陳脊宇

（重慶三峽職業(yè)學院，重慶 萬州 404155）

雞傳染性支氣管炎S1蛋白的基因工程疫苗研究進展

陳脊宇

（重慶三峽職業(yè)學院，重慶 萬州 404155）

雞傳染性支氣管炎（IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病，給養(yǎng)雞業(yè)帶來極大的經(jīng)濟損失。IBV基因編碼的主要結(jié)構(gòu)蛋白為核衣殼蛋白（N）、表面纖突蛋白（S）、小膜蛋白（E）和膜蛋白（M），其中S1蛋白是主要的保護抗原蛋白，同樣是當前疫苗研究的重點。本文就表達S1蛋白的IBV疫苗研究進展作以綜述。

IB是高度接觸性并嚴重危害家禽的一種傳染病，世界范圍流行，是世界動物衛(wèi)生組織認定的B類疫病，我國認定的二類疫病。IBV主要侵害l～4周齡的雛雞，侵害生殖系統(tǒng)后易發(fā)生輸卵管炎，出現(xiàn)“假母雞”或無產(chǎn)蛋高峰等現(xiàn)象；產(chǎn)蛋雞如果感染IBV后，不但會導致產(chǎn)蛋率下降，而且還會出現(xiàn)產(chǎn)軟殼蛋和畸形蛋的現(xiàn)象。另外，IBV的基因組極易發(fā)生變異，使IBV的血清型逐年增多，已確定的血清型就有30多種，且不同的血清型只有少部分交叉免疫性甚至沒有，因此在臨床應用中IBV經(jīng)常免疫失敗，使得該病的防控極為困難。IBV是正鏈單股RNA病毒，其中編碼的S1蛋白不僅能產(chǎn)生中和抗體、血凝抑制抗體及細胞免疫應答，還能誘導抗致病性毒株攻擊的保護作用[1-2]。因此，S1蛋白成為IBV基因工程疫苗研究重要靶蛋白。

1 亞單位疫苗

Song等構(gòu)建了表達S1基因重組桿狀病毒，雖然有一定的保護作用，但免疫效果遠遠不及滅活疫苗[3]。Jie等分別用改良的BacMam株桿狀病毒構(gòu)建了表達IBV M41株的S1基因的重組病毒，其保護率雖然有所提高，但仍不能完全替代滅活疫苗[4]。將IBV H株S1基因用甲醇營養(yǎng)型酵母表達載體進行同步表達，但表達產(chǎn)物糖基化程度很差，致使亞單位疫苗免疫原性較差[5-6]。隨后Asadpour等換用IBV 793/B菌株的S1基因插入pPICZαA載體轉(zhuǎn)染畢赤酵母進行表達，但效果仍不理想[7]。因此，亞單位疫苗雖然表達蛋白反應原性很好，但其表達后蛋白分子量小于天然蛋白，免疫原性也欠佳，無法達到有效的保護率。這可能是由于各種表達系統(tǒng)不具備與哺乳動物細胞完全相似的識別和修飾N-糖基化位點的能力，使S1基因表達產(chǎn)物糖基化程度很差引起的。

2 核酸疫苗

DNA疫苗自身有著許多突出的優(yōu)點：疫苗本身方便設計、構(gòu)建成本非常低、DNA疫苗穩(wěn)定性好、容易保存、免疫效果顯著。自1990年出現(xiàn)DNA疫苗后，研究人員熱衷于研究各種DNA疫苗，IBV也不例外。Kapczynski等率先成功研制出了表達S1蛋白的DNA疫苗（pDKArkS1-DPI），結(jié)果表明，單用DNA疫苗達不到理想的保護率，需用弱毒苗加強免疫，這就復雜了免疫程序，不利于實際應用[8]。在此基礎上進行了各種改進，構(gòu)建同時含有多個保護性抗原蛋白的疫苗，如同時編碼IBV S1、N、和M蛋白的保護性DNA疫苗，結(jié)果表明，疫苗雖然增強了體液免疫和細胞免疫的保護效果，但仍需滅活疫苗加強免疫才能獲得滿意的免疫保護率[9-10]。研究表明，構(gòu)建攜帶IBV S1基因和N基因DNA疫苗，通過口腔和鼻腔進行免疫，該疫苗雖然能夠引起大量體液和黏膜免疫反應，但保護效率低[11]。構(gòu)建DNA疫苗時插入IBV S1目的基因的同時加入細胞因子的基因，如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF），這種DNA疫苗只針對腎型雞傳支起到有效的保護，其他類型的雞傳支保護率低[12-13]。添加IL-1β、IL-16基因真核表達質(zhì)粒作為分子佐劑，可以達到高于傳統(tǒng)疫苗的免疫水平，但維持時間太短[14]。盡管DNA疫苗研究的較多，但實際應用卻存在著特殊的潛在安全性問題，如DNA疫苗有誘發(fā)腫瘤和異常的自身免疫的可能，目前無法確定DNA疫苗能否在體內(nèi)低水平與宿主基因組進行整合。因此，DNA疫苗是否安全需要進一步認定。

3 病毒活載體疫苗

活載體疫苗的宿主免疫途徑與自然感染相似，保證了免疫效果的同時避免了重組亞單位疫苗和滅活疫苗中的許多缺點，因此重組活載體疫苗是當下IBV基因工程疫苗研究的熱點。

田占成等研究表明，重組病毒中S1蛋白糖基化完全且能夠穩(wěn)定遺傳，但重S1抗原表達量不高，免疫保護作用不及弱毒疫苗，為了提高免疫效果，在此基礎上加入細胞因子的基因來增強細胞免疫，但痘病毒有少量殘留的毒性，一定程度上抑制了雛雞的生長和疫苗的免疫應答[15]。重組IBV S1痘病毒疫苗只能通過肌肉注射免疫，費時費力，且難以大量生產(chǎn)，不易推廣應用，因此需更換其他穩(wěn)定安全方便的病毒載體。分別用桿狀病毒、禽痘病毒和腺病毒作為載體，構(gòu)建了IBV S1重組活載體疫苗，但結(jié)果都不理想。耿合員等選擇了缺陷型人5型腺病毒為載體進行構(gòu)建，病毒雖然生長良好，重組活載體疫苗免疫效果好，但缺陷型人5型腺病毒在淋巴組織內(nèi)持續(xù)性感染，安全性存在一定爭議，限制了推廣應用[16]。選擇了天然穩(wěn)定的新城疫弱毒株構(gòu)建了表達IBV S基因的重組活載體疫苗，免疫新城疫的同時，進行IBV的免疫，減少免疫程序，省時方便，構(gòu)建好的重組活載體疫苗連續(xù)傳代后可穩(wěn)定表達完整的S蛋白，且保持了新城疫弱毒株低致病性和高滴度生長的優(yōu)點，但外源基因插入位點影響了基因表達量及病毒復制，因此在外源基因插入的位點和大小需要進一步研究。

4 展望

雞傳染性支氣管炎的防制主要為疫苗接種，傳統(tǒng)疫苗在安全性、有效性以及成本等方面都存在一定的缺陷，已經(jīng)研究的基因工程疫苗中亞單位疫苗免疫效果不如傳統(tǒng)疫苗，DNA疫苗雖然能起到有效的保護，卻存在著潛在安全性問題，目前只有重組活載體疫苗在誘導免疫應答方面雖有所提高，但所選擇的載體在其安全性或經(jīng)濟實用等方面存在不足。因此，在構(gòu)建IBV基因工程疫苗方面，選擇安全高效，經(jīng)濟實用的活病毒載體還有待于進一步探討。

[1] Tan B,Wang H N,Shang L Q.Coadministration of chicken GM-CSF with a DNA vaccine expressinginfectious bronchitis virus(IBV)S1 gly?coprotein enhances the specific inmmune response and protectsagainst IBV infection[J].Arch Virol,2009,154（7）:1 117-1 124.

[2] 王春麗,王宏俊.雞傳染性支氣管炎病毒S1基因的原核表達及生物活性分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2010,38（20）:10 692-10 694.

[3] Song C S，Lee Y J，Lee C W，et al.Induction of protective immuni?ty in chickens vaccinated with infectious bronchitis virus S1 glycopro?tein expressed by a recombinant baculovirus[J].Gen Virol,1998,79:719-723.

[4] Zhang J,Chen X W,Tong T Z,el at.BacMam virus-based surface dis?play of the infectious bronchitis virus(IBV)S1 glycoprotein confers strong protection against virulent IBVchallenge in chickens[J].Vac?cine,2014,32:664-670.

[5] 黃亞東,鄭青,王林川,等.IBV廣東分離株GD05 S1基因的克隆、鑒定及其表達[J].中國病毒學報,2002,17（3）:266-269.

[6] 黃亞東,鄭青,李校堃,等.雞傳染性支氣管炎病毒H株纖突蛋白S1基因的克隆及其在畢赤酵母中表達[J].病毒學報,2003,19（2）:144-192.

[7] Asadpour L,Goudarzi H,Keyvanfar H,el at.Molecular cloning of S1 glycoprotein gene of infectious bronchitis virus(IBV)serotype 793/B in secretory Pichia pastoris vector[J].African Journal of Biotechnology,2010,9(51):8 722-8 725.

[8] Kapczynski D R,Hi lt D A,Shapiro D,et al.Protection of chickens from infectious bronchitis by in ovo and intramuscular vaccination with a DNA vaccine expressing the S1 glycoprotein[J].Avian Dis,2003,47（2）:272-285.

[9] Yan F,Zhao Y,Hu Y,el at.Protection of chickens against infectious bronchitis virus with a multivalent DNA vaccine and boosting with an inactivated vaccine[J].J Vet Sci,2013,14（1）:53-60.

[10] Guo Z,Wang H,Yang T.Priming with a DNA vaccine and boosting with an inactivated vaccine enhance the immune response against in?fectious bronchitis virus[J].J Virol Methods,2010,167（1）:84-89.

[11] Jiao H,Pan Z,Yin Y,et al.Oral and nasal DNA vaccines delivered by attenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium induce a protec?tive immune response against infectious bronchitis in chickens[J].Clin Vaccine Immunol,2011,18（7）:1 041-1 045.

[12] Tan B,Wang H,Shang L,el at.Coadministration of chicken GM-CSF with a DNA vaccine expressing infectious bronchitis virus(IBV)S1 gly?coprotein enhances the specific immune response and protects against IBV infection[J].Archives of Virology,2009,7（154）:1 117-1 124.

[13] Zeshan B,Mushtaq M H,Wang X,et al.Protective immune responses induced by in ovo immunization with recombinant adenoviruses ex?pressing spike(S1)glycoprotein of infectious bronchitis virus fused/coadministered with granulocyte-macrophage colony stimulating factor[J].Rejuvenation Research,2011,148（1）:8-17.

[14] Zhou Y,Zhou M,Zhang D,et al.Immune response of AA broilers to IBV H120 vaccine and sodium new houttuyfonate[J].Research in Vet?erinary Science,2010,89（3）:373.

[15] 田占成,孫永科,王云峰,等.表達雞傳染性支氣管炎病毒S1基因重組雞痘病毒對SPF雞的免疫保護作用[J].畜牧獸醫(yī)學報,2006,6:580-587.

[16] 耿合員,孫元,韓宗璽,等.表達雞傳染性支氣管炎病毒S1基因重組腺病毒的構(gòu)建[J].中國預防獸醫(yī)學報,2011,33（3）:173-176.

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1001-0084（2017）08-0058-02

2017-07-01

陳脊宇（1989-），女，重慶人，主要從事預防獸醫(yī)、基礎獸醫(yī)學教學和研究。