楊鵬，羅雪蘭，莫國(guó)君，陶曉靜，沈鳳，歐和生( 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧530021)

miR-24對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及自噬的影響

楊鵬，羅雪蘭，莫國(guó)君，陶曉靜，沈鳳，歐和生
( 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧530021)

目的 探討miR-24對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖、轉(zhuǎn)移、自噬的影響。方法 將HUVECs隨機(jī)分為空白對(duì)照組、雷帕霉素+miR-24高表達(dá)組、雷帕霉素組?？瞻讓?duì)照組不給予任何處理；雷帕霉素組的HUVECs用1 000 nmol/L雷帕霉素處理6 h建立自噬模型。雷帕霉素+miR-24高表達(dá)組的HUVECs先轉(zhuǎn)染miR-24高表達(dá)質(zhì)粒，待轉(zhuǎn)染成功后以同樣方法建立自噬模型；用CCK-8法檢測(cè)HUVECs增殖能力，細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢驗(yàn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，進(jìn)一步用免疫組織化學(xué)和 Western blotting 法檢測(cè)HUVECs自噬蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)和Beclin-1的蛋白表達(dá)水平，采用透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)部自噬小體。結(jié)果 與空白對(duì)照組相比，雷帕霉素組、雷帕霉素+miR-24高表達(dá)組OD值、細(xì)胞遷移比例降低、Beclin-1蛋白及LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量上升(P<0.01或<0.05)。與雷帕霉素組相比，雷帕霉素+miR-24高表達(dá)組OD值、細(xì)胞遷移比例下降，Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量下降(P<0.01或<0.05)。透射電鏡觀察結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和雷帕霉素+miR-24高表達(dá)組的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)各細(xì)胞器分布基本正常，細(xì)胞核形態(tài)也正常，細(xì)胞質(zhì)中未見明顯自噬小體；雷帕霉素組細(xì)胞質(zhì)中可見明顯的空泡狀結(jié)構(gòu)、包含部分雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體。結(jié)論 miR-24可顯著抑制HUVECs的增殖、轉(zhuǎn)移及自噬。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；miRNA-24；細(xì)胞自噬；細(xì)胞增殖

miRNAs是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，長(zhǎng)19～22個(gè)核苷酸，其通過作用于靶基因的3′UTR區(qū)域來調(diào)控靶基因mRNA降解或翻譯，是一種在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因進(jìn)行調(diào)控的方式[1]。在血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)的miRNAs,通過參與血管內(nèi)皮細(xì)胞分化、增殖、遷移、成管與凋亡等調(diào)控血管新生的過程，且這些miRNAs的表達(dá)異常在血管新生及相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[2，3]。內(nèi)皮細(xì)胞自噬與血管疾病的生理病理過程有高度相關(guān)性。Nishikawa等[4]研究發(fā)現(xiàn)，通過誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)自噬，能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)血管新生。研究發(fā)現(xiàn),一些miRNAs可以通過調(diào)控與自噬相關(guān)的微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)和Beclin-1蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮對(duì)自噬的調(diào)節(jié)作用[5，6]。最新研究表明，miR-24能顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[7]，然而，miR-24在抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的過程中是否涉及對(duì)自噬水平的調(diào)控鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。2015年7月～2016年7月，本研究探討了miR-24在抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的過程中對(duì)細(xì)胞自噬水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 HUVECs(Procell，中國(guó)武漢)；1640細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco，上海立菲生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清(Gibco，澳洲)；載體miRNASelectTMpEGP-miR(Cell Biolabs)；X-tremeGENE HP DNA 轉(zhuǎn)染試劑盒(Roche，德國(guó) )；人工基底膜 (Matrigel)(Corning，美國(guó))；質(zhì)粒提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；內(nèi)參β-actin抗體(廣州晶欣生物科技有限公司)；LC3,HIF-1α,BNIP3和 Beclin1抗體(Cell Signaling，美國(guó))；蛋白電泳儀、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad，美國(guó))；Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(LICOR，美國(guó))；透射電子顯微鏡(日立 H7650，日本)。

1.2 miR-24高表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 miR-24序列(來自http://www.miRbase.org)為 5′-UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3′;首先通過DNA合成技術(shù)得到第1 鏈DNA，然后再利用DNA 連接反應(yīng)合成相應(yīng)的雙鏈 DNA，通過PCR擴(kuò)增后和體外重組，最后插入 pEGP-miR 載體轉(zhuǎn)化入E.coli DH 5α感受態(tài)宿主菌，選取經(jīng)酶切初步證實(shí)并插入正確的單克隆菌落，然后提取質(zhì)粒DNA寄往上海生工測(cè)定 DNA 序列。

1.3 HUVECs的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 HUVECs用含有100 mg/L鏈霉素、1×105U/L青霉素、10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中。提取的質(zhì)粒用NANO核酸測(cè)定儀測(cè)定濃度，重復(fù)3次，取平均值。然后使用無血清 1640 培養(yǎng)基將質(zhì)粒稀釋至濃度為0.01 μg/μL，并將 X-tremeGENE HP DNA 轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒按3 μL∶1 μg比例混合，取生長(zhǎng)正常的 HUVECs 孵育，24 h 后更換含10%胎牛血清1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h觀察免疫熒光。

1.4 細(xì)胞分組以及HUVECs自噬模型的建立 將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組、雷帕霉素組、雷帕霉素+miR-24高表達(dá)組?？瞻讓?duì)照組不給于任何處理；雷帕霉素組建立自噬模型。雷帕霉素+miR-24高表達(dá)組的HUVECs待miR-24高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功后，建立自噬模型。根據(jù)文獻(xiàn)[8]實(shí)驗(yàn)步驟，采用HUVECs經(jīng)1 000 nmol/L雷帕霉素處理6 h建立自噬模型。

1.5 HUVECs增殖活力的檢測(cè) 采用CCK-8法。96孔板每孔加入細(xì)胞密度為5×103/mL細(xì)胞懸液100 μL，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h使其貼壁，各組細(xì)胞按設(shè)定條件處理后，每孔加入CCK-8試劑10 μL,培養(yǎng)箱避光孵育1 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處光密度(OD)值，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 HUVECs轉(zhuǎn)移能力的檢測(cè) 采用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVECs配制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為每孔5×104/mL，接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁、生長(zhǎng)成單細(xì)胞層時(shí)，用200 μL槍頭于板孔底面中軸劃“一”道劃痕，用PBS洗滌3次，然后加入無血清1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于0 h和24 h顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況并測(cè)量劃痕寬度，遷移比例 =(劃痕 0 h 后劃痕寬度-劃痕 24 h 后劃痕寬度)/ 劃痕 0 h 后劃痕寬度，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.7 HUVECs內(nèi)自噬小體的觀察 利用透射電鏡法。將固定液存放于4 ℃冰箱；將各組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分別消化，然后分別用15 mL離心管離心(800 r/min，5 min)；倒掉上清，加PBS 1 mL到離心管中，混懸；然后把混懸液吸入一個(gè)潔凈的EP管中，低溫離心(約5 000 r/min，15 min)，棄上清，加入固定液1 mL，送電鏡室觀察。

1.8 HUVECs內(nèi)Beclin-1 和 LC3Ⅱ蛋白表達(dá)的檢測(cè) ①采用免疫組化法檢測(cè)。將無菌玻片放入24孔板，加入細(xì)胞(每孔2×104個(gè)HUVECs)培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)染并造模成功后取爬片，PBS沖洗3次，中性樹脂粘片，4%甲醛固定。用TritonX-100(10 min)和3%過氧化氫(30 min)處理后雙蒸水沖洗3次，敷Ⅰ抗、Ⅱ抗后顯色劑顯色。Beclin-1 和 LC3Ⅱ蛋白表達(dá)于胞質(zhì)，Beclin-1 和 LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)以棕黃色作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。②采用Western blotting 法檢測(cè)。將各組細(xì)胞裂解，12 000 r/min、4 ℃離心 15 min，取上清。各實(shí)驗(yàn)組分別取蛋白 30 μg進(jìn)行 SDS-PAGE(8%)分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，然后加入Beclin-1和LC3Ⅰ抗孵育過夜(4 ℃) 。TBST沖洗3次(每次15 min)，加入Ⅱ抗孵育，1 h后重復(fù)用TBST避光沖洗(方法同上)。利用LICOR公司的Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)分析蛋白電泳條帶的灰度值，計(jì)算Beclin-1 和 LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)量。以β-actin為內(nèi)參，Beclin-1或LC3Ⅱ的相對(duì)表達(dá)量=Beclin-1或LC3Ⅱ灰度值/β-actin灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組HUVECs的增殖活力比較 空白對(duì)照組、雷帕霉素組、雷帕霉素+miR-24高表達(dá)組的OD值分別為1.28±0.03、0.87±0.01、0.47±0.01，與空白對(duì)照組相比，雷帕霉素+miR-24高表達(dá)組OD值降低63.45%(P<0.01),雷帕霉素組OD值降低32.62%(P<0.01)。與雷帕霉素組相比，雷帕霉素+miR-24高表達(dá)組OD值降低45.96%(P<0.01)。

2.2 各組HUVECs的轉(zhuǎn)移情況 空白對(duì)照組、雷帕霉素組、雷帕霉素+miR-24高表達(dá)組HUVECs的遷移比例分別為0.33±0.40、0.18±0.15、0.09±0.32，與空白對(duì)照組比較，劃痕24 h后雷帕霉素+miR-24高表達(dá)組HUVECs的遷移比例降低72.72%(P<0.05)，雷帕霉素組的遷移比例降低45.46%(P<0.05)。與雷帕霉素組相比，雷帕霉素+miR-24高表達(dá)組HUVEC的遷移比例下降了50.00%(P<0.05)。

2.3 各組HUVECs的超微結(jié)構(gòu) 透射電鏡觀察結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和雷帕霉素+miR-24高表達(dá)組的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)各細(xì)胞器分布基本正常，細(xì)胞核形態(tài)也正常，細(xì)胞質(zhì)中未見明顯自噬小體；雷帕霉素組細(xì)胞質(zhì)中可見明顯的空泡狀結(jié)構(gòu)、包含部分雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體。

2.4 各組HUVECs Beclin-1蛋白表達(dá)比較 Beclin-1蛋白表達(dá)量以雷帕霉素組最高，雷帕霉素+miR-24高表達(dá)組的表達(dá)較少，而對(duì)照組則基本沒有表達(dá)?？瞻讓?duì)照組、雷帕霉素組、雷帕霉素+miR-24高表達(dá)組Beclin-1蛋白表達(dá)分別為0.03±0.02、0.26±0.01、0.09±0.01，與空白對(duì)照組比較，雷帕霉素組的Beclin-1蛋白表達(dá)量上升了766.67%(P<0.05)，雷帕霉素+miR-24高表達(dá)組上升了200.00%(P<0.05)；與雷帕霉素組比較，雷帕霉素+miR-24高表達(dá)組下降了65.38%(P<0.05)。

2.5 各組HUVECs LC3Ⅱ蛋白表達(dá)比較 雷帕霉素組LC3 Ⅱ蛋白表達(dá)量最高，雷帕霉素+miR-24高表達(dá)組的表達(dá)較少，而空白對(duì)照組基本沒有表達(dá)?？瞻讓?duì)照組、雷帕霉素組、雷帕霉素+miR-24高表達(dá)組LC3 Ⅱ蛋白表達(dá)量分別為0.05±0.01、0.48±0.01、0.15±0.02，與空白對(duì)照組比較，雷帕霉素組LC3 Ⅱ蛋白表達(dá)量上調(diào)了860.00%(P<0.05)；雷帕霉素+miR-24高表達(dá)組上調(diào)了200.00%(P<0.05)；與雷帕霉素組比較，雷帕霉素+miR-24高表達(dá)組蛋白表達(dá)量下調(diào)了68.75%(P<0.05)。

3 討論

miRNAs是一類長(zhǎng)19～22 nt的內(nèi)源性單鏈小分子非編碼RNA，近年越來越多的證據(jù)顯示，miRNA在細(xì)胞分化、增殖、遷移和凋亡等過程中起著關(guān)鍵作用。miRNA在眾多人類疾病，如血管疾病和癌癥以及糖尿病等疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[8]。例如，miR-126在內(nèi)皮細(xì)胞中特異性表達(dá)，并參與內(nèi)皮細(xì)胞生物合成、血管發(fā)育及維持血管完整性等生理過程[9]。

自噬普遍存在于絕大多數(shù)真核生物中，細(xì)胞自噬是一種利用溶酶體對(duì)自身受損蛋白質(zhì)和細(xì)胞器進(jìn)行降解，從而為細(xì)胞提供能量和原料來維持自身代謝平衡的高度保守的細(xì)胞降解過程。當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激或輻射等環(huán)境中時(shí)，自噬可能會(huì)被誘發(fā)，一定程度的自噬對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用[10]；但是，當(dāng)自噬不足或自噬過度則會(huì)使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失調(diào)從而損傷細(xì)胞，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11]。許多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展都與細(xì)胞自噬程度的變化有關(guān)。例如在心力衰竭過程中，適度的自噬對(duì)心肌細(xì)胞有保護(hù)作用，而過度自噬則會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡，并可能會(huì)使心力衰竭進(jìn)一步惡化[12]。近年研究發(fā)現(xiàn)，有些miRNAs通過調(diào)控自噬相關(guān)基因表達(dá)，參與自噬過程的調(diào)節(jié)，在心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。Jian等[13]發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞在缺氧復(fù)氧情況下誘發(fā)自噬時(shí)，miR-204可以通過下調(diào)LC3Ⅱ抑制自噬的進(jìn)程，進(jìn)而保護(hù)心肌細(xì)胞，使其免于缺氧復(fù)氧造成的損傷。Small等[14]發(fā)現(xiàn)，在小鼠缺血再灌注心肌中，miRNA-30表達(dá)量明顯減少。自噬相關(guān)基因Beclin-1是miRNA-30的直接作用靶點(diǎn)，通過上調(diào)細(xì)胞自噬水平可影響內(nèi)源性miRNA-30表達(dá)。因此，miRNA-30是通過下調(diào)Beclin-1表達(dá)，進(jìn)而抑制自噬形成。

血管內(nèi)皮細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)的一種重要細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與眾多心血管疾病的生理病理過程密切相關(guān)[15，16]。研究表明，miRNA的特異性改變參與了心血管疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。因此，miRNA是否對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬水平有調(diào)節(jié)作用，以及是否對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生理功能產(chǎn)生影響，是一個(gè)重要的研究課題。本研究通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)雷帕霉素處理后，HUVECs 胞質(zhì)中可見明顯的自噬小體，與文獻(xiàn)[17]中描述的自噬體結(jié)構(gòu)一致，而經(jīng)miR-24+雷帕霉素處理的HUVECs 胞質(zhì)中并未發(fā)現(xiàn)明顯的自噬小體結(jié)構(gòu)。LC3Ⅱ和Beclin-1是自噬的相關(guān)基因，參與了自噬小體的形成，且細(xì)胞中LC3Ⅱ和Beclin-1的蛋白表達(dá)量與自噬發(fā)生的程度密切相關(guān)。本試驗(yàn)免疫組化和Western blotting結(jié)果顯示，經(jīng)雷帕霉素處理的HUVECs，與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞中LC3 Ⅱ和Beclin-1的蛋白表達(dá)量均增多，而雷帕霉素+miR-24高表達(dá)組的HUVECs內(nèi)LC3Ⅱ和Beclin-1的蛋白表達(dá)量明顯少于雷帕霉素組，提示miR-24可抑制自噬相關(guān)基因LC3Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)。同時(shí)CCK-8法和劃痕試驗(yàn)結(jié)果表明，miR-24能顯著抑制HUVECs的增殖。提示miR-24有可能是通過抑制LC3 Ⅱ和Beclin-1基因的表達(dá)，進(jìn)而降低HUVECs的自噬水平，最終導(dǎo)致HUVECs的增殖受到抑制。但是血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的過程受多種因素調(diào)節(jié)，其機(jī)制不僅僅是受單一分子或基因所調(diào)控，所以其具體的分子機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步研究。

本文通過研究miR-24對(duì)自噬相關(guān)基因LC3Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，主要有以下發(fā)現(xiàn)：第一，miR-24對(duì)調(diào)控LC3Ⅱ蛋白和Beclin-1蛋白的表達(dá)具有明顯的調(diào)節(jié)作用；第二，miR-24抑制LC3 Ⅱ和Beclin-1表達(dá)的同時(shí)，也抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移；第三，miR-24很有可能是通過調(diào)控LC3Ⅱ和Beclin-1表達(dá)，進(jìn)而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移。

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Effects of miR-24 on cell proliferation, metastasis and autophagy of HUVECs

YANGPeng,LUOXuelan,MOGuojun,TAOXiaojingSHENFeng,OUHesheng

(CollegeofPharmacy,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To investigate the effects of miR-24 on the cell proliferation, metastasis and autophagy of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).Methods HUVECs were randomly divided into the blank control group, rapamycin + miR-24 high expression group and rapamycin group. The control group was not treated. HUVECs in the rapamycin group were treated with 1000 nmol/L rapamycin for 6 h to establish an autophagic model. HUVECs in the rapamycin + miR-24 high expression group were transfected with miR-24 high expression plasmid. After successful transfection, the cells were treated with 1 000 nmol/L rapamycin for 6 h to establish the autophagic models. The proliferation ability of HUVECs was detected by CCK-8, and the cell migration ability was measured by cell scratch test, the protein expression levels of microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3) and Beclin-1 in HUVECs were detected by immunohistochemistry and Western blotting. The autophagic bodies were observed by transmission electron microscopy.Results Compared with the blank control group, the OD value and migration ratio of the rapamycin group and the rapamycin + miR-24 high expression group were decreased and the expression of Beclin-1 protein and LC3 II protein was increased (P<0.01 orP<0.05). Compared with the rapamycin group, the OD value and migration ratio of the rapamycin + miR-24 high expression group were decreased, and the expression of Beclin-1 and LC3 II protein was decreased (P<0.01 orP<0.05). The results of transmission electron microscopy showed that the distribution of each organelle in the cytoplasm of the blank control group and the rapamycin + miR-24 high expression group was normal, the nucleus morphology was normal and the autophagic bodies were not found in the cytoplasm. In the the rapamycin group, the obvious vacuolar structure and the autophagosome containing part of the bilayer structure conld be seen in the cytoplasm.Conclusion miR-24 significantly inhibits the proliferation, metastasis and autophagy of HUVECs.

human umbilical vein endothelial cells; miRNA-24; cell autophagy; cell proliferation

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( 81373403)。

楊鵬(1991-),男，碩士研究生，主要研究方向?yàn)樾难芊肿铀幚韺W(xué)。E-mail:475394354@qq.com

歐和生(1965-),男，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)樾难芊肿铀幚韺W(xué)。E-mail:hsou01@yahoo.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.007

R34

A

1002-266X(2017)13-0024-04

2017-02-13)