吳錦波，葉小漢，冼紹祥，董明國

基礎與實驗研究

比索洛爾改善心力衰竭大鼠心功能的機制探討

吳錦波，葉小漢，冼紹祥，董明國

目的：觀察比索洛爾對心力衰竭大鼠心功能的影響，并探討其機制。

心力衰竭；肌細胞，心臟；微小核糖核酸

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:274.)

慢性心力衰竭（CHF）是多種心血管疾病的終末期表現(xiàn)，心力衰竭歸根究底是心肌收縮和（或）舒張功能受損，心肌細胞興奮-收縮耦聯(lián)障礙。肌漿網鈣ATP酶2a （SERCA2a）對興奮-收縮耦聯(lián)具有重要調控作用。動物實驗和臨床試驗表明，轉SERCA2a基因治療可以改善實驗動物和CHF患者的心功能[1、2]；抑制微小核糖核酸-25（miR-25）表達也可以提高SERCA2a表達水平，改善心功能[3]。β受體阻滯劑可以上調衰竭心臟β1受體并恢復其正常功能，改善心功能，提高左心室射血分數(shù)（LVEF）。β受體阻滯劑常與血管緊張素轉換酶抑制劑聯(lián)合應用，已經成為治療CHF的基石[4]。研究發(fā)現(xiàn)：美托洛爾可以使衰竭心臟SERCA2a的蛋白水平和活性正?；痆5]，這是美托洛爾治療CHF的分子機制之一。CIBIS-Ⅱ臨床試驗顯示，比索洛爾能降低CHF患者的病死率和再住院率[6]。然而，關于比索洛爾治療CHF的分子機制研究報道較少。本實驗通過腹腔注射阿霉素建立CHF大鼠模型，觀察比索洛爾對大鼠心功能和SERCA2a活性的影響，并探討其對SERCA2a、受磷蛋白（PLB）和miR-25-3p表達水平的影響，進一步探討比索洛爾治療CHF的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康雄性SD大鼠80只，平均體質量（230±20） g，由廣州中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供[動物許可證號：SCXK（粵）2013-0020；動物合格證號：440059000]。SPF級凈化空間，生長條件為12 h/12 h光照周期，溫度（22±3） ℃，相對濕度40%～70%，自由攝食、飲水。實驗藥物采用指南[1]推薦劑量，并經過人與大鼠體表面積換算。比索洛爾（德國Merck Serono，批號：191839）189 mg加無菌蒸餾水2100 ml，制成濃度為0.09 mg/ml的溶液，灌胃劑量為0.9 mg/（kg·d）。卡托普利（中美上海施貴寶，批號：AAB9465）2205 mg加無菌蒸餾水2100 ml，制成濃度為1.05 mg/ml的溶液，灌胃劑量為10.5 mg/（kg·d）。阿霉素（美國Medchemexpress LLC，批號：HY-15142）；氯胺酮（福建古田藥業(yè)，批號：1504153）；地西泮（天津金耀藥業(yè)，批號：1507077）。

主要試劑：酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自美國RayBiotech公司；超微量Ca2+-ATP酶檢測試劑盒由南京建成提供；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒由碧云天生物技術研究所提供；β-actin抗體、SERCA2a抗體由美國Santa Cruz公司提供；PLB抗體購自美國Abgent公司；miR-25-3p反義探針購自上海GenePharma公司；U6反義探針購自美國Sigma公司；增強型化學發(fā)光液（ ECL）購自美國Millipore公司。逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RTPCR）試劑由德國DBI公司提供。

主要儀器：HP5500心臟超聲儀（美國惠普）；GDS7600凝膠掃描系統(tǒng)（英國UVP公司）；ABI9700PCR擴增儀（美國ABI公司）。

1.2 動物造模、分組及檢測指標

雄性SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，參照文獻[7]，采用阿霉素腹腔注射法（用滅菌注射用水溶解成0.25 mg/ml溶液，每次注射劑量為2.5 mg/kg，2周內分6次注射，總劑量15 mg/kg）建立CHF大鼠模型。首次腹腔注射5周后應用心臟超聲儀檢測并計算左心室短軸縮短率（FS），以心腔擴大，F(xiàn)S＜30%作為CHF成模標準。

80只大鼠隨機選取10只為正常對照組，10只作為假手術組，假手術組腹腔注射10 ml/kg的生理鹽水。采用阿霉素腹腔注射法造模共60只，造模過程中有15只大鼠因出現(xiàn)重度心力衰竭和肝硬化腹水而死亡，死亡率為25%；FS不達標5只，成模率為67%。40只成功造模大鼠按隨機數(shù)字表法分成4組：模型組（n=10）、比索洛爾組（n=10）、卡托普利組（n=10）和比索洛爾＋卡托普利組（n=10），后三組分別以比索洛爾[0.9 mg/（kg·d）]、卡托普利[10.5 mg/（kg·d）]和比索洛爾[0.9 mg/（kg·d）]＋卡托普利[10.5 mg/（kg·d）]灌胃，每天1 次，連續(xù)35天；其余各組以10 ml/kg的蒸餾水灌胃。在隨后的實驗干預中，每組各有1只大鼠因灌胃不當而死亡。

大鼠心功能指標檢測：干預前后采用腹腔注射氯胺酮（50 mg/kg）和地西泮（5 mg/kg）混合麻醉大鼠，胸前剃毛，大鼠取仰臥位，固定在木板上，應用心臟超聲儀，分別測量左心室舒張末期內徑（LVEDD）、左心室收縮末期內徑（LVESD）等，計算FS、心排出量（CO）和LVEF。

ELISA法檢測血漿B型利鈉肽（BNP）水平：處死大鼠時腹主動脈取血，肝素抗凝，靜置1 h，300×g離心10 min，取上清－20℃冰箱保存，按試劑盒說明書進行操作。

莖環(huán)狀引物實時定量RT-PCR檢測大鼠心肌miR-25-3p表達水平：取大鼠心室肌組織100 mg勻漿后，用Trizol法抽提心肌總RNA。逆轉錄反應獲得c DNA，莖環(huán)狀引物實時定量PCR測定miR-25-3p的表達量。PCR反應條件：94℃預變性2 min，94℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，PCR 擴增40循環(huán)。電泳、凝膠成像，軟件分析。以U6作為內參，以2-△△Ct公式計算miR-25-3p的相對表達水平。引物設計及PCR反應均由廣州維伯鑫生物科技有限公司完成。PCR引物見表1。

表1 莖環(huán)狀引物實時定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應引物

免疫蛋白印跡法（Western blot）檢測心肌細胞SERCA2a和PLB的蛋白表達水平：取100 mg心肌組織，加入裂解液，冰上裂解1 h，提取細胞內蛋白，用BCA法進行蛋白定量[8]。取各組蛋白樣品進行SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后用牛血清蛋白封閉，經Ⅰ抗結合后洗膜，Ⅱ抗結合，洗膜后采用ECL顯色，軟件分析。以SERCA2a和PLB的平均灰度值與相應內參照蛋白β-actin的平均灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量，計算SERCA2a/PLB比值。

定磷法測定SERCA2a活性：參照文獻[9]測定心肌ESRCA2a活性。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料采用均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，SLD法進行組間兩兩比較，率的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較

CHF大鼠出現(xiàn)不同程度的食欲減退、精神較差、張口呼吸和乏力等癥狀。模型組、比索洛爾組、卡托普利組和比索洛爾＋卡托普利組術后體重分別為（325.0+50.8）g、（338.6 ±57.4）g、（341.3 ±51.5）g和（334.7±58.2）g，均明顯低于正常對照組（443.2±69.3）g，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；術后5周內模型組、比索洛爾組、卡托普利組和比索洛爾＋卡托普利組大鼠體重有不同程度回升，分別為（343.5±86.1）g、（475.2±32.7）g、（473.5±25.3）g和（480.4+25.5）g，比索洛爾組、卡托普利組和比索洛爾＋卡托普利組明顯高于模型組（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義。

2.2 各組大鼠心功能指標、血漿BNP水平比較（表2）

干預后，模型組FS、CO和LVEF明顯低于正常對照組和假手術組（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義；比索洛爾組、卡托普利組和比索洛爾＋卡托普利組FS、CO和LVEF明顯高于模型組（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義。模型組血漿BNP水平顯著高于正常對照組和假手術組（P＜0.01），比索洛爾組、卡托普利組和比索洛爾＋卡托普利組顯著低于模型組（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義。

表2 各組大鼠心功能指標、血漿B型利鈉肽水平比較

表2 各組大鼠心功能指標、血漿B型利鈉肽水平比較

注：與正常對照組和假手術組比較*P＜0.01；與模型組比較△P＜0.01

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2.3 各組大鼠心肌miR-25-3p的表達水平比較（圖1）

模型組miR-25-3p 表達水平明顯高于正常對照組和假手術組（P＜0.01），卡托普利組、比索洛爾組和比索洛爾＋卡托普利組miR-25-3p 表達水平顯著低于模型組（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 各組大鼠心肌miR-25-3p的相對表達水平比較（n=9）

2.4 各組大鼠心肌細胞SERCA2a和PLB的蛋白表達水平比較（圖2）

模型組SERCA2a和PLB表達水平明顯低于正常對照組（P＜0.01），降幅分別為83.5%和62.4%，SERCA2a降幅大于PLB，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。比索洛爾組、卡托普利組和比索洛爾＋卡托普利組SERCA2a和PLB表達水平明顯高于模型組（P＜0.01），升幅分別為315.3%和122.4%、201.8%和87.2%、311.3%和118.6%，SERCA2a升幅均大于PLB（P＜0.01）。比索洛爾組和比索洛爾＋卡托普利組SERCA2a/PLB比值[（6.16±0.34）和（6.05±0.35）]明顯高于模型組（3.82±0.57），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.6 各組 大鼠心肌SERCA2a活性比較（圖3）

模型組SERCA2a活性顯著低于正常對照組和假手術組（P＜0.01），比索洛爾組和比索洛爾＋卡托普利組SERCA2a活性顯著高于模型組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義。

圖2 各組大鼠心肌細胞SERCA2a和PLB的相對表達水平的比較（n=9）

圖3 各組大鼠心肌SERCA2a活性的比較（n=9）

3 討論

大量的實驗研究證明，SERCA2a具有正性肌力和正性變舒效應，能夠提高心肌收縮力和改善舒張功能[1]。SERCA2a的含量與心臟指數(shù)、肺動脈壓等血流動力學指標相關，與去甲腎上腺素正相關，與心鈉素的mRNA含量負相關[10]。SERCA2a的含量還受miR-25的影響。研究發(fā)現(xiàn)：miR-25選擇性作用于SERCA2a mRNA 3'非翻譯區(qū)的結合位點，干擾SERCA2a 的合成從而降低其水平；通過給經主動脈縮窄術誘導的心衰小鼠注射Anti-miR-25可以降低miR-25水平，增加SERCA2a水平。miR-25-3p可能與miR-25一樣，通過不精確的堿基配對與SERCA2a mRNA上的特異識別元件結合從而干擾其翻譯[3]。心肌SERCA2a活性主要受PLB調控，PLB與SERCA2a結合可誘導其構象變化，減少SERCA2a與Ca2+的親和力，降低肌漿網Ca2+攝取率；SERCA2a/PLB比值降低可以減弱SERCA2a活性[1]。

由于交感神經系統(tǒng)的長期過度激活，CHF患者心肌β1受體下調和功能受損，對兒茶酚胺的反應降低，心肌興奮-收縮耦聯(lián)功能障礙，心功能受損；β受體阻滯劑可以恢復β1受體功能并使之上調，心肌興奮-收縮耦聯(lián)趨于正常化，心功能得到改善[4]：β腎上腺素激活腺苷酸環(huán)化酶（cAMP），cAMP磷酸化并激活蛋白激酶（PKA），PKA磷酸化PLB導致SERCA2a抑制減弱，SERCA2a活性增強[1，4]。已有研究表明：美托洛爾可以使衰竭心臟SERCA2a的蛋白水平和活性正常化，減輕內質網應激，恢復Ca2+穩(wěn)態(tài)，改善心功能[5]。

本實驗中，CHF大鼠心肌SERCA2a和PLB表達水平降低，而比索洛爾可以提高SERCA2a和PLB表達水平，PLB的變化幅度較SERCA2a少。擴張型或缺血性心肌病患者心臟中，PLB mRNA的表達水平下降[1]，與本實驗結果相符。與比索洛爾不同，美托洛爾對CHF狗模型的PLB沒有明顯的提升作用[5]，原因可能與藥物不同、物種不同和造模方法不同有關。本實驗中，CHF大鼠SERCA2a活性降低，究其原因可能有：（1）miR-25-3p抑制SERCA2a合成；（2）SERCA2a降幅大于PLB，SERCA2a/PLB比值降低，PLB抑制作用增強，SERCA2a活性降低，這在人類的衰竭心臟中亦有類似變化[11]。比索洛爾增強SERCA2a活性的可能機制有：（1）提高SERCA2a和PLB的表達水平，SERCA2a升幅大于PLB，SERCA2a/PLB比值升高，PLB的抑制作用減弱，SERCA2a活性增強；（2）miR-25-3p對SERCA2a的抑制作用減弱。本實驗中，卡托普利也可以降低miR-25-3p，但其對SERCA2a的提升作用不如比索洛爾明顯，對SERCA2a/PLB比值和SERCA2a活性的影響不明顯；這也提示，SERCA2a除受miR-25-3p影響以外，還有其他途徑（例如β1受體上調等）影響了SERCA2a的含量和活性。

本研究結果顯示：比索洛爾可以提高SERCA2a含量和SERCA2a活性，這也許是比索洛爾治療CHF的一種分子機制。必須指出：本實驗使用動物樣本量少，而且是小動物，只針對阿霉素誘導的特定心衰模型，比索洛爾的效應及其治療心衰的分子機制有待大規(guī)模的動物實驗和臨床試驗來進一步驗證和解答。

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Exploration of Bisoprolol Improving Cardiac Function in Heart Failure Rats

WU Jin-bo, YE Xiao-han, XIAN Shao-xiang, DONG Ming-guo.
Department of Cardiology, Central Hospital of Dongguan City, Dongguan (510405), Guangdong, China Corresponding Author: WU Jin-bo, Email: wujinbocn@163.com

Objective: To observe the effect of bisoprolol on cardiac function in heart failure (HF) rats and to explore the mechanism.Methods: The experimental rats were divided into 6 groups: Control group, with normal healthy rats, Sham group, the rats received intraperitoneal injection of normal saline; chronic heart failure (CHF) model was successfully established in 40 rats and divided into 4 groups: CHF group, CHF+bisoprolol (Bis) group, CHF+captopril (Cap) group and CHF+Bis and Cap group.n=10 in each group. The cardiac function was observed among different groups; plasma BNP level was measured by ELISA, myocardial miR-25-3p expression was examined by RT-PCR, protein expressions of SERCA2a and phospholamban (PLB) were detected by Western blot analysis and SERCA2a activity was determined by inorganic phosphorus method.Results: Compared with Control group, CHF group showed decreased cardiac output (CO), left ventricular fractional shortening (LVFS), left ventricular ejection fraction (LVEF), reduced expression of cardiac SERCA2a, PLB, the ratio of SERCA2a/PLB and SERCA2a activity; while increased plasma BNP and miR-25-3p expression, allP＜0.01. Compared with CHF group, CHF+Bis, CHF+Cap and CHF+Bis and Cap groups had increased CO, LVFS, LVEF, elevated expression of cardiac SERCA2a, PLB, the ratio of SERCA2a/PLB and SERCA2a activity; while decreased plasma BNP and miR-25-3p expression, allP＜0.05.Conclusion: Bisoprolol could improve cardiac function in HF rats, which might be related to down regulating myocardial miR-25-3p expression, up regulating myocardial protein expressions of SERCA2a, PLB and enhancing SERCA2a activity.

Heart failure; Myocyte, cardiac; MicroRNA

2016-07-21）

（編輯:許菁）

510405 廣東省，東莞市中醫(yī)院 心內科（吳錦波、葉小漢、董明國）；廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 心內科（冼紹祥）

吳錦波 副主任醫(yī)師 博士 研究方向為心力衰竭的診治 Email: wujinbocn@163.com 通訊作者：吳錦波

R54

A

1000-3614（2017）03-0274-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.03.016

方法：80只SD大鼠隨機選取10只為正常對照組，10只作為假手術組，假手術組腹腔注射10 ml/kg的生理鹽水。造模過程中有15只死亡，左心室短軸縮短率不達標5只，40只成功造模大鼠按隨機數(shù)字表法分成4組：模型組（n=10）、比索洛爾組（n=10）、卡托普利組（n=10）和比索洛爾＋卡托普利組（n=10）。觀察各組大鼠心功能指標，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血漿B型利鈉肽水平，實時定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測心肌miR-25-3p表達水平，免疫蛋白印跡試驗（Western blot）檢測心肌肌漿網鈣ATP酶2a（SERCA2a）和受磷蛋白（PLB）表達水平，定磷法測定心肌SERCA2a活性。

結果：與正常對照組比較，模型組大鼠心輸出量、左心室短軸縮短率、左心室射血分數(shù)、心肌SERCA2a和PLB表達水平、SERCA2a/PLB比值和SERCA2a活性顯著降低，血漿B型利鈉肽水平和心肌miR-25-3p表達水平顯著升高（P均＜0.01）。與模型組比較，比索洛爾組、卡托普利組和比索洛爾＋卡托普利組大鼠心輸出量、左心室短軸縮短率、左心室射血分數(shù)、心肌SERCA2a和PLB表達水平、SERCA2a/PLB比值和SERCA2a活性顯著升高，血漿B型利鈉肽水平和心肌miR-25-3p表達水平顯著降低（P均＜0.05）。

結論：比索洛爾可以改善心力衰竭大鼠心功能，機制可能與下調心肌miR-25-3p表達，提高SERCA2a和PLB表達，提升SERCA2a/PLB比值，增強SERCA2a活性有關。