區(qū)，免疫仔豬30天后檢測到高滴度的抗體，免疫效果良好。

5.3 水貂腸炎病毒(MEV) 卞大偉將預(yù)測篩選出得到CDV N、F、H蛋白和MEV VP2蛋白的5個優(yōu)勢B細(xì)胞線性表位洗牌重組，在表位間插入柔性肽間隔，原核表達重組蛋白免疫小鼠，HA-HI實驗和Western Blot檢驗三免后血清，均產(chǎn)生高滴度抗體[25]。

6 面臨的問題和展望

（1）疫苗接種是目前有效防控病毒性疾病的方式之一，常見的滅活疫苗和弱毒活疫苗有著一些難以克服的弊端，諸如熱不穩(wěn)定性、毒力返強返祖、體外培養(yǎng)困難、潛在生物危害風(fēng)險以及在由于病毒變異導(dǎo)致的疫苗無效等問題。針對這些弊端，新型疫苗應(yīng)運而生。（2）多表位疫苗作為一種新型亞單位疫苗，具有安全無毒、穩(wěn)定可控等優(yōu)勢。在治療SARS、HIV、HBV等病毒研究方面更是首選。目前多表位疫苗在獸醫(yī)實驗室研究上方興未艾，在臨床應(yīng)用方面還處于初級階段，面臨著一些亟待解決的問題：與蛋白抗原相比，串聯(lián)線性表位肽免疫原性仍不夠好，很難引起較強的免疫應(yīng)答以獲得長期的免疫力。臨床免疫效果與傳統(tǒng)疫苗仍有一定差距；表位疫苗研究多集中于線性表位，對構(gòu)象表位的研究篩選準(zhǔn)確性尚待提高；佐劑的使用一定程度上會增加表位疫苗的副作用；多肽合成以及純化技術(shù)的局限性也增加了表位疫苗的使用風(fēng)險；對于動物病毒而言，表位研究的不均衡也是在表位疫苗研究中存在的一個問題。如口蹄疫病毒主要集中于主要集中于B細(xì)胞表位和Th細(xì)胞表位的研究，對CTL細(xì)胞表位的研究仍處于空白。

針對上述問題，表位疫苗的研究要要進一步探索新的、更有效的研究方法。隨著生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，可以預(yù)見表位疫苗在今后的應(yīng)用前景將越來越廣闊。

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