馮衛(wèi)能,張華,陳澤程,唐溢聰,梁劍苗,鄧燕明(廣東省佛山市第一人民醫(yī)院，廣東佛山528000)

血漿EGFR基因突變檢測在晚期非小細(xì)胞肺癌患者EGFR-TKI療效評估中的價值

馮衛(wèi)能,張華,陳澤程,唐溢聰,梁劍苗,鄧燕明
(廣東省佛山市第一人民醫(yī)院，廣東佛山528000)

目的 探討血漿表皮生長因子受體(EGFR)突變狀態(tài)檢測在晚期非小細(xì)胞肺癌患者表皮生長因子受體酪氨酸酶抑制劑(EGFR-TKI)療效評估中的價值。方法 應(yīng)用擴增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS)法檢測70例晚期非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織及血漿的EGFR突變狀態(tài)。以腫瘤組織中的EGFR突變狀態(tài)檢測為對照，計算血漿中EGFR突變狀態(tài)檢測的敏感性、特異性、一致性，并比較兩種檢測對患者EGFR-TKI療效及預(yù)后評估的差異。結(jié)果 以配對的腫瘤組織EGFR突變檢測結(jié)果為對照，ARMS法檢測血漿EGFR突變的敏感性、一致性及特異性分別為58.1%、72.9%、96.3%。在38例經(jīng)過EGFR-TKI治療的患者中，腫瘤組織EGFR突變型患者的有效率及中位無進(jìn)展生存期均優(yōu)于EGFR野生型患者(有效率：69% 比11.1%，P=0.005；無進(jìn)展生存期：10個月比3個月，P=0.003)。血漿EGFR突變型患者與腫瘤組織EGFR突變型患者的有效率及中位無進(jìn)展生存期均相似(有效率：P=0.908；中位無進(jìn)展生存期：P=0.593)。在血漿標(biāo)本中，EGFR突變型患者的中位無進(jìn)展生存期長于EGFR野生型患者(10個月比7個月 ，P=0.032)。EGFR突變型患者的有效率高于EGFR野生型患者，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(70.6%比42.9%，P=0.111)。 結(jié)論 血漿EGFR突變可預(yù)測晚期非小細(xì)胞肺癌患者EGFR-TKI療效，但因較高的假陰性率，血漿EGFR野生型患者需應(yīng)用腫瘤組織進(jìn)一步檢測。

非小細(xì)胞肺癌；擴增阻滯突變系統(tǒng)；表皮生長因子受體；循環(huán)腫瘤DNA

肺癌是世界范圍最常見的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占80%，超過65%的NSCLC在診斷時已屬晚期[1]。表皮生長因子受體酪氨酸酶抑制劑(EGFR-TKI)是目前治療晚期NSCLC主要方法。研究顯示，EGFR基因突變狀態(tài)是EGFR-TKI療效的重要預(yù)測因子， EGFR突變檢測是合理應(yīng)用EGFR-TKI的先決條件[2]。檢測EGFR突變首選應(yīng)用腫瘤組織，但晚期NSCLC腫瘤組織獲取往往比較困難而限制進(jìn)行EGFR突變檢測。近年應(yīng)用患者血液循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)進(jìn)行腫瘤基因分型的“液體活檢”方法受到關(guān)注，“液體活檢”為非侵入性檢查，可以避免組織標(biāo)本量少的問題，有利于提高臨床實踐中EGFR基因突變的檢測率[3]。ARMS法是一種高度敏感的檢測腫瘤組織EGFR突變方法，本研究通過檢測晚期NSCLC患者配對的腫瘤組織和血漿標(biāo)本的EGFR突變狀態(tài)，探討ARMS法檢測血漿EGFR突變在患者EGFR-TKI療效評估中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇本院2011年6月～2013年6月收治的晚期NSCLC患者70例， 均經(jīng)組織學(xué)確診。按2009年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)肺癌TNM分期均為Ⅳ期?；颊吣?9例，女41例；年齡38～78歲、中位年齡62歲；腺癌63例，鱗癌7例；行為狀態(tài)評分(PS)0～1分 54例，PS 2分16例；吸煙20例，不吸煙50例。其中一線接受EGFR-TKI治療13例，二線或二線以上接受EGFR-TKI治療25例。

1.2 治療方法 EGFR-TKI治療方法：吉非替尼 250 mg ，1次/d或厄洛替尼 150 mg ，1次/d，持續(xù)服用直至病情進(jìn)展或毒性不可耐受。療效評估：近期療效按照實體腫瘤的療效評價標(biāo)準(zhǔn)1.1版[4]分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)和疾病進(jìn)展(PD)，獲得CR或PR的患者4周后再確認(rèn)療效。有效率=(CR+PR)病例數(shù)/總病例數(shù)。遠(yuǎn)期療效為無進(jìn)展生存期(PFS)。PFS定義為從EGFR-TKI治療開始至疾病進(jìn)展或任何原因?qū)е滤劳龅臅r間。EGFR-TKI治療結(jié)束后每8周隨訪一次，末次隨訪時間為2016年6月30日。

1.3 血漿及組織EGFR基因突變檢測 收集患者治療前外周靜脈血4 mL，室溫放置2 h后于4 ℃低溫高速離心機離心10 min(3 000 r/min)，取上層液血漿1 mL置入2 mL凍存試管放置-80 ℃冰箱保存。組織標(biāo)本來自本院病理科石蠟包埋組織標(biāo)本。DNA提取:依據(jù)操作說明，應(yīng)用DNeasy血液和組織試劑盒(Qiagen，德國)從5～20 mg腫瘤組織或1 mL血漿中提取DNA。應(yīng)用NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Scientific，美國)測定DNA濃度 。采用人類EGFR基因突變檢測試劑盒(熒光PCR法)(廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司，中國),按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測患者組織及血漿第18～21外顯子最常見的29種體細(xì)胞突變。按照試劑盒說明書結(jié)果判定方法，EGFR突變陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)為：①循環(huán)閾值(Ct)<26；②26≤Ct<29，同時符合ΔCt值(突變Ct-外控Ct)≤11(19-del 突變、L858R 突變)或ΔCt值≤7(G719X 突變)或ΔCt值≤8(S768I 突變、L861Q突變)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。配對腫瘤組織與血漿中EGFR突變狀態(tài)的一致性采用Kappa檢驗。EGFR基因突變狀態(tài)與EGFR-TKI有效率的關(guān)系采用χ2檢驗及Fisher′s精確檢驗。EGFR突變狀態(tài)與PFS的關(guān)系采用Kaplan-Meier法分析，Log-rank檢驗差異性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 晚期NSCLC患者血漿與腫瘤組織中EGFR基因突變狀態(tài)比較 在70例患者配對的腫瘤組織及血漿中，腫瘤組織EGFR基因突變發(fā)生率為61.4%(43/70)，其中19del突變占46.5%(20/43)、L858R突變占44.2%(19/43)、L861Q突變占4.7%(2/43)、G719X突變占2.3%(1/43)、S768I突變占2.3%(1/43)。血漿EGFR基因突變發(fā)生率為37.1%(26/70)，其中19del突變占46.2%(12/26)、L858R突變占42.3%(11/26)、L861Q突變占7.7%(2/26)、S768I突變占3.8%(1/26)。腫瘤組織與血漿檢測EGFR基因突變的一致性為72.9%(51/70)(κ=0.487，P<0.01)。與腫瘤組織檢測EGFR突變相比，血漿檢測EGFR突變的敏感性為58.1%(25/43)、特異性為96.3%(26/27)。

2.2 血漿與腫瘤組織EGFR突變型與野生型晚期NSCLC患者EGFR-TKI有效率比較 腫瘤組織EGFR突變型與野生型患者EGFR-TKI治療的有效率分別為69%(20/29)、11.1%(1/9)，兩者比較，P=0.005。血漿EGFR突變型與野生型患者EGFR-TKI有效率分別為70.6%(12/17)、42.9%(9/21)，兩者比較，P=0.111。血漿與腫瘤組織EGFR突變型患者的有效率比較，P=0.908。

2.3 血漿與腫瘤組織EGFR突變型與野生型晚期NSCLC患者PFS比較 腫瘤組織中EGFR突變型及野生型患者的中位PFS分別為10、3個月，兩者比較，P=0.003。血漿EGFR突變型、野生型患者的PFS分別為12、7個月，兩者比較，P=0.032。腫瘤組織EGFR突變型患者與血漿EGFR突變型患者的中位PFS比較，P=0.593。

3 討論

EGFR突變檢測是合理應(yīng)用EGFR-TKI治療晚期NSCLC的先決條件，腫瘤組織是EGFR突變檢測優(yōu)先選擇的生物材料[2]。但晚期NSCLC組織標(biāo)本主要為肺穿刺或支氣管鏡活檢的小標(biāo)本，31%晚期NSCLC患者因為標(biāo)本量不足而不能實施基因檢測[5]。而且，腫瘤異質(zhì)性會導(dǎo)致活檢的小標(biāo)本不能準(zhǔn)確反映腫瘤整體的基因改變[6]。由于應(yīng)用腫瘤組織進(jìn)行基因檢測存在不足，以血液為生物材料進(jìn)行基因檢測的“液體活檢”成為一種重要的新方法，ctDNA是“液體活檢”最重要的檢測材料之一。

目前，國內(nèi)檢測晚期NSCLC腫瘤組織EGFR基因突變最常用的方法是直接測序法和ARMS法。相比直接測序法，ARMS法具有更高的靈敏性及陰性預(yù)測價值[7]。對于ARMS法檢測腫瘤組織EGFR突變型的患者，EGFR-TKI的有效率為60%～80%，中位PFS為8～10個月，明顯優(yōu)于EGFR野生型患者[7]。本研究結(jié)果與上述報告相似。

近年來，ARMS法也被應(yīng)用于檢測晚期非小細(xì)胞肺癌ctDNA的EGFR突變。Goto等[8]用ARMS法檢測86例晚期NSCLC血漿標(biāo)本EGFR突變，與配對的腫瘤組織標(biāo)本相比，其敏感性、一致性分別為43.1%，100%、 66.3%。另有研究發(fā)現(xiàn),ARMS法檢測晚期NSCLC血漿EGFR突變的敏感性、特異性、一致性分別為48.2%、95.4%、73.6%。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報道相似，敏感性、特異性、一致性分別為58.1%、96.3%、72.9%。提示ARMS法檢測ctDNA的EGFR突變具有高特異性，但靈敏性仍不理想，假陰性率較高(40%～50%)，如果檢測結(jié)果為EGFR野生型，需注意排除假陰性可能。此外，本研究中有1例患者腫瘤組織檢測為EGFR野生型，而ctDNA檢測為EGFR突變型，可能與腫瘤異質(zhì)性有關(guān)[6]。

至今，關(guān)于ARMS法檢測血漿EGFR突變狀態(tài)與EGFR-TKI療效關(guān)系的研究仍然較少。Li等分析結(jié)果顯示，對于ARMS法檢測血漿EGFR突變型的晚期NSCLC患者，EGFR-TKI的有效率及PFS分別為68.4%、7.9個月。而血漿EGFR野生型患者的有效率及PFS分別為38.9%、6.1個月。有研究報告血漿EGFR突變型晚期NSCLC患者的PFS為10.88個月，而血漿EGFR野生型患者的PFS為9.89個月。在本研究中，血漿EGFR突變型患者的有效率及PFS與腫瘤組織EGFR突變型患者相近，PFS明顯長于野生型患者。但由于存在假陰性，對于血漿EGFR野生型患者，EGFR-TKI的有效率仍然高達(dá)42.9%，PFS長達(dá)7個月，明顯優(yōu)于基于腫瘤組織檢測EGFR野生型患者的療效[7]。本研究結(jié)果與既往報告相似，顯示ARMS法檢測血漿EGFR突變陽性可預(yù)測EGFR-TKI治療晚期NSCLC患者的有效率及PFS,但在血漿EGFR野生型患者中不能預(yù)測EGFR-TKI療效。

本研究存在一些不足之處，為回顧性研究，樣本量小，未能對不同的EGFR突變類型(19del突變、L858R突變、L861Q突變、G719X突變、S768I突變等)分別進(jìn)行分析。研究結(jié)果顯示不同EGFR突變類型對EGFR-TKI的療效存在差異，不分EGFR突變類型分析可能影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。

總之，本研究顯示ARMS法檢測血漿EGFR突變狀態(tài)可預(yù)測EGFR-TKI療效。但ARMS法檢測血漿EGFR突變具有較高的假陰性率，如檢測結(jié)果為EGFR野生型，需應(yīng)用腫瘤組織檢測進(jìn)一步確認(rèn)。

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Predictive value of EGFR mutation detection in plasma for the EGFR-TKI efficacy in advanced non-small-cell lung cancer patients

FENGWeineng,ZHANGHua,CHENZecheng,TANGYicong,LIANGJianmiao,DENGYanming

(TheFirstPeople'sHospitalofFoshan,Foshan528000,China)

Objective To investigate the predictive value of epidermal growth factor receptor (EGFR) mutation detection in plasma for the EGFR tyrosine kinase inhibitor (EGFR-TKI) efficacy in advanced non-small-cell lung cancer (NSCLC) patients. Methods EGFR mutations in the tumor tissues and matched plasma samples from 70 advanced NSCLC patients were assessed using amplification refractory mutation system (ARMS). The sensitivity, specificity and consistency of EGFR mutations in plasma were calculated by taking the EGFR mutations in tumor tissues as the control group. The differences of EGFR-TKI efficacy and prognosis were compared between the two detections.Results Compared with the EGFR mutation detection in the matched tumor tissues, the sensitivity, consistency and specificity of EGFR mutations in plasma detected by ARMS was 58.1%, 72.9% and 96.3%, respectively. For the 38 patients treated with EGFR-TKI, the response rate (ORR) and median progression-free survival (PFS) was significantly superior in the EGFR mutant group as compared with the wild-type group in tumor tissue samples (ORR: 69% vs. 11.1%,P=0.005; PFS: 10 months vs. 3 months,P=0.003). ORR and PFS of patients with EGFR mutation in plasma was consistent to that of patients with EGFR mutation in tumor tissues (ORR:P=0.908; PFS:P=0.593). In the plasma samples, PFS of patients with EGFR mutations was longer than that without EGFR mutations (10 months vs 7 months,P=0.032). Patients with EGFR mutations had significantly higher ORR than those without mutations (70.6% vs 42.9%,P=0.111). Conclusions The detection of EGFR mutations in plasma can predict the efficacy of EGFR-TKI. However, due to the high false negative rate in plasma samples, for the patients with wild-type EGFR in plasma, they need further confirmation in tumor tissues.

non-small-cell lung cancer; amplification refractory mutation system;epidermal growth factor receptor; circulating tumor DNA

廣東省科技計劃項目(20120318077)；佛山市科技創(chuàng)新專項基金(2014AG10003)；佛山市醫(yī)學(xué)類科技攻關(guān)項目(2014AB00307)。

馮衛(wèi)能(1972-)，男，副主任醫(yī)師，主要研究方向為肺癌多學(xué)科綜合治療和肺癌轉(zhuǎn)化性研究。E-mail:fengweineng@163.com

鄧燕明(1962-)，女，主任醫(yī)師，主要研究方向為肺癌多學(xué)科綜合治療和肺癌轉(zhuǎn)化性研究。E-mail:yanmingdeng78@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.005

R734.2

A

1002-266X(2017)13-0017-03

2017-01-18)