邰亦成，方琦，談珂嵐，黃貴，張凌焱

(1常州市第一人民醫(yī)院，江蘇常州213000;2杭州市下沙醫(yī)院婦產(chǎn)生殖中心)

E1A基因?qū)θ幦橄侔┘?xì)胞侵襲遷移的影響及機(jī)制

邰亦成1，方琦1，談珂嵐1，黃貴1，張凌焱2

(1常州市第一人民醫(yī)院，江蘇常州213000;2杭州市下沙醫(yī)院婦產(chǎn)生殖中心)

目的 探討E1A基因?qū)θ幦橄侔?TNBC)細(xì)胞侵襲遷移的影響及機(jī)制。方法 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將E1A真核表達(dá)載體(pcDNA3.0-E1A)(E1A穩(wěn)轉(zhuǎn)克隆組)、pcDNA3.0空載質(zhì)粒(空載克隆組)轉(zhuǎn)染至TNBC MDA-MB-231細(xì)胞中，G418篩選得到E1A穩(wěn)定過量表達(dá)的細(xì)胞克隆，以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的MDA-MB-231細(xì)胞為空白對照組。采用Western blotting法對穩(wěn)轉(zhuǎn)克隆進(jìn)行鑒定。細(xì)胞劃痕試驗檢測各組細(xì)胞的遷移能力，Transwell小室試驗檢測各組細(xì)胞的侵襲能力，Western blotting法檢測各組細(xì)胞中HSPA5蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 G418篩選建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-E1A質(zhì)粒的MDA-MB-231細(xì)胞克隆(E1A穩(wěn)轉(zhuǎn)克隆)。與空白對照組和空載克隆組相比，E1A穩(wěn)轉(zhuǎn)克隆組的細(xì)胞遷移和侵襲能力均降低(P均<0.05),細(xì)胞HSPA5蛋白表達(dá)水平下降(P均<0.05)。結(jié)論 E1A基因能夠明顯抑制TNBC細(xì)胞的侵襲遷移，其機(jī)制可能與EA1促進(jìn)HSPA5蛋白降解有關(guān)。

三陰乳腺癌；E1A；細(xì)胞侵襲；細(xì)胞遷移

乳腺癌是一種高度異質(zhì)性疾病，是女性常見惡性腫瘤。我國的乳腺癌發(fā)病率呈逐年升高趨勢，嚴(yán)重威脅著女性健康。根據(jù)不同的分子表型，乳腺癌可分為不同的亞型，其中三陰乳腺癌(TNBC)是指雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體2(HER2)均不表達(dá)的乳腺癌，約占總?cè)橄侔┑?5%[1]，因其ER表達(dá)陰性，TNBC患者并不能受益于內(nèi)分泌治療，而針對HER2的靶向治療在TNBC患者的治療中也無法發(fā)揮作用[2]。TNBC具有發(fā)病年齡早、易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、惡性程度高以及預(yù)后差等特征。腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲遷移是導(dǎo)致乳腺癌患者不良預(yù)后甚至死亡的重要原因之一，且是目前臨床上難以克服的難點(diǎn)，探尋導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生侵襲遷移的內(nèi)在機(jī)制，尋找能夠預(yù)測、甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤侵襲遷移的生物靶標(biāo)，是臨床上亟待解決的問題[3]。腺病毒5型早期區(qū)E1A基因在多種腫瘤中扮演著抑癌基因角色，如前列腺癌[4]、膀胱癌[5]等。目前關(guān)于E1A基因的研究主要集中在增強(qiáng)腫瘤化療敏感性方面，如E1A能夠增強(qiáng)順鉑、紫杉醇對腫瘤細(xì)胞的毒性作用[6],而關(guān)于E1A基因在乳腺癌中的研究相對較少。2016年4月～2017年3月，本研究通過在TNBC細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)E1A基因，檢測E1A基因?qū)NBC細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，并進(jìn)行初步的機(jī)制探討。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑、儀器及其來源 TNBC MDA-MB-231細(xì)胞購自中國上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫，生長于DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS，10×104U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素)中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。胎牛血清(FBS)購自美國Thermo公司，青霉素、鏈霉素購自美國Sigma公司，Lipofectamine 3000、BCA蛋白定量試劑盒均購自美國Thermo公司，鼠抗人單克隆腺病毒5型E1A抗體(ab31686)、鼠抗人單克隆HSPA5/GRP78 BIP抗體(ab201708)均購自美國Abcam公司，鼠抗人β-actin抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，ECL發(fā)光液購自美國Millipore公司，凝膠成像儀購自美國UVP公司，顯微鏡(BX61)購自日本Olympus公司。

1.2 pcDNA3.0-E1A重組質(zhì)粒的構(gòu)建及分組 從GeneBank中調(diào)取E1A基因的編碼區(qū)堿基序列(YP_068018.1)，PCR擴(kuò)增，經(jīng)BamHI和EcoRI酶切后，插入pcDNA3.0真核表達(dá)載體(含有NEO真核抗性基因)，經(jīng)酶切、PCR和測序鑒定，構(gòu)建pcDNA3.0-E1A真核表達(dá)載體。采用脂質(zhì)體Lipofectamine 3000將pcDNA3.0-E1A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞中，采用G418篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)克隆的方法[7]，得到穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.0-E1A質(zhì)粒的細(xì)胞克隆，即E1A穩(wěn)轉(zhuǎn)克隆組；同時，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0空載質(zhì)粒至MDA-MB-231細(xì)胞中，G418篩選得到穩(wěn)轉(zhuǎn)克隆，即空載克隆組；以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的MDA-MB-231細(xì)胞為空白對照組。

1.3 細(xì)胞遷移能力檢測 采用細(xì)胞劃痕試驗。取處于對數(shù)生長期細(xì)胞5×105～7×105個，接種于6孔板中，24 h后，細(xì)胞匯合度達(dá)90%以上；使用移液器槍頭，垂直于6孔板底部，均勻地劃線，每孔3條平行線；PBS洗滌3次，去除漂浮細(xì)胞，加入無血清DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，分別于0、16 h時顯微鏡(400倍)下拍照，并計算細(xì)胞間距離。

1.4 細(xì)胞侵襲力檢測 采用Transwell小室試驗。Transwell小室置于24孔板中，在小室的聚碳酸酯膜上加入4.0 μg/μL Matrigel基質(zhì)膠50 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜，使Matrigel基質(zhì)膠凝固；在24孔板下室中加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液500 μL，Transwell小室中加入細(xì)胞懸液(細(xì)胞總數(shù)約1×105個)150 μL；48 h后去除24孔板下室中的培養(yǎng)液，棉簽擦去Transwell小室內(nèi)室膜上的細(xì)胞，結(jié)晶紫溶液(0.1%)染色，室溫5 min，顯微鏡(400倍)下觀察，每孔隨機(jī)選取3個視野拍照，并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

1.5 細(xì)胞中HSPA5蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blotting法。胰酶消化后收集各組細(xì)胞，RIPA蛋白裂解液抽提全蛋白樣品，用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。10% SDS-PAGE膠電泳分離蛋白后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫振蕩封閉2 h，TBST洗膜，然后分別用腺病毒5型E1A抗體、HSPA5/GRP78 BIP抗體、和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗,室溫孵育1 h，加ECL發(fā)光液(進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像儀觀察蛋白條帶。實驗重復(fù)3次。結(jié)果用Image J圖像軟件進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 E1A基因表達(dá)的鑒定 TNBC MDA-MB-231細(xì)胞中，沒有內(nèi)源性E1A蛋白表達(dá)，而當(dāng)pcDNA3.0-E1A質(zhì)粒被成功轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中后，E1A在MDA-MB-231細(xì)胞中能穩(wěn)定表達(dá)。

2.2 E1A基因?qū)DA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響 空白對照組的劃痕愈合率(102.48%±6.59%)與空載克隆組的劃痕愈合率(98.38%±5.47%)之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；E1A穩(wěn)轉(zhuǎn)克隆組的劃痕愈合率(28.42%±2.32%)低于空白對照組和空載克隆組(P均<0.05)。

2.3 E1A基因?qū)DA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響 空白對照組的遷移細(xì)胞數(shù)[(48.92±8.37)個/HP]和空載克隆組的遷移細(xì)胞數(shù)[(45.72±9.72)個/HP]之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與空白對照組和空載克隆組相比，E1A穩(wěn)轉(zhuǎn)克隆組的遷移細(xì)胞數(shù)[(6.33±2.48)個/HP]減少(P均<0.05)。

2.4 各組HSPA5蛋白表達(dá)水平比較 HSPA5蛋白在E1A穩(wěn)轉(zhuǎn)克隆組的相對表達(dá)量為0.21±0.08，顯著低于空白對照組(1.03±0.11)和空載克隆組(0.99±0.09)(P均<0.05)，而空白對照組與空載克隆組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

在乳腺癌細(xì)胞中，E1A能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對EGFR-TKI的敏感性，從而能夠有效地抑制腫瘤生長，而在前列腺癌的臨床治療中，以溶瘤腺病毒為載體的E1A基因靶向治療已經(jīng)進(jìn)入臨床前試驗階段。E1A參與調(diào)控多種基因的表達(dá)進(jìn)而影響它們的功能，如E1A能夠通過靶向p300和TRRAP，抑制MYC啟動子區(qū)組蛋白H3K18和H4K16的乙?；?，進(jìn)而抑制癌基因MYC的轉(zhuǎn)錄翻譯，發(fā)揮抑癌功能。E1A基因在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、化療耐藥以及侵襲遷移中，均具有極其重要的作用。在卵巢癌細(xì)胞中，E1A通過抑制依賴ERK的轉(zhuǎn)錄過程，從而抑制細(xì)胞增殖；E1A可以通過抑制p21和MDM2進(jìn)而促進(jìn)p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；此外，E1A還可以通過誘導(dǎo)DNA損傷應(yīng)答導(dǎo)致BCL-2家族成員降解以及p53聚集，從而激活促凋亡信號通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。E1A基因在逆轉(zhuǎn)腫瘤化療耐藥中占有極其重要的地位，如在對鉑類化療耐藥的卵巢癌細(xì)胞中，E1A能夠通過提高野生型p53蛋白的穩(wěn)定性，顯著抑制細(xì)胞增殖并且增強(qiáng)細(xì)胞凋亡，從而逆轉(zhuǎn)化療耐藥；E1A能夠通過抑制FOXO3a磷酸化過程，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對紫杉醇的化療敏感性。

E1A能夠抑制腫瘤侵襲遷移過程，如E1A干擾CtBP與Zeb-1之間的相互作用，從而激活E-cadherin的蛋白表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲遷移過程[8]；E1A是Axl信號通路的負(fù)調(diào)控因子，而Axl信號通路下游信號分子，如Akt和NF-κB等在腫瘤侵襲遷移過程中發(fā)揮促進(jìn)作用，故E1A可以通過抑制Axl信號通路進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞侵襲遷移過程[9]。

E1A基因在乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲過程中的功能，相關(guān)的文獻(xiàn)報道卻較少，如在HER2表達(dá)陽性的乳腺癌細(xì)胞MCF-7中，E1A可以抑制HER2/neu基因的轉(zhuǎn)錄翻譯，從而抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲遷移[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E1A穩(wěn)轉(zhuǎn)克隆細(xì)胞的遷移和侵襲能力均降低，提示E1A能夠抑制TNBC細(xì)胞的遷移侵襲能力。Su等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，體外試驗中，E1A能夠通過表觀遺傳修飾的方式,特異性抑制miRNA-520h，從而抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移能力；Chang等[12,13]的研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中，E1A能夠誘導(dǎo)HSPA5蛋白發(fā)生去乙酰化進(jìn)而被泛素化降解，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移過程。HSPA5屬于HSP蛋白家族成員之一，參與促進(jìn)多種腫瘤的侵襲遷移過程，如HSPA5基因轉(zhuǎn)錄激活后，能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生侵襲和遷移[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，伴隨著細(xì)胞侵襲遷移能力的減弱，E1A穩(wěn)轉(zhuǎn)克隆細(xì)胞內(nèi)HSPA5蛋白表達(dá)水平也明顯下降，提示E1A基因能夠抑制TNBC細(xì)胞的侵襲遷移能力，可能與E1A促進(jìn)HSPA5蛋白降解有關(guān)。

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Effects of E1A gene on migration and invasion of triple-negative breast cancer cells

TAIYicheng1,FANGQi,TANKelan,HUANGGui,ZHANGLingyan

(1TheFirstPeople′sHospitalofChangzhou,Changzhou213000,China)

Objective To investigate the effects of E1A gene on the migration and invasion of triple-negative breast cancer (TNBC) cells and is mechanism. Methods The eukaryotic expressive vector containing E1A gene (pcDNA3.0-E1A) (E1A stable clone group) and pcDNA3.0 empty plasmid (empty-plasmid clone group) were separately transfected into MDA-MB-231 cells by the lipofectamine, and stable E1A positive clones were selected by G418. Meanwhile, the MDA-MB-231 cells without any transfection were taken as the blank control group. Then Western blotting was utilized to identify the stable clones. The migration and invasion abilities of cells in all groups were analyzed by Scratch test and Transwell assay, respectively. Besides, the protein level of HSPA5 in all groups was detected by Western blotting.Results MDA-MB-231 cell clones stably transfected with pcDNA3.0-E1A plasmid (E1A clones) were successfully established by the G418. The cell migration and invasion abilities of E1A clones in the E1A stable clone group were much lower as compared with those of the blank control group and the empty-plasmid clone group (P<0.05), accompanied by the down-regulated expression of HSPA5 protein (allP<0.05). Conclusion E1A gene can significantly inhibit the cell invasion and migration of TNBC cells in vitro by E1A promoting the protein degradation of HSPA5.

triple-negative breast cancer; E1A; cell invasion; cell migration

江蘇省科學(xué)技術(shù)廳科技成果(20150014)；常州科技計劃項目 (CJ20140028)。

邰亦成(1983-)，女，主治醫(yī)師，主要研究方向為乳腺外科疾病的診斷治療。E-mail：taiyicheng_1983@126.com

張凌焱(1982-)，女，主治醫(yī)師，主要研究方向為婦科生殖性疾病的診斷治療。E-mail：fangqi_1972@medicinepap.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.29.007

R737.9

A

1002-266X(2017)29-0023-03

2017-06-06)