陳會花(綜述) 章 忱 呂 嶸(審校)

(上海中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室 上海 201203)

RyR2磷酸化在心力衰竭中的作用

陳會花(綜述) 章 忱 呂 嶸△(審校)

(上海中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室 上海 201203)

心力衰竭在細(xì)胞水平主要表現(xiàn)為心肌以興奮-收縮耦聯(lián)(excitement-contraction coupling,ECC)為基礎(chǔ)的收縮功能障礙,而Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在此過程中起著非常重要的作用。肌漿網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum,SR)蘭尼堿受體(ryanodine receptor type 2,RyR2)是心肌最重要的鈣釋放通道,RyR2磷酸化是肌漿網(wǎng)鈣釋放的基礎(chǔ),而RyR2磷酸化主要受蛋白激酶A (protein kinase A ,PKA)和鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ (calcium/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)的調(diào)控。目前對RyR2磷酸化的研究已經(jīng)非常廣泛,但對其涉及心力衰竭的具體發(fā)病機(jī)制仍有爭議,本綜述主要針此問題進(jìn)行闡述。

蘭尼堿受體; 心力衰竭; 蛋白激酶A; 鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ

目前,心衰是引起死亡率和發(fā)病率升高的一個主要原因,嚴(yán)重威脅人類的生命健康。據(jù)最新研究[1]報道,全球每年約有1 750萬人死于心血管疾病,占全球死亡人數(shù)的31.25%,有研究[2]預(yù)測至2030年,死亡人數(shù)可能增至2 330萬,國外流行病學(xué)資料[3]顯示,心衰患者5年存活率為50%,40%的患者1年內(nèi)會因心衰再次入院,有臨床癥狀的患者5 年存活率更與腫瘤患者相似。

蘭尼堿受體(RyR2)在興奮收縮耦聯(lián)中的作用 細(xì)胞膜去極化導(dǎo)致L-型鈣通道(L-type Ca2+channels,LTCCs)開放,胞外Ca2+內(nèi)流,激活位于SR上的(ryanodine receptor type 2,RyR2),使SR中的Ca2+大量釋放進(jìn)胞質(zhì),這個過程就是“鈣誘導(dǎo)的鈣釋放”(Ca2+-induced Ca2+release,CICR)[4]。位于橫管的LTCCs和位于肌漿網(wǎng)的RyR2極為貼近,這種高度精準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)是引起“鈣瞬變”的基礎(chǔ)。胞質(zhì)Ca2+濃度的升高可激活肌球蛋白頭部的Ca2+-Mg2+-ATP酶,水解ATP釋放能量,引發(fā)心肌收縮,完成由化學(xué)能向機(jī)械能的轉(zhuǎn)化,形成一次興奮-收縮耦聯(lián)[5]。心肌收縮后胞質(zhì)內(nèi)游離的Ca2+經(jīng)SR上的鈣泵肌質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶(sarco /endoplasic Ca2+-ATPase,SERCA)泵回SR 中儲存,另外多余的Ca2 +經(jīng)鈉鈣交換體(Na+/Ca2+-exchanger,NCX1)泵出胞外[6]。

心衰過程中,心臟需要經(jīng)歷代償性的改變,這種改變最終抑制胞內(nèi)的鈣循環(huán),并且降低SR內(nèi)的鈣容量。因此,鈣誘導(dǎo)釋放的Ca2+就會減少,最終導(dǎo)致興奮-收縮耦聯(lián)時產(chǎn)生的收縮力降低[7]。RyR2是興奮-收縮耦聯(lián)過程中主要的Ca2 +釋放通道,SR經(jīng)RyR2釋放Ca2+的量決定了鈣瞬變的幅度,而鈣瞬變的幅度與心肌收縮的力度相關(guān)[5]。

RyR2結(jié)構(gòu)及其磷酸化 RyR2屬于RyR家族,是目前已知相對分子質(zhì)量最大的離子通道,根據(jù)RyR最初純化的時間和組織來源不同,RyR受體共有3種亞型:RyR1、RyR2和RyR3,而RyR2主要分布于哺乳動物心肌細(xì)胞中[8]。最近Zalk等[9]成功解析了RyR的結(jié)構(gòu),RyR2是一種同源四聚體,四個原聚體圍繞成一個中央橫跨膜的孔隙,這個孔隙與四聚體的四重對稱軸一致。每個結(jié)構(gòu)是以重復(fù)延伸的α-螺線管結(jié)構(gòu)(α-solenoid)為基礎(chǔ)的,α-solenoid由5部分組成:3個SPRY區(qū)域(SPRY1,SPRY2和 SPRY3)和2對重復(fù)序列的RYR(RY12和 RY34),許多輔助蛋白都結(jié)合在α-solenoid上,包括FKBP12.6、鈣調(diào)蛋白、肌集鈣蛋白-2、連接素、三合蛋白、親連蛋白-2。另外原聚體還含有嵌入的EF-hands,它是以前假設(shè)的Ca2+結(jié)合域的主要組成,是鈣離子激活構(gòu)象的開關(guān),因此與Ca2+結(jié)合的EF-hands可以調(diào)節(jié)形成孔隙的跨膜螺旋管的構(gòu)象,這樣每次離子大振幅的集體運(yùn)動就可以增加通道打開的概率。這個機(jī)制也很好的解釋了Ca2+的結(jié)合是如何增加通道打開的機(jī)率卻不改變打開的周期,同時也可以解釋RyR胞質(zhì)區(qū)結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白是如何起門控作用[9-11]。

RyR2有多個磷酸化位點(diǎn),每一個位點(diǎn)磷酸化的穩(wěn)態(tài)程度受多重蛋白激酶和磷酸酶的動態(tài)平衡影響,這可以精確的調(diào)控RyR2的磷酸化,最終調(diào)控通道活性。雖然絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶也有可能磷酸化RyR2,但大多數(shù)的研究主要在PKA和CaMKⅡ介導(dǎo)RyR2磷酸化方面[12-13]。

絲氨酸-2808(serine-2808,S2808,一些物種是S2809)是第一個被認(rèn)證為RyR2殘基的磷酸化位點(diǎn),并且被認(rèn)為是PKA磷酸化RyR2的主要靶點(diǎn)。Marx等[13-14]和Wehrens等[15]在二維的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)上實(shí)驗,發(fā)現(xiàn)增加PKA純度可以增加單個RyR2通道打開的概率;若將S-2808突變?yōu)楸彼岷?RyR2則不能被PKA磷酸化,RyR2通道打開的概率不會增加[16]。

絲氨酸-2814 (S2814,一些物種是S2815) 是第2個被認(rèn)證為RyR2殘基的磷酸化位點(diǎn),它是CaMK II磷酸化RyR2的主要靶點(diǎn)[16]。雖然對CaMK II磷酸化RyR2的作用靶點(diǎn)仍有爭議,但目前存在的一個共識是CaMKII介導(dǎo)RyR2磷酸化可以增加RyR2通道打開的概率。有研究[9]報道,不論在磷脂雙分子層的單通道水平還是在心室肌細(xì)胞水平上,都顯示CaMK II促進(jìn)鈣火花頻率增加。Wehrens等[15-16]和Respress等[17]將S2814突變后,可以抑制CaMK II對RyR2的主要作用,這提示S2814是CaMKII磷酸化RyR2的主要靶點(diǎn),但不是唯一靶點(diǎn)。

幾年前,絲氨酸-2030 (S2030,有些物種是S2031)曾被認(rèn)為是RyR2磷酸化第3個靶點(diǎn)。Xiao等[18]實(shí)驗發(fā)現(xiàn),PKA磷酸化RyR2 S2030位點(diǎn)可以增加肌質(zhì)網(wǎng)對Ca2+的敏感性。但Wehrens等[15]和Huke等[19]都沒有證明這個磷酸化位點(diǎn),因此S2030的生理功能還有待進(jìn)一步研究。

心衰過程中RyR2磷酸化的改變 RyR2磷酸化在心衰中起重要作用,在心衰患者和動物模型中,我們都可以觀察到RyR2硫酸化增加導(dǎo)致的SR鈣滲漏增加[20-21]。然而,RyR2磷酸化在心衰中的病理機(jī)制存在很大的爭論。

PKA介導(dǎo)RyR2的過度磷酸化 最早證明心衰患者RyR2磷酸化發(fā)生改變的文章是由Marx等[14]在2000年發(fā)表。Marx等[14]Wehrens等[15]和Shan等[22]提出一個假設(shè):心衰時交感神經(jīng)興奮,激活PKA介導(dǎo)的RyR2 S2808過度磷酸化,同時抑制FKBP12.6與RyR2結(jié)合,增加RyR2打開的概率。

但此假設(shè)目前存在很大爭議。最大的爭議就是RyR2 S2808過度磷酸化是否在心衰過程中起決定性作用。Wehrens等[15]認(rèn)為RyR2 S2808磷酸化在實(shí)驗性心肌缺血誘導(dǎo)的心衰進(jìn)程中起關(guān)鍵作用。他們用RyR2 S2808敲除小鼠和野生型小鼠同時進(jìn)行心肌缺血造模,造模4周后進(jìn)行心功能檢測,結(jié)果顯示RyR2 S2808敲除小鼠較野生型小鼠在射血分?jǐn)?shù)、收縮分?jǐn)?shù)、每搏輸出量、左室內(nèi)壓最大上升速率以及左室內(nèi)壓最大下降速率等心功能方面明顯改善。同時,他們還發(fā)現(xiàn)RyR2 S2808敲除小鼠的RyR2不能被PKA磷酸化,并且PKA失去對FKBP12.6的調(diào)節(jié),導(dǎo)致FKBP12.6不能與RyR2解離。然而,Zhang等[23]和Houser等[24]卻認(rèn)為PKA介導(dǎo)的RyR2 S2808過度磷酸化并不能改變心肌收縮性,也不能改善心衰和心律失常的癥狀。他們同樣用RyR2 S2808敲除小鼠和野生型小鼠同時進(jìn)行心肌缺血造模,造模4周后進(jìn)行心功能檢測,卻發(fā)現(xiàn)心功能沒有任何改善。他們認(rèn)為目前對交感神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控心肌收縮的分子機(jī)制研究已經(jīng)非常透徹,并且經(jīng)典的β-腎上腺素受體激活LTCCs和SERCa的PLN通路完全可以解釋。PKA介導(dǎo)的LTCCs- RyR2復(fù)合體磷酸化可以增加LTCCs打開的概率,導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流增加,這一過程與交感神經(jīng)調(diào)控一致。由于LTCCs介導(dǎo)的CICR完全可以激活興奮-收縮耦聯(lián),所以這些反應(yīng)不會明顯改變釋放儲存鈣離子復(fù)合物的數(shù)量。然而,通過激活交感神經(jīng)增加LTCC鈣內(nèi)流,可以增加肌質(zhì)網(wǎng)的鈣儲備,使肌質(zhì)網(wǎng)鈣負(fù)荷逐漸增加。經(jīng)LTCC流入的鈣離子主要用于肌質(zhì)網(wǎng)的鈣釋放和鈣負(fù)荷,這是近幾十年被公認(rèn)的。

結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ),同時功能也改變結(jié)構(gòu),最近對RyR2結(jié)構(gòu)的解析越加明確,從結(jié)構(gòu)上支持第一種觀點(diǎn);Houser等實(shí)驗存在最大的一個問題是樣本數(shù)量少,所以結(jié)果存在假陽性和假陰性的可能比較大;對于關(guān)鍵的心功能檢測,Wehrens等[15]用M型超聲和壓力-容積電導(dǎo)導(dǎo)管技術(shù)同時進(jìn)行檢測,而Houser等只用M型超聲檢測心功能。

CaMKⅡ介導(dǎo)的RyR2磷酸化 目前許多研究[25-28]認(rèn)為CaMKⅡ通過氧化應(yīng)激通路或者基因突變介導(dǎo)RyR S2814磷酸化,使RyR2通道在舒張期或興奮-收縮耦聯(lián)時激活釋放Ca2+。因為在心肌梗死、急性或慢性胸主動脈縮窄、缺血再灌注損傷以及異丙腎上腺素、血管緊張素II、醛固酮誘導(dǎo)等多種心衰模型中,CaMK II抑制劑在都可以起作用。Van Oort等[11]發(fā)現(xiàn),CaMKⅡ介導(dǎo)RyR2磷酸化是心衰、心律失常發(fā)生的主要原因。但Wehrens等[16]發(fā)現(xiàn),在非缺血的擴(kuò)張性心肌病患者中,RyR2 S2815磷酸化水平升高,而在缺血性心肌病中,RyR2 S2815磷酸化水平則不會升高。同時他們用RyRS2814A (點(diǎn)突變)的小鼠再次進(jìn)行驗證,發(fā)現(xiàn)當(dāng)RyRS2814A小鼠用胸主動脈結(jié)扎誘導(dǎo)壓力超負(fù)荷的心力衰竭模型時,可以顯著降低肌質(zhì)網(wǎng)的Ca2+滲漏,增加肌質(zhì)網(wǎng)的Ca2+負(fù)荷,顯著改善EF、FS、+dP/dt等心功能指標(biāo);但是,如果RyRS2814A小鼠用心肌梗死誘導(dǎo)心衰模型時,則不會出現(xiàn)這種改變。這與他們在臨床觀察到的結(jié)果相一致。另外,他們用野生型小鼠行胸主動脈結(jié)扎術(shù),發(fā)現(xiàn)造模后8～16周,RyR2 S2814A磷酸化水平顯著增加。

最新研究[29]表明,PKA和CaMKⅡ在調(diào)控RyR2磷酸化時是有交互作用的,PKA既可以通過Ca2+直接激活CaMKⅡ,又可以通過激活磷酸二酯酶從而抑制CaMKⅡ;而CaMKⅡ同樣也可以通過激活磷酸二酯酶從而抑制PKA的活性。

從大量文獻(xiàn)可以看出,RyR磷酸化在心衰過程中的關(guān)鍵作用是毋庸置疑的,但具體是通過哪條通路,激活哪個位點(diǎn)仍有很大的爭議。引起爭議的原因有很多,例如心衰模型類型、動物背景、實(shí)驗方法、試劑等等。由于調(diào)控RyR2的上游信號分子眾多,信號通路復(fù)雜,所以實(shí)驗條件稍有不同就會導(dǎo)致結(jié)果大相徑庭。但科技在不斷進(jìn)步,最近Peng等[30]首次報道了RyR2處于關(guān)閉和開放兩種不同狀態(tài)的近原子分辨率冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu),這無疑是分子結(jié)構(gòu)領(lǐng)域的重大突破,這對研究RyR2在心衰時的結(jié)構(gòu)改變以及作用機(jī)制都有巨大的幫助,同時也為心衰時對RyR2進(jìn)行靶點(diǎn)治療提供了可能。

[1] MENDIS S,DAVIS S,NORRVING B.Organizational update:the world health organization global status report on noncommunicable diseases 2014;one more landmark step in the combat against stroke and vascular disease[J].Stroke,2015,46(5):e121-e122.

[2] MATHERS CD,LONCAR D.Projections of global mortality and burden of disease from 2002 to 2030[J].PloSMed,2006,3(11) :2011-2030.

[3] BUI AL,HORWICH TB,FONAROW GC.Epidemiology and risk profile of heart failure [J].NatRevCardiol,2011,8(1):30-41.

[4] ANTOONS G,JOHNSON DM,DRIES E,etal. Calcium release near L-type calcium channels promotes beat-to-beat variability in ventricular myocytes from the chronic AV block dog[J].JMolCellCardiol,2015,89:326-334.

[5] BERS DM.Cardiac excitation-contraction coupling[J].Nature,2002,415(6868):198-205.

[6] FABIATO A.Time and calcium dependence of activation and inactivation of calcium-induced release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of a skinned canine cardiac purkinje cell [J].JGenPhysiol,1985,85:247-289.

[7] ATHER S,RESPRESS JL,LI N,etal.Alterations in Ryanodine Receptors and Related Proteins in Heart Failure[J].BiochimBiophysActa,2013,V1832(12):2425-31.

[8] OTSU K,WILLARD HF,KHANNA VK,etal. Molecular cloning of cDNA encoding the Ca2+release channel (ryanodine receptor) of rabbit cardiac muscle sarcoplasmic reticulum[J].JBiolChem,1990,265(23):13472-83.

[9] ZALK R,CLARKE OB,DES GEORGES A,etal.Structure of a mammalian ryanodine receptor [J].Nature,2015,517(7532):44-49.

[10] EFREMOV RG,LEITNER A,AEBERSOLD R,etal.Architecture and conformational switch mechanism of the ryanodine receptor [J].Nature,2015;517:39-43.

[11] VAN OORT RJ,MCCAULEY MD,DIXIT SS,etal.Ryanodine receptor phosphorylation by calcium/calmodulin-dependent protein kinase II promotes life-threatening ventricular arrhythmias in mice with heart failure [J].Circulation,2010,122(25):2669-2679.

[12] HEIJMAN J,DEWENTER M,El-ARMOUCHE A,etal.Function and regulation of serine/threonine phosphatases in the healthy and diseased heart [J].JMolCellCardiol,2013,64:90-98.

[13] MARX SO,MARKS AR.Dysfunctional ryanodine receptors in the heart:new insights into complex cardiovascular diseases [J].JMolCellCardiol,2013,58:225-231.

[14] MARX SO,REIKEN S,HISAMATSU Y,etal.PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor):defective regulation in failing hearts [J].Cell,2000,101:365-376.

[15] WEHRENS XH,LEHNART SE,REIKEN S,etal.Ryanodine receptor/calcium release channel PKA phosphorylation:a critical mediator of heart failure progression [J].ProcNatlAcadSciUSA,2006,103:511-518.

[16] WEHRENS XH,LEHNART SE,REIKEN S,etal.Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II phosphorylation regulates the cardiac ryanodine receptor [J].CircRes,2004,94:61-70.

[17] RESPRESS JL,VAN OORT RJ,LI N,etal.Role of RyR2 phosphorylation at S2814 during heart failure progression[J].CircRes,2012,110:1474-1483.

[18] XIAO B,ZHONG G,OBAYASHI M,etal.Ser-2030,but not Ser-2808,is the major phosphorylation site in cardiac ryanodine receptors responding to protein kinase A activation upon beta-adrenergic stimulation in normal and failing hearts [J].BiochemJ,2006,396:7-16.

[19] HUKE S,BERS DM.Ryanodine receptor phosphorylation at Serine 2030,2808 and 2814 in rat cardiomyocytes [J].BiochemBiophysResCommun,2008,376:80-85.

[20] ROUSSEL J,THIREAU J,BRENNER C,etal.Palmitoyl-carnitine increases RyR2 oxidation and sarcoplasmic reticulum Ca2+leak in cardiomyocytes:Role of adenine nucleotide translocase [J].BiochimBiophysActa,2015,1852(5):749-758..

[21] MUNKVIK M,REHN TA,SLETTAL?KKEN G,etal.Training effects on skeletal muscle calcium handling in human chronic heart failure[J].MedSciSportsExerc,2010, 42(5):847-855.

[22] SHAN J,BETZENHAUSER MJ,KUSHNIR A,etal. Role of chronic ryanodine receptor phosphorylation in heart failure and β-adrenergic receptor blockade in mice [J].JClinInvest,2010,120:4375-4387.

[23] ZHANG H,MAKAREWICH CA,KUBO H,etal. Hyperphosphorylation of the cardiac ryanodine receptor at serine 2808 is not involved in cardiac dysfunction after myocardial infarction [J].CircRes,2012,110:831-840.

[24] HOUSER SR.Protein kinase A-mediated hyperphosphorylation of the ryanodine receptor at serine 2808 does not alter cardiac contractility or cause heart failure and arrhythmias [J].CircRes,2014,114:1320-1327.

[25] FISCHER TH,HERTING J,TIRILOMIS T,etal. Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase A differentially regulate sarcoplasmic reticulum Ca2+leak in human cardiac pathology [J].Circulation,2013,128:970-981.

[26] SWAMINATHAN PD,PUROHIT A,SONI S,etal.Oxidized CaMKII causes cardiac sinus node dysfunction in mice [J].JClinInvest,2011,121:3277-3288.

[27] UCHINOUMI H,YANO M,SUETOMI T,etal. Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia is caused by mutation-linked defective conformational regulation of the ryanodine receptor [J].CircRes,2010,106:1413-1424.

[28] LUO M,ANDERSON ME.Mechanisms of altered Ca2+handling in heart failure [J].CircRes,2013,113:690-708.

[29] MIKA D,RICHTER W,CONTI M.A CaMKII/PDE4D negative feedback regulates cAMP signaling [J].ProcNatlAcadSci,2015,112(7):2023-2028.

[30] PENG W,SHEN H,WU J,etal.Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor RyR2[J].Science,2016,354(6310):pii: aah5324.

The role of RyR2 phosphorylation in heart failure

CHEN Hui-hua, ZHANG Chen,LYU Rong△

(DepartmentofPathology,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China)

Heart failure is mainly characterized by myocardial systolic dysfunction ,which is based on excitement-contraction coupling on the cellular level,and calcium (Ca2+)signaling plays a very important role in this process.The ryanodine receptor (RyR)/calcium release channel on the sarcoplasmic reticulum (SR) is the major Ca2+source of required for cardiac muscle excitation-contraction coupling.RyR2 phosphorylation is the basis of SR calcium release,and RyR2 phosphorylation is mainly controled by protein kinase A (PKA) and calcium/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ (CaMK Ⅱ).Although widely research in this area,excessive activation of RyR2 phosphorylation involved in the pathogenesis of heart failure are still controversial,which is discussed in this review.

ryanodine receptor; heart failure; protein kinase A; calcium/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ

國家自然科學(xué)基金(81373858)

R541.6

B

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.03.018

2016-07-28;編輯:王蔚)

△Corresponding author E-mail:lurong@shutcm.edu.cn

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81373858).