李巧利，陳鳳鴻，全坤，封迎芳

(徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇徐州221000)

尿源性干細(xì)胞在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用進(jìn)展

李巧利，陳鳳鴻，全坤，封迎芳

(徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇徐州221000)

尿源性干細(xì)胞(USCs)是一種從尿液中提取的新型干細(xì)胞，具有良好的增殖活性和多向分化能力，且具有間充質(zhì)干細(xì)胞的各種生物學(xué)特性，有望成為組織工程和再生醫(yī)學(xué)較為理想的細(xì)胞來源。目前，USCs在泌尿生殖系統(tǒng)、骨修復(fù)重建、血管再生、骨骼肌細(xì)胞再生等醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中已得到廣泛應(yīng)用，體現(xiàn)出重要的潛在臨床價(jià)值。

尿源性干細(xì)胞；干細(xì)胞；組織工程；實(shí)驗(yàn)研究

干細(xì)胞是一類具有自我更新、無限增殖能力和多向分化潛能的細(xì)胞群，目前已經(jīng)應(yīng)用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[1,2]。間充質(zhì)干細(xì)胞是一類非造血的成體干細(xì)胞，廣泛存在于器官和結(jié)締組織中，能夠發(fā)育成硬骨、軟骨、脂肪等組織，并且不會帶來倫理問題[3]。但間充質(zhì)干細(xì)胞來源有限，且會對機(jī)體造成一定的創(chuàng)傷。因此，尋找一種新的干細(xì)胞來源，對醫(yī)學(xué)組織工程及再生醫(yī)學(xué)的開展具有重要意義。尿源性干細(xì)胞(USCs)是一種從尿液中提取的新型干細(xì)胞，具有間充質(zhì)干細(xì)胞的各種生物學(xué)特性，具有良好的增殖活性和多向分化能力，可以自體使用，并可避免倫理問題和免疫排斥問題[4]。此外，USCs還具有取材簡易、資源無限、安全無創(chuàng)、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，有望成為組織工程和再生醫(yī)學(xué)較為理想的細(xì)胞來源，為細(xì)胞替代療法提供了新途徑[5,6]?，F(xiàn)將近年來關(guān)于USCs的實(shí)驗(yàn)研究及應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 USCs的生物學(xué)特性

1.1 USCs的表面分子標(biāo)志物 研究表明，USCs表面表達(dá)CD29、CD44、CD54、CD73和CD90等間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物，而不表達(dá)CD34、CD45、CD133等造血干細(xì)胞標(biāo)志物[5,7]。此外，隨著USCs代數(shù)的增加，其表面標(biāo)志物也會有所改變。隨著研究的進(jìn)展，不斷發(fā)現(xiàn)了USCs新的標(biāo)志物特征，如高表達(dá)的CD146，弱表達(dá)或不穩(wěn)定表達(dá)的硫酸軟骨素蛋白多糖( NG2)、血小板衍生生長因子受體β(PDGF-rβ)、間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子(STRO-1)[6,8,9]。

1.2 USCs的多向分化能力 USCs在相應(yīng)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下，能誘導(dǎo)成為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、尿路上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞等，并表達(dá)相應(yīng)的細(xì)胞表面標(biāo)志物或特異性蛋白等[10～12]。采用含有轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、血小板衍生生長因子BB( PDGF-BB)和胎牛血清( FBS)的H-DMEM和EFM的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)USCs時(shí)，可誘導(dǎo)其向平滑肌細(xì)胞分化。用含有表皮生長因子(EGF)的DMEM和KSFM的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)USCs時(shí)，則可誘導(dǎo)其向尿路上皮細(xì)胞分化[4]。用含有VEGF的內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)USCs[4]，或經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染使USCs過表達(dá)VEGF[13]時(shí)，均可誘導(dǎo)USCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化。用含胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鹽、EGF、bFGF等成分的DMEM/F12培養(yǎng)基可以將 USCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞[14]。將USCs植入裸鼠體內(nèi)后，也能在裸鼠體內(nèi)分化為尿路上皮、血管內(nèi)皮、牙齒、膀胱組織等，且具有相應(yīng)的生理功能和生物學(xué)特性[15]。研究表明，與廣泛應(yīng)用的脂肪干細(xì)胞相比，USCs增殖能力強(qiáng)，更易形成菌落，能夠更明顯地表達(dá)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，具有強(qiáng)大的免疫抑制作用，更容易向肌源性、神經(jīng)源性和內(nèi)皮細(xì)胞分化，因此比脂肪干細(xì)胞更適宜用于肌肉、神經(jīng)和內(nèi)皮組織的重建[16]。USCs具有端粒酶的活性和高度的可擴(kuò)展性，但是在體內(nèi)不會誘導(dǎo)畸胎瘤或者腫瘤的產(chǎn)生。

2 USCs在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用

2.1 在泌尿生殖系統(tǒng)疾病實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用 USCs表達(dá)足細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志物，在體外適宜媒介的誘導(dǎo)下，可以向膀胱相關(guān)的細(xì)胞類型分化，包括功能性的尿路上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，當(dāng)分化的USCs細(xì)胞融合在支架上并移植入裸鼠體內(nèi)時(shí)，尿路上皮和平滑肌組織就形成了。因此，USCs在泌尿生殖系統(tǒng)重建的細(xì)胞療法和組織工程中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[5]。USCs的外分泌物可能減少糖尿病大鼠尿量和尿微量白蛋白的排泄，防止足細(xì)胞和小管上皮細(xì)胞的凋亡，抑制Caspase-3的過表達(dá)，并且增加糖尿病大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。此外，USCs的外分泌物還可促進(jìn)血管再生和增強(qiáng)細(xì)胞的生存能力，其可能的機(jī)制是USCs的外泌物中含有多種細(xì)胞因子，包括生長因子、TGF-β1、血管生成素和骨成型蛋白7( BMP-7)[17]。與其他的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，USCs對膀胱組織的修復(fù)具有多種優(yōu)勢，包括細(xì)胞收集簡單、安全、低價(jià)、無創(chuàng)；具有端粒酶活性，能夠產(chǎn)生更多的細(xì)胞；能夠更高效地分化為平滑肌細(xì)胞、尿路上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞[18]。動物模型已證實(shí)，USCs對尿道和膀胱組織重建、應(yīng)激性尿失禁、糖尿病性勃起功能障礙以及急性腎損傷等泌尿生殖系統(tǒng)疾病都有一定的保護(hù)和治療作用。

含有生長因子[包括VEGF、 胰島素樣生長因子1(IGF-1)、成纖維細(xì)胞生長因子1(FGF-1)、PDGF、 人類生長因子(HGF)和 神經(jīng)生長因子(NGF)]的藻酸鹽微珠可以誘導(dǎo)USCs向肌源性細(xì)胞分化，增強(qiáng)血管再生和神經(jīng)支配，刺激體內(nèi)歸巢細(xì)胞的生長，這種方法用于應(yīng)激性尿失禁的細(xì)胞治療可能具有良好效果[11]。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)VEGF的USCs以Ⅰ型膠原凝膠為載體，皮下注射入裸鼠體內(nèi)，經(jīng)過一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物(CD31、vWF)、肌源性細(xì)胞標(biāo)志物生肌決定因子5(myf-5)、肌分化因子與肌間線蛋白(MyoD)、神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物(S-100)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、神經(jīng)絲蛋白在過表達(dá)VEGF的USCs中均顯著增高[19]。過表達(dá)VEGF的USCs可促進(jìn)血管的形成，增強(qiáng)移植細(xì)胞的生存能力，招募?xì)w巢細(xì)胞且促進(jìn)USCs向肌圓形細(xì)胞類型的分化和神經(jīng)支配，提示USCs在應(yīng)激性尿失禁的細(xì)胞治療中有重要的潛在臨床價(jià)值。USCs的旁分泌作用或FGF-2轉(zhuǎn)染的USCs對2型糖尿病大鼠的勃起功能障礙有一定的改善作用，其機(jī)制是招募?xì)w巢細(xì)胞和增加內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)以及平滑肌細(xì)胞的含量[20]。此外，USCs可以分泌促血管生成生長因子、免疫調(diào)節(jié)因子，這可能也是促進(jìn)勃起功能恢復(fù)的機(jī)制之一。USCs與轉(zhuǎn)染血小板衍生生長因子(PEDF)的USCs的旁分泌作用可以通過神經(jīng)保護(hù)作用，阻礙海綿體神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的大鼠陰莖勃起障礙、海綿體結(jié)構(gòu)的損傷[21]，使陰莖背神經(jīng)的神經(jīng)性一氧化氮合酶(eNOS)陽性的神經(jīng)纖維數(shù)量增加，海綿體組織中細(xì)胞凋亡減少。

2.2 在皮膚修復(fù)重建實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用 USCs聯(lián)合聚已酸內(nèi)酯/凝膠納米纖維支架可以顯著地促進(jìn)兔受損的全層皮膚愈合，使傷口愈合更快，并且伴隨著上皮的再生、膠原形成和血管的生成。此外，USCs可通過分泌VEGF和TGF-β1，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和成管能力，從而促進(jìn)皮膚組織的修復(fù)[22]。

2.3 在骨修復(fù)重建實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用 硅酸鹽生物陶瓷可以刺激干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。研究表明，硅酸鈣可以顯著增強(qiáng)細(xì)胞的增殖，提高堿性磷酸酶活性，促進(jìn)鈣沉積和某些與成骨有關(guān)的基因和蛋白的表達(dá)[23]。此外，Wnt/β-catenin信號通路抑制劑小豆蔻明能夠減弱硅酸鈣誘導(dǎo)的USCs向成骨細(xì)胞分化的刺激作用，表明硅酸鈣促進(jìn)USCs向成骨細(xì)胞分化可能是通過Wnt/β-catenin信號通路介導(dǎo)的。Guan等用USCs作為種子細(xì)胞，種在β磷酸三鈣支架上，發(fā)現(xiàn)USCs在β磷酸三鈣里依然可以生存和繁殖，通過堿性磷酸酶和鈣含量升高表明，USCs向成骨細(xì)胞分化。此外，在體實(shí)驗(yàn)也表明USCs聯(lián)合β磷酸三鈣對大鼠大塊的股骨壞死有修復(fù)作用，比單獨(dú)地使用β磷酸三鈣支架促進(jìn)骨形成的效果更好[24]。

2.4 在血管再生實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用 Liu等[19]用VEGF誘導(dǎo)分化USCs，然后在體外用Matrigel膠立體培養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間可形成管狀網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白標(biāo)志物如CD31、血管性血友病因子(vWF)、血管內(nèi)皮生長因子受體(KDR)、內(nèi)皮eNOS等，將該細(xì)胞皮下植入裸鼠細(xì)胞凝膠后，發(fā)現(xiàn)VEGF誘導(dǎo)的廣泛血管化現(xiàn)象，且內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示過表達(dá)VEGF的USCs能夠促進(jìn)血管形成，并增強(qiáng)移植細(xì)胞的生存能力。

2.5 在神經(jīng)損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用 Guan等[8]構(gòu)建了大鼠腦損傷模型，將采用水凝膠包裹的USCs移植入腦損傷區(qū)，發(fā)現(xiàn)植入的細(xì)胞不僅能在移植部位存活，還具有良好的遷移能力。這些細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)神經(jīng)相關(guān)標(biāo)志物，包括巢蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、β微管蛋白Ⅲ等，表明在腦損傷微環(huán)境下，USCs能夠向神經(jīng)細(xì)胞分化，提示USCs可用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。

2.6 在骨骼肌細(xì)胞再生研究中的應(yīng)用 USCs在體內(nèi)和體外都能夠分化成骨骼肌細(xì)胞，且表達(dá)骨骼肌細(xì)胞特異性的蛋白標(biāo)志物。因此，在骨骼肌的再生療法中可作為一種潛在的細(xì)胞來源。Chen[25]等將USCs加入骨骼肌誘導(dǎo)基，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)USCs分化為骨骼肌細(xì)胞，并表達(dá)骨骼肌細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白myf5、myoD、肌球蛋白和結(jié)蛋白，經(jīng)過myoD染色可見骨骼肌細(xì)胞特有的肌管樣形態(tài)。將骨骼肌細(xì)胞植入裸鼠脛骨前肌能夠繼續(xù)增殖，植入部位的組織穩(wěn)定表達(dá)骨骼肌細(xì)胞特有的標(biāo)志物。

2.7 在其他組織實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用 研究發(fā)現(xiàn)，USCs對2型糖尿病大鼠的胰島、心肌、腎小球、膀胱逼尿肌有修復(fù)和保護(hù)作用[26]。Guan等[27]研究發(fā)現(xiàn)，利用USCs可誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的特性，可將USCs用于治療肌營養(yǎng)不良癥?；謴?fù)胰島的分泌功能和促進(jìn)β細(xì)胞的再生,被認(rèn)為是一種新穎的治療2型糖尿病的方法[28]。研究發(fā)現(xiàn)，USCs治療糖尿病能夠有效地促進(jìn)胰島β細(xì)胞的生長，減少其死亡，提高糖耐量和胰島素耐受[26]。Cai等[29]將誘導(dǎo)分化的USCs種植到小鼠腎包膜下，3周后觀察到小鼠腎包膜下長出牙齒樣結(jié)構(gòu)，提示USCs可在牙齒的組織再生中有所應(yīng)用。此外，干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基也有一定的生物學(xué)效應(yīng)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，間充質(zhì)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基可以減少高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞的凋亡和損傷[30]。USCs具有干細(xì)胞的特性，即貼壁生長和多向分化能力，同時(shí)USCs也表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表面分子[5,6]，不同劑量的USCs條件培養(yǎng)基能夠減輕足細(xì)胞特異性分子突觸極蛋白synaptopodin的下調(diào)，抑制足細(xì)胞的早期凋亡，表明USCs能夠修復(fù)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，且此修復(fù)作用與其旁分泌有關(guān)[31]。

3 小結(jié)

作為一種新型的干細(xì)胞來源，USCs不僅具有能夠有效地分化為足細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和尿路上皮細(xì)胞的多向分化潛能，還能夠分泌一系列的生長因子和細(xì)胞因子，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)有著廣闊的臨床應(yīng)用前景，尤其是泌尿生殖系統(tǒng)組織的修復(fù)。動物模型已經(jīng)證實(shí)USCs對糖尿病性勃起功能障礙、應(yīng)激性尿失禁、尿道和膀胱組織重建以及急性腎損傷都有一定的保護(hù)和治療的作用。

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2017-02-11)