張娟娟，陳英紅，林旭紅

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院，河南開封475000)

超聲靶向微泡破壞聯(lián)合脂質(zhì)體介導(dǎo)pSilencer 3.1-SATB1基因轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞效果觀察

張娟娟，陳英紅，林旭紅

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院，河南開封475000)

目的 探討超聲靶向微泡破壞(UTMD)聯(lián)合脂質(zhì)體介導(dǎo)的沉默特異性核基質(zhì)蛋白1基因(pSilencer3.1-SATB1)對(duì)人前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效果。方法 體外培養(yǎng)人前列腺癌雄激素非依賴型細(xì)胞株DU145，分為對(duì)照組、微泡組、超聲組、超聲+微泡組、脂質(zhì)體組、超聲+微泡+脂質(zhì)體組。微泡組加入適量微泡，超聲組僅給予超聲輻照，超聲+微泡組加入微泡后予以超聲輻照，脂質(zhì)體組加入脂質(zhì)體，超聲+微泡+脂質(zhì)體組加入微泡、脂質(zhì)體后予以超聲輻照，對(duì)照組不做任何處理。24 h后采用流式細(xì)胞儀觀察各組增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)表達(dá)，并檢測(cè)EGFP熒光細(xì)胞的比例，計(jì)算基因轉(zhuǎn)染率以評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果 熒光顯微鏡下，超聲+微泡+脂質(zhì)體組可見大量EGFP表達(dá)，明顯多于其他各組。對(duì)照組、微泡組、超聲組、超聲+微泡組、脂質(zhì)體組、超聲+微泡+脂質(zhì)體組基因轉(zhuǎn)染率分別為0.18%±0.09%、0.25%±0.11%、1.14%±0.13%、2.96%±0.16%、3.99%±0.12%、7.16%±0.17%，超聲+微泡+脂質(zhì)體組的基因轉(zhuǎn)染率高于其他各組(P均<0.05)。結(jié)論 UTMD可增強(qiáng)脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒pSilencer3.1-SATB1對(duì)DU145細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果，提高轉(zhuǎn)染率，為前列腺癌治療的研究提供了一個(gè)新的途徑。

超聲靶向微泡破壞；基因轉(zhuǎn)染；脂質(zhì)體；質(zhì)粒；特異性核基質(zhì)蛋白1基因；前列腺癌

近年來，惡性腫瘤的基因治療成為研究的熱點(diǎn)，如何安全、高效地將目的基因靶向載入腫瘤細(xì)胞，是目前基因治療領(lǐng)域研究的關(guān)鍵問題。脂質(zhì)體作為目前最常用的非病毒性載體，雖克服了病毒性載體具有的免疫原性和致突變性，但因具有轉(zhuǎn)染率較低及無靶向性等缺點(diǎn),使其應(yīng)用一定程度的受限[1]。超聲靶向微泡破壞(UTMD)是一種新型、安全的靶向基因轉(zhuǎn)染方法，能提高裸DNA及重組基因載體對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果[2,3]。目前，對(duì)于UTMD聯(lián)合脂質(zhì)體對(duì)前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效果尚未見報(bào)道。2016年 6～12月，我們將UTMD與脂質(zhì)體聯(lián)合，應(yīng)用于沉默特異性核基質(zhì)蛋白1基因(pSilencer3.1-SATB1)在前列腺癌DUl45細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，旨在構(gòu)建一種安全、高效、特異的基因治療導(dǎo)入系統(tǒng)，為前列腺癌的治療研究提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器 人前列腺癌雄激素非依賴型細(xì)胞株DU145(上海中科院生物研究所細(xì)胞庫)。RPMI1640培養(yǎng)液(Gibco公司)；無噬菌體、低內(nèi)毒素胎牛血清(杭州四季青生物技術(shù)有限公司)；0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)；SonoVue微泡(Bracco公司)；脂質(zhì)體Lipofectamine2000(Invitrogen)；pEGFP-C1-pSilencer3.1-SATB1質(zhì)粒、pSilencer3.1-SATB1引物(上海生物工程股份有限公司)；質(zhì)粒小量提取試劑盒(北京天根生物科技有限公司)。超聲治療儀(深圳威爾德電子有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) DU145細(xì)胞在37 ℃、5%CO2條件下，于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)液為含 10%胎牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)液。

1.3 質(zhì)粒提取和微泡制備 通過大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化可表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的質(zhì)粒pEGFP-C1-pSilencer3.1-SATB1，按質(zhì)粒小量提取試劑盒(TIAN prep Mini Plasmid Kit)說明書的要求提取、純化質(zhì)粒；測(cè)量質(zhì)粒濃度和純度，待A260∶A280≥1.8時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。根據(jù)說明書制備聲諾維微泡，反復(fù)振蕩使之成為懸浮液。將質(zhì)粒與微泡混合(每分鐘震蕩1次)，于4 ℃恒溫冰箱中保存15 min，備用。

1.4 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染處理 將生長(zhǎng)良好的DU145細(xì)胞用0.25%胰酶消化計(jì)數(shù)后，以無血清的RPMI1640制成單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液密度在1×105～3×105/mL。將細(xì)胞分為6組，分別為對(duì)照組、微泡組、超聲組、超聲+微泡組、脂質(zhì)體組、超聲+微泡+脂質(zhì)體組。每組設(shè)3孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。將各組細(xì)胞懸液分別緩慢加入無菌聚乙烯管內(nèi)，各組中均加入等量的細(xì)胞懸液及質(zhì)粒，試劑加入均在無菌超凈臺(tái)里完成。微泡組加入20%的微泡；超聲組予以適宜強(qiáng)度的超聲輻照；超聲+微泡組加入20%的微泡濃度后予以適宜強(qiáng)度的超聲輻照；脂質(zhì)體組按照lipofectamin2000轉(zhuǎn)染的步驟加入脂質(zhì)體；超聲+微泡+脂質(zhì)體組加入相應(yīng)量的脂質(zhì)體及20%的微泡濃度后，予以適宜強(qiáng)度的超聲輻照；對(duì)照組不做任何處理。試劑加入完畢后，聚乙烯管采用無菌封口膜封口，室溫下靜置30 min，于超聲輻照前將細(xì)胞懸液輕柔搖勻。超聲輻照時(shí)，探頭固定于不銹鋼支架上，使輻射面垂直朝上，然后將裝有細(xì)胞懸液的聚乙烯管倒置于超聲探頭表面，為避免兩者之間留有氣泡，用超聲耦合劑予以填充。超聲輻照參數(shù)設(shè)置為頻率1 MHz、輻照功率1.0 W/cm2、持續(xù)時(shí)間30 s、占空比20%。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程避光操作。

1.5 基因轉(zhuǎn)染率測(cè)算 細(xì)胞輻照完成后去除封口膜，立即將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移于6孔培養(yǎng)板，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育4 h，換液后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)EGFP的表達(dá)情況并攝片保存。因重組基因可表達(dá)EGFP，故采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光細(xì)胞的比例，以EGFP的表達(dá)反映DU145細(xì)胞中pSilencer3.1-SATB1的表達(dá)量，計(jì)算基因轉(zhuǎn)染率以評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效果。

2 結(jié)果

熒光顯微鏡下，對(duì)照組、微泡組均未觀察到綠色熒光；超聲組可見極少綠色熒光；超聲+微泡組、脂質(zhì)體組均可見較多綠色熒光，但后者較前者綠色熒光明顯；超聲+微泡+脂質(zhì)體組綠色熒光最強(qiáng)，可見大量EGFP表達(dá)，明顯多于其他各組。對(duì)照組、微泡組、超聲組、超聲+微泡組、脂質(zhì)體組、超聲+微泡+脂質(zhì)體組基因轉(zhuǎn)染率分別為0.18%±0.09%、0.25%±0.11%、1.14%±0.13%、2.96%±0.16%、3.99%±0.12%、7.16%±0.17%，超聲組、超聲+微泡組、脂質(zhì)體組、超聲+微泡+脂質(zhì)體組基因轉(zhuǎn)染率均高于對(duì)照組，超聲+微泡組、脂質(zhì)體組、超聲+微泡+脂質(zhì)體組基因轉(zhuǎn)染率均高于超聲組，脂質(zhì)體組、超聲+微泡+脂質(zhì)體組基因轉(zhuǎn)染率均高于超聲+微泡組，超聲+微泡+脂質(zhì)體組基因轉(zhuǎn)染率高于脂質(zhì)體組(P均<0.05)。

3 討論

前列腺癌作為老年男性泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年升高，尤其是在歐美地區(qū)高居男性惡性腫瘤的首位，其病死率僅次于肺癌[4]。在我國，隨著人口的老齡化、飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變以及診斷水平的提高，前列腺癌的發(fā)生亦越來越常見，已成為影響50歲以上男性人群健康的重要因素之一。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展以及相關(guān)生物技術(shù)的應(yīng)用，對(duì)前列腺癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)逐步深入，對(duì)前列腺癌尤其是激素非依賴性前列腺癌的基因治療研究已成為熱點(diǎn)。

SATB1是一種組織特異性表達(dá)的核基質(zhì)結(jié)合蛋白，在免疫調(diào)節(jié)、腫瘤轉(zhuǎn)移和凋亡等方面起著重要作用，其主要機(jī)制是參與染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成和調(diào)控組織特異性基因的表達(dá)。國內(nèi)外研究[5,6]發(fā)現(xiàn)，SATB1基因不僅在前列腺癌組織中高表達(dá)，同時(shí)其表達(dá)水平與前列腺癌的臨床分期及預(yù)后密切相關(guān)。Mao等[7]研究顯示，體外沉默SATB1基因后可抑制前列腺癌DU145細(xì)胞株的增殖。因此，SATB1對(duì)于前列腺癌是一個(gè)良好的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。如何將治療性重組基因pSilencer3.1-SATB1成功轉(zhuǎn)入DU145細(xì)胞，是發(fā)揮基因沉默SATB1治療前列腺癌的前提，該轉(zhuǎn)染過程需依次克服細(xì)胞外傳輸、細(xì)胞攝取和細(xì)胞內(nèi)傳輸?shù)?個(gè)障礙。脂質(zhì)體作為目前最常用的非病毒載體，可與DNA形成脂質(zhì)體-基因復(fù)合物，經(jīng)胞飲作用將基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，易于制備及大量生產(chǎn)，但具有一定的細(xì)胞毒性，在活體內(nèi)轉(zhuǎn)染率較低。雖然脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的安全性、可控性較高，但由于其克服上述3個(gè)障礙的能力有限，且在血清和組織中不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致體內(nèi)轉(zhuǎn)染基因效率較低；除此之外，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染還具有基因傳輸無靶向性的缺陷。因此，尋找一種既能增強(qiáng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，又能提高其轉(zhuǎn)染靶向性的遞送系統(tǒng)，對(duì)于擴(kuò)展脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的應(yīng)用具有重要意義。

UTMD是一種新型的安全、易控的轉(zhuǎn)染方式，在一定強(qiáng)度的超聲輻照下，微泡在指定的靶向部位發(fā)生“爆破”，其間產(chǎn)生的沖擊波、微射流等可使細(xì)胞膜通透性增高，有利于DNA分子穿透；此外，超聲波的能量以及微泡破裂時(shí)向細(xì)胞內(nèi)傳送的震蕩波還可促進(jìn)DNA從細(xì)胞的內(nèi)吞泡逸出并進(jìn)入細(xì)胞核，上述效應(yīng)疊加在一起，可以提高基因在不同細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染[10～13]。但就目前而言，與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染相比較，其轉(zhuǎn)染率明顯偏低。本研究發(fā)現(xiàn)，超聲+微泡組的轉(zhuǎn)染率低于脂質(zhì)體組，與大多數(shù)研究結(jié)果類似，提示雖然UTMD具有較高的安全性、靶向性，但其轉(zhuǎn)染效率與傳統(tǒng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染相比仍有一定的差距，因此如何做到安全、高效、靶向地轉(zhuǎn)染目的基因，一直是基因治療研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。

近年研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體與UTMD聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，不僅能降低脂質(zhì)體的用量，減小其細(xì)胞毒性，還能提高其轉(zhuǎn)染功效及靶向性。UTMD在增強(qiáng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方面，有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，既對(duì)人體不產(chǎn)生不良反應(yīng)，又易于調(diào)控，能針對(duì)不同細(xì)胞類型采取適宜的超聲強(qiáng)度及微泡濃度。此外，還能使聲束聚焦于特定范圍，減少對(duì)非病變組織的損傷，為未來臨床應(yīng)用中疾病的針對(duì)化、個(gè)性化治療提供了理論基礎(chǔ)。近年研究[8～10]證實(shí)，UTMD不僅能提高脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的效率，而且還可以提高其轉(zhuǎn)染的靶向性。Feril等[11]研究發(fā)現(xiàn)，單純超聲輻照就能增強(qiáng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，可能是通過提高脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染克服上述基因轉(zhuǎn)入過程3個(gè)障礙的能力，即增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)復(fù)合物及細(xì)胞核對(duì)DNA的攝取能力，抑制了細(xì)胞對(duì)DNA的胞吐作用。而加入微泡造影劑后，其作為一種人為空化核[12]，能夠使超聲產(chǎn)生空化效應(yīng)的能量閾值明顯降低，從而達(dá)到增強(qiáng)空化效應(yīng)，導(dǎo)致基因更易通過高通透性的細(xì)胞膜進(jìn)入靶細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的目的。但是,目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究的是兩者對(duì)報(bào)告基因pEGFP-C1/pEGFP-N1的聯(lián)合增效作用，對(duì)治療性重組基因的研究較少，且研究靶細(xì)胞多為肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞等，關(guān)于前列腺癌細(xì)胞的報(bào)道較少。本研究將UTMD聯(lián)合脂質(zhì)體應(yīng)用于增強(qiáng)pSilencer3.1-SATB1基因在前列腺癌DU145細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染能力，發(fā)現(xiàn)超聲+微泡+脂質(zhì)體組基因轉(zhuǎn)染率最高，明顯高于脂質(zhì)體組及超聲+微泡組，進(jìn)一步證實(shí)UTMD可以顯著增強(qiáng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的效率。

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Ultrasound-targeted microbubble destruction enhances transfection efficiency of liposome-mediated plasmid pSilencer3.1-SATB1 to DU145 cells

ZHANGJuanjuan,CHENYinghong,LINXuhong

(HuaiheHospitalofHenanUniversity,Kaifeng475000,China)

Objective To investigate the effects of ultrasound-targeted microbubble destruction (UTMD) combined with liposome-mediated silencing specific nuclear matrix protein 1 gene (pSilencer3.1-SATB1) on transfection of human prostate cancer DU145 cells.Methods The DU145 cells were cultured in vitro and divided into 6 groups: the control group, microbubble group, ultrasound group, ultrasound+microbubble group, liposome group, and ultrasound+microbubble+liposome group. The control group did not do any treatment, the microbubble group was added with the appropriate amount of microbubbles, the ultrasound group only

ultrasonic irradiation, the ultrasound+microbubble group was added with microbubbles, followed by ultrasonic irradiation, the liposome group was added with liposome, and the ultrasound+microbubble+liposome group was added with microbubbles and liposomes, followed by ultrasonic irradiation. After 24-hour treatment, the expression of enhanced green fluorescent protein (EGFP) was observed by flow cytometry, the percentage of EGFP fluorescent cells was detected, and the transfection efficiency was evaluated.Results Fluorescence microscopy showed that the expression of green fluorescent protein in the ultrasound+microbubble+liposome group was numerous, which was significantly higher than that of the other groups. The transfection efficiencies of the control group, microbubble group, ultrasound group, ultrasound+microbubble group, liposome group, and ultrasound+microbubble+liposome group were 0.18%±0.09%, 0.25%±0.11%, 1.14%±0.13%, 2.96%±0.16%, 3.99%±0.12%, and 7.16%±0.17%, respectively, and the transfection efficiency of the ultrasound+microbubble+liposome group was higher than that of the other groups (allP<0.05). Conclusion UTMD can enhance the transfection efficiency of liposome-mediated plasmid pSilencer3.1-SATB1 to DUl45 cells, and improve the transfection efficiency, so it provides a new way for the treatment of prostate cancer.

ultrasound-targeted microbubble destruction; gene transfection; liposome; plasmid; specific nuclear matrix protein 1 gene; prostate carcinoma

張娟娟(1982-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向?yàn)楦共考靶∑鞴俚某曉\斷。E-mail: 542145312@qq.com。

陳英紅(1968-)，女，本科，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)楦共考靶∑鞴俚某曉\斷及超聲介入診治。E-mail: 17344743@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.30.006

R737.25

A

1002-266X(2017)30-0022-04

2017-03-04)