官德義，王再興，羅 英，徐小萬，宋占鋒，何水林*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院 350002； 2.福建省惠安縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所；3.福建省三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院； 4.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所；5.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝所)

高溫高濕下辣椒抗病分子機制及其遺傳改良技術(shù)與應(yīng)用

官德義1，王再興2，羅 英3，徐小萬4，宋占鋒5，何水林1*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院 350002； 2.福建省惠安縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所；3.福建省三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院； 4.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所；5.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝所)

高溫高濕環(huán)境下病害嚴(yán)重發(fā)生是導(dǎo)致我國南方辣椒露地栽培和設(shè)施栽培減產(chǎn)的重要障礙因素。該文對辣椒應(yīng)答高溫高濕脅迫和病原菌侵染的分子機制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了以CaWRKY40為中心的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在辣椒耐高溫、抗病及高溫高濕下抗病表現(xiàn)中起重要的調(diào)節(jié)作用。在此基礎(chǔ)上建立了病圃與高溫高濕處理相結(jié)合的生態(tài)壓力選擇法與CaWRKY40轉(zhuǎn)錄表達(dá)量相結(jié)合的資源篩選體系，對通過有性雜交、誘變等創(chuàng)制的中間材料實施在高溫高濕環(huán)境下的抗病資源篩選與新品種選育，選育出的辣椒新品種均表現(xiàn)出在高溫高濕環(huán)境下較高的抗病水平，適合在我國南方地區(qū)進(jìn)行露地栽培或設(shè)施栽培。

辣椒；高溫高濕；抗病性；生態(tài)壓力選擇；育種

Abstract: Severe disease damage under hot and humid environment is the important factor which reduces the yield of pepper cultivated in open field and greenhouse in south of our country. In this study, the molecular mechanism for pepper response to high temperature and humidity and pathogen infection was studied, and the functions of CaWRKY40 transcription and regulation in pepper heat-tolerance, disease-resistance, and disease-resistance under high temperature and humidity condition had been summayized. On the above basis, the pepper varieties selection were established by ecological pressure selection, based on diseased nursery and high temperature and humidity treatment, combined with levels of CaWRKY40 transcription and expression. A series of new Minjiao pepper varieties were bred by selection on various pepper germplasm resources obtained by sexual hybridization and mutation, and all of them were highly resistant to diseases under hot and humid environment, which could be applied in south China in open and protected cultivation.

Keywords: Pepper; high temperature and humidity; disease resistance; ecological pressure selection; breeding

辣椒在我國播種面積僅次于大白菜，也是產(chǎn)值較大的蔬菜作物之一。近年來，我國辣椒生產(chǎn)的經(jīng)濟效益逐年提高，帶動了辣椒生產(chǎn)面積特別是設(shè)施生產(chǎn)面積的迅速擴大。在我國各辣椒產(chǎn)區(qū)，特別在華南和西南等辣椒產(chǎn)區(qū)，露地栽培辣椒的生長季節(jié)在4-6月，正值高溫高濕時期，土傳病害的發(fā)病率在20%～80%，常常導(dǎo)致辣椒的減產(chǎn)甚至絕收，嚴(yán)重影響辣椒產(chǎn)量和效益。在近年來迅速發(fā)展的冬春季設(shè)施栽培辣椒生產(chǎn)中，受高溫高濕環(huán)境的影響，辣椒白粉病、疫病、菌核病等發(fā)病日益嚴(yán)重。雖然施用農(nóng)藥可在一定程度上緩解病害危害，但不可避免地帶來成本升高、環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留等問題。培育和推廣應(yīng)用抗病品種是解決辣椒病害問題最為經(jīng)濟有效的技術(shù)對策。然而，長期以來，在辣椒育種中對高溫高濕環(huán)境下抗病問題沒有給予足夠重視，缺乏有效的技術(shù)，辣椒高溫高濕病害嚴(yán)重發(fā)生的問題未能有效解決。因此，開展高溫高濕下辣椒抗病遺傳改良技術(shù)策略的創(chuàng)新和應(yīng)用是當(dāng)前和今后的重要課題。

1 高溫高濕環(huán)境下辣椒抗病分子機制研究

1.1辣椒耐高溫高濕和抗病偶聯(lián)假說

辣椒是典型的茄科植物，適合在溫暖季節(jié)的旱地種植，但由于疫霉和青枯菌等土壤傳播病害多，在春夏季高溫高濕環(huán)境下，一方面促進(jìn)了病原菌的發(fā)生和發(fā)展；另一方面則可能造成植株的生長勢弱，導(dǎo)致辣椒病害發(fā)生嚴(yán)重。高溫高濕和病害構(gòu)成了辣椒進(jìn)化過程中的外部環(huán)境選擇壓力。據(jù)此，提出辣椒耐高溫高濕和抗病偶聯(lián)假說，即辣椒在高溫高濕發(fā)病嚴(yán)重的自然選擇壓力下進(jìn)化，形成其應(yīng)答高溫高濕和病原菌侵染防御反應(yīng)之間的彼此關(guān)聯(lián)和高溫高濕環(huán)境下抗病機制[1-4]。

1.2CaWRKY40介導(dǎo)的辣椒協(xié)同應(yīng)答高溫高濕和抗病的分子機制

通過開展辣椒協(xié)同應(yīng)答高溫高濕和病原菌侵染的信號通路的分子剖析，發(fā)現(xiàn)了CaWRKY40、CaWRKY6、CaWRKY27、CaCDPK15、CabZIP63、CaROP1等基因在青枯菌或疫霉等病原菌的侵染下或高溫高濕處理下表達(dá)均上調(diào)，這些基因在煙草中過量表達(dá)可顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草植株對高溫高濕的耐性和對青枯菌接種的抗性；相反，當(dāng)這些基因發(fā)生病毒誘導(dǎo)的基因沉默時，辣椒植株耐高溫高濕和抗青枯菌接種的水平顯著降低。與上述結(jié)果相對應(yīng)的是，過敏反應(yīng)相關(guān)標(biāo)記基因(HIN1，HSR515等)、SA通路相關(guān)的PR基因、JA通路相關(guān)的PR基因等的表達(dá)均發(fā)生相應(yīng)的變化，即在CaWRKY40、CaWRKY6、CaWRKY27、CaCDPK15、CabZIP63、CaROP1等過量表達(dá)條件下表達(dá)上調(diào)，但在上述基因沉默的辣椒植株中表達(dá)下調(diào)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)CaWRKY40基因受高溫高濕或青枯菌接種的轉(zhuǎn)錄受到CaWRKY6和CabZIP63的直接調(diào)控，受到CaROP1和CaCDPK15間接調(diào)控，而且CaWRKY40可結(jié)合到CaWRKY27、CaCDPK15、CabZIP63等基因啟動子及CaWRKY40本身的啟動子，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)，構(gòu)成一系列正反饋調(diào)節(jié)環(huán)。

CaWRKY40可調(diào)節(jié)辣椒中71個WRKY轉(zhuǎn)錄因子中的59個的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，且對28個R蛋白、LRR激酶受體蛋白的編碼基因，以及SA、JA、ET、ABA、IAA和CKT等信號通路中多個調(diào)節(jié)蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)錄起重要調(diào)節(jié)作用[1-4]，CaWRKY40的靶基因中還含有HAD、HAC等與植物染色體結(jié)構(gòu)修飾及表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)有關(guān)的蛋白的編碼基因，且受到CaWRKY40的轉(zhuǎn)錄調(diào)控(本課題組未發(fā)表資料)。這些結(jié)果均表明CaWRKY40在辣椒耐高溫高濕和抗病中起重要調(diào)節(jié)作用，強化CaWRKY40介導(dǎo)的信號通路可能是開展辣椒高溫高濕環(huán)境下抗病遺傳改良的重要途徑。

因此，在辣椒中存在協(xié)同應(yīng)答高溫高濕和抗病的機制，在高溫高濕環(huán)境下CaWRKY40的表達(dá)量升高，不僅有利于提高辣椒的耐高溫高濕水平，還可提高辣椒的抗病水平。

2 辣椒遺傳改良技術(shù)策略與應(yīng)用

2.1建立和應(yīng)用辣椒多病圃高溫高濕生態(tài)壓力選擇技術(shù)，結(jié)合辣椒根部CaWRKY40轉(zhuǎn)錄表達(dá)驗證，篩選辣椒在高溫高濕環(huán)境下表現(xiàn)抗病的種質(zhì)資源

鑒于辣椒中存在著協(xié)同應(yīng)答高溫高濕和病原菌侵染或在高溫高濕環(huán)境下表現(xiàn)抗病的分子機制。因此，通過人工設(shè)置高溫高濕和病原菌侵染的環(huán)境，可以篩選出在高溫高濕環(huán)境下表現(xiàn)抗病的種質(zhì)資源。項目組針對辣椒土傳病害多的特點，在福建泉州、三明，廣東廣州和四川成都等地建立辣椒連作病圃(連作5年以上)，在春季大棚和露地栽培中營造高溫高濕環(huán)境，促進(jìn)辣椒發(fā)病，借此開展辣椒在高溫高濕環(huán)境下抗病資源的篩選。鑒于各地自然條件的差異，辣椒病原生理小種不同，多病圃生態(tài)壓力選擇有利于提高篩選結(jié)果的穩(wěn)定性。

2.2挖掘高溫高濕環(huán)境下抗病辣椒種質(zhì)資源，構(gòu)建新品種選育的核心親本種質(zhì)資源

從1998年開始，項目組從國內(nèi)(包括臺灣地區(qū))及國外(美國、韓國、墨西哥、巴西、印度尼西亞、印度、巴基斯坦、泰國)廣泛收集到500多份辣椒種質(zhì)資源。此外，還利用辣椒作為常異花授粉作物的天然異交特性，系統(tǒng)選擇優(yōu)良自交系；或采取自交系輻射誘變等多種手段，創(chuàng)造廣泛變異。

對現(xiàn)有的1000多份辣椒種質(zhì)資源材料實施多病圃高溫高濕環(huán)境下發(fā)病生態(tài)壓力選擇，最終發(fā)現(xiàn)有147份種質(zhì)資源在高溫高濕環(huán)境下表現(xiàn)抗病，其中：對青枯病表現(xiàn)中抗的資源有38份，抗的資源有14份，高抗的資源有9份；對疫病表現(xiàn)中抗的有48份，抗的有23份，高抗的有15份。以上資源構(gòu)成了高溫高濕環(huán)境下抗病辣椒育種的核心種質(zhì)資源。

2.3創(chuàng)制高溫高濕環(huán)境下抗病的辣椒及主要農(nóng)藝性狀優(yōu)異的新種質(zhì)，構(gòu)建新品種選育的直接或間接親本

從上述核心種質(zhì)中初選出79-5、79-7C-3-CS1、68-2、76B-5、69-9-2、42-3-A-1-2-1-1、HN42-2-1-CS2、101-1-C-2-3-CS1、YN10-1-1-9、GZ03-1-1-CS1、DFF-62-2-CS1、GZC13-109-2-1、GZC13-88-2-1-2等 65份在高溫高濕環(huán)境下表現(xiàn)抗病的辣椒種質(zhì)資源，繼續(xù)開展高溫高濕環(huán)境下病圃篩選，分別篩選出高溫高濕環(huán)境下抗病兼具豐產(chǎn)性狀的單株26個，分單株留種，并依次對選留的單株進(jìn)行連續(xù)5、6代的自交純合和系統(tǒng)選擇，育成36份在高溫高濕環(huán)境下表現(xiàn)抗病性強、早熟、豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的辣椒新品系，用作高溫高濕環(huán)境下抗病辣椒新品種選育的直接親本。

3 高溫高濕環(huán)境下抗病新品種的選育及其推廣應(yīng)用

以上述高溫高濕環(huán)境下抗病的辣椒及主要農(nóng)藝性狀優(yōu)異的新種質(zhì)作為親本，選育出閩椒1號、閩椒2號、閩椒3號、閩椒4號、明椒3號、明椒4號、明椒5號、明椒6號、川騰6號、川騰9號等辣椒新品種。選育出的新品種不僅產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)，且均表現(xiàn)出一定的耐高溫高濕特性，以及在高溫高濕環(huán)境下表現(xiàn)抗病，適合在我國南方春夏季露地種植，或作為設(shè)施栽培品種，已經(jīng)在福建、江西、廣東和四川等省份大面推廣應(yīng)用，取得了良好的經(jīng)濟效益、生態(tài)效益和社會效益。

[1]DANG F F，WANG Y N，YU L，et al.CaWRKY40, a WRKY protein of pepper, plays an important role in the regulation of tolerance to heat stress and resistance to Ralstonia solanacearum infection[J].Plant Cell Environ，2013，36(4)：757-774.

[2]SHEN, L，LIU Z，YANG S，et al.Pepper CabZIP63 acts as a positive regulator during Ralstonia solanacearum or high temperature-high humidity challenge in a positive feedback loop with CaWRKY40[J].J Exp Bot，2016，67(8)：2439-2451.

[3]SHEN L，YANG S，YANG L，et al.CaCDPK15 positively regulates pepper responses to Ralstonia solanacearum inoculation and forms a positive-feedback loop with CaWRKY40 to amplify defense signaling[J]. Sci Rep，2016(6)：22439.

[4]CAI H，YANG S，YANG Y，et al.CaWRKY6 transcriptionally activates CaWRKY40, regulates Ralstonia solanacearum resistance, and confers high-temperature and high-humidity tolerance in pepper[J].J Exp Bot，2015，66(11)：3163-3174.

(責(zé)任編輯：林玲娜)

Molecularmechanismofdiseaseresistanceforpepperanditsgeneticimprovementmeasuresandapplicationunderhotandhumidenvironment

GUAN De-yi1, WANG Zai-xing2, LUO Ying3, XU Xiao-wan4, SONG Zhan-feng5, HE Shui-lin1*

(1.CollegeofCropScience,FujianAgricultureandForestryUniversity,FujianProvince350002; 2.Hui’anInstituteofAgriculturalSciences,FujianProvince; 3.SanmingInstituteofAgriculturalSciences,FujianProvince; 4.VegetableResearchInstitute,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,GuangdongProvince; 5.HorticulturalInstitute,SichuanAcademyofAgriculturalScience,SichuanProvince)

2017-05-29

官德義，男，1964年生，實驗師。

*通訊作者：何水林，男，1965年生，教授 (E-mail：shlhe201304@aliyun.com)。

國家基金面上項目(31372061、31572136)；福建省第二輪種業(yè)工程項目(2014s1477-23)；福建省重大科技專項(2013NZ0002-3)。

10.13651/j.cnki.fjnykj.2017.06.025