余 波，王 芳，康 超，李永霞，周思旋

(1.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴陽 550005；2.貴州省生物研究所，貴陽 550009)

大鯢虹彩病毒貴州分離株MCP基因的克隆與原核表達(dá)

余 波，王 芳2，康 超2，李永霞2，周思旋1

(1.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴陽 550005；2.貴州省生物研究所，貴陽 550009)

根據(jù)GenBank中大鯢虹彩病毒主衣殼蛋白MCP(major capsid protein,MCP)基因序列(序列號：KF512820)，設(shè)計(jì)一對特異性引物，以大鯢虹彩病毒貴州分離株基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增大鯢虹彩病毒MCP基因并測序，與GenBank中大鯢虹彩病毒MCP基因進(jìn)行比對，然后將其亞克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示：PCR擴(kuò)增出長度為1 392 bp的片段，與GenBank中大鯢虹彩病毒MCP基因核苷酸序列相似性為99.7%～99.9%，SDS-PAGE電泳顯示該重組蛋白的相對分子質(zhì)量約為67×103。免疫原性檢測結(jié)果表明，該重組蛋白可與兔抗大鯢虹彩病毒陽性血清特異性反應(yīng)，具有免疫原性。

大鯢虹彩病毒；MCP基因；原核表達(dá)；免疫原性

大鯢虹彩病毒(Giantsalamanderiridovirus,GSIV)，屬虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒屬(Ranavirus)，為雙鏈DNA病毒，主要感染魚類、兩棲類和爬行類，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中一種危害較大的病毒，可引起大鯢大面積死亡[1-3]。大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白(MCP)基因編碼463個氨基酸，該蛋白相對分子質(zhì)量約49×103，占病毒總蛋白的45%，具有良好的免疫原性，在病毒的裝配和感染過程中發(fā)揮重要作用[4]。周勇等[5]根據(jù)大鯢虹彩病毒MCP基因設(shè)計(jì)引物，建立了大鯢虹彩病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法。劉星星等[6]據(jù)大鯢蛙病毒MCP基因設(shè)計(jì)合成4條特異性引物建立了大鯢蛙病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法。目前，有關(guān)大鯢虹彩病毒MCP基因的原核表達(dá)研究尚未見報(bào)道。本研究克隆了大鯢虹彩病毒貴州分離株MCP基因，構(gòu)建重組載體并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)與免疫原性分析，旨在為今后進(jìn)一步開展大鯢虹彩病毒基因工程疫苗和分子快速診斷方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株和細(xì)胞

大鯢虹彩病毒貴州分離株由貴州重大疫病監(jiān)測防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。鯉上皮瘤細(xì)胞購自上海拜力生物科技有限公司。pET32a(+)表達(dá)載體、大腸桿菌BL21(DE3)、DH5α均為生工生物工程(上海)有限公司生產(chǎn)。

1.2 主要試劑

TaqPCR Mastermix酶、核酸染料、1×TAE電泳緩沖液、DL2000、λDNA、IPTG、X-gal、考馬斯亮藍(lán)R250、限制性內(nèi)切酶EocRI和HindⅢ、蛋白Marker、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、病毒基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生物科技有限公司。兔抗GSIV陽性血清由本研究室制備。蛋白質(zhì)純化試劑盒His-Tagged Purification Miniprep Kit購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中的大鯢虹彩病毒MCP基因序列，設(shè)計(jì)1對引物，上游引物：5′-GAATTCATGTCTTCTGTAACTGGT-3′，下游引物：5′-GTGCGGTTACAAGATTGGGAATCC-3′，下劃線部分分別為添加的EcoRI和HindⅢ酶切位點(diǎn)。

1.4 病毒核酸的抽提

將大鯢虹彩病毒液接種于鯉上皮瘤細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)病變后收集細(xì)胞毒液，將其放入-70 ℃冰箱反復(fù)凍融3次，5 000 r/min離心10 min，取上清液200 μL用病毒基因組DNA試劑盒提取基因組。

1.5 大鯢虹彩病毒MCP基因的擴(kuò)增

在100 μL體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)：上下游引物各4 μL(濃度10 μmol/L)、TaqPCR Mastermix酶50 μL、模板4 μL、ddH2O 加至100 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s， 55 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min 30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳。

1.6 大鯢虹彩病毒MCP基因的克隆和鑒定

將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒進(jìn)行DNA回收，與pMD18-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α，重組T載體命名為pMD18T-MCP。用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取pMD18T-MCP菌體質(zhì)粒，然后進(jìn)行酶切和PCR鑒定，并將質(zhì)粒送生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行序列測定。

1.7 大鯢虹彩病毒MCP基因序列分析

將測序正確的序列提交至GenBank中，并利用CLUSTAL X和MEGA軟件，將該序列與GenBank中其他大鯢虹彩病毒MCP基因序列進(jìn)行比對分析。

1.8 大鯢虹彩病毒MCP基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切重組T載體pMD18T-MCP和表達(dá)載體pET32a(+)，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒切膠回收目的基因MCP和線性化pET32a(+)，16 ℃連接過夜，將連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布含Amp(100 μg/mL) 的LB瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)16 h后，挑取單個菌落抽提質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定，重組載體質(zhì)粒命名為pET32a-MCP，并將質(zhì)粒送生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行序列測定。

1.9 大鯢虹彩病毒MCP基因的表達(dá)

將重組表達(dá)載體質(zhì)粒pET32a-MCP轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，挑取單個菌落接種10 mL LB液體培養(yǎng)基(含Amp100 μg/mL)，37 ℃培養(yǎng)12～16 h后，取出50 μL培養(yǎng)的菌液接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基(含Amp100 μg/mL)中培養(yǎng)至OD600 nm達(dá)0.5左右時(shí)，加入IPTG至終濃度0.1 mmol/L，繼續(xù)劇烈振蕩培養(yǎng)4 h。菌體濃度OD600 nm達(dá)1.5取出5 mL離心加入320 μL PBS懸濁后進(jìn)行超聲波破碎，對菌體破碎液進(jìn)行離心分離。分別取5 μL上清和沉淀，加入2×SDS上樣緩沖液混勻，100 ℃加熱10 min，進(jìn)行 SDS-PAGE電泳。

1.10 兔抗GSIV血清的制備

將收集的細(xì)胞毒液參照文獻(xiàn)[7]通過差速和蔗糖密度梯度離心進(jìn)行純化。將純化的病毒蛋白與等體積弗氏完全佐劑充分乳化，每只家兔免疫病毒蛋白5 mg，首次免疫后14 d進(jìn)行二免。二免后28 d，兔耳靜脈采血并分離血清。應(yīng)用瓊擴(kuò)法進(jìn)行兔抗GSIV血清抗體效價(jià)測定，抗體效價(jià)達(dá)1∶64的血清于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.11 Western-blot分析

將PVDF膜、濾紙分別剪切成與凝膠相同大小，使用轉(zhuǎn)膜緩沖液處理后，按濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙的順序依次放在轉(zhuǎn)膜儀電極板之間，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜置于含1.5% BSA 緩沖液中，4 ℃平放過夜封閉。

以兔抗GSIV血清作為一抗，37 ℃反應(yīng)1 h，TBST緩沖液洗滌3次，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，37 ℃反應(yīng)2 h，充分洗膜后，顯色觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 大鯢虹彩病毒MCP基因的克隆和鑒定

大鯢虹彩病毒貴州分離株經(jīng)PCR擴(kuò)增得到約1 392 bp特異性的DNA條帶，克隆到pMD18T載體上，經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定表明pMD18T-MCP成功插入目的片段，與預(yù)期的相符(圖1)。

圖1 大鯢虹彩病毒MCP基因的克隆和鑒定Fig.1 Cloning and identification of MCP gene of GSIV

M：DL2000；1：重組質(zhì)粒EcoRI和HindⅢ雙酶切；2：重組質(zhì)粒EcoRI單酶切；3：重組質(zhì)粒 PCR產(chǎn)物

2.2 大鯢虹彩病毒MCP基因序列分析

對陽性重組質(zhì)粒pMD18T-MCP測序結(jié)果表明，大鯢虹彩病毒貴州株MCP基因由1 392 bp組成的完整開放性閱讀框。序列提交至GenBank中獲得登錄號為KC816423。通過CLUSTAL X和MEGA軟件將該序列與GenBank中其他大鯢虹彩病毒分離株進(jìn)行比對(圖2,見下頁)，僅存在2個位點(diǎn)的堿基突變，核苷酸相似性為99.7%～99.9%。

2.3 大鯢虹彩病毒MCP基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將陽性質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，EcoRⅠ單酶切，HindⅢ單酶切，電泳后表明該陽性質(zhì)粒含有1 392 bp目的基因，與預(yù)期大小相符(圖3)。

圖3 大鯢虹彩病毒MCP基因原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定Fig.3 Construction and identification of prokaryotic expressionplasmid pMD18T-MCP

M1:λDNA；1：pET32a空載體；2：重組質(zhì)粒EcoRI單酶切；3：重組質(zhì)粒HindⅢ單酶切；4：EcoRI和HindⅢ雙酶切； M2：DL2000

2.4 大鯢虹彩病毒MCP基因在大腸桿菌中的表達(dá)

SDS-PAGE電泳表明重組載體轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)誘導(dǎo)菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)了相對分子質(zhì)量約67×103的特異性蛋白，與目的基因MCP基因編碼的重組表達(dá)蛋白大小相一致(MCP蛋白編碼蛋白49×103左右+載體的硫氧還蛋白相對分子質(zhì)量18×103)；未誘導(dǎo)表達(dá)菌株的全菌、上清、沉淀均未出現(xiàn)目的蛋白條帶；對誘導(dǎo)后的表達(dá)菌體和空載體進(jìn)行超聲波破碎，離心后，分別對沉淀及上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明，表達(dá)蛋白以包涵體形式存在，誘導(dǎo)后的表達(dá)空載體未見目的蛋白，只見相對分子質(zhì)量18×103硫氧還蛋白(圖4)。

圖4 大鯢虹彩病毒MCP基因在大腸桿菌中的 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGEFig.4 The expression of recombinant MCP protein of GSIV in BL21(DE3)

M：蛋白分子Markers；1:未誘導(dǎo)表達(dá)菌全菌；2:未誘導(dǎo)表達(dá)菌上清；3:未誘導(dǎo)表達(dá)菌沉淀；4:誘導(dǎo)表達(dá)菌全菌；5:誘導(dǎo)表達(dá)菌上清；6:誘導(dǎo)表達(dá)菌沉淀；7:空載體誘導(dǎo)菌全菌

圖2 大鯢虹彩病毒MCP基因序列比對分析圖Fig.2 Comparison and analysis of MCP gene of GSIV

2.5 Western-blot分析

Western-blotting結(jié)果顯示，相對分子質(zhì)量約67×103處出現(xiàn)目的反應(yīng)帶(圖5)，表明重組蛋白可與兔抗GSIV血清發(fā)生免疫反應(yīng)。

圖5 表達(dá)蛋白的Western-blotting鑒定Fig.5 The western blotting of the recombinant protein

M：蛋白分子Markers；1：誘導(dǎo)表達(dá)菌全菌；2：誘導(dǎo)表達(dá)空載體；3：誘導(dǎo)表達(dá)菌全菌Western-blotting；4：誘導(dǎo)表達(dá)空載體Western-blotting

3 討論

目前報(bào)道的GSIV MCP基因表達(dá)多采用真核表達(dá)系統(tǒng)。曾憲輝等[8]將GSIV MCP基因克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，實(shí)現(xiàn)GSIV MCP的真核表達(dá)，DNA疫苗免疫大鯢后，可誘導(dǎo)免疫大鯢產(chǎn)生細(xì)胞免疫和刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，免疫保護(hù)率可達(dá)73.3%。原核表達(dá)系統(tǒng)較真核表達(dá)具有耗時(shí)短，表達(dá)量高的特點(diǎn)。本研究克隆了大鯢虹彩病毒貴州分離株MCP基因，構(gòu)建重組載體，實(shí)現(xiàn)了大鯢虹彩病毒MCP基因的原核表達(dá)。Western blot分析結(jié)果表明，該重組蛋白具備免疫原性。

大鯢虹彩病毒MCP蛋白是虹彩病毒二十面體衣殼蛋白，蛋白質(zhì)疏水性高，具有一定的穩(wěn)定性，含有較多的抗原決定簇，具有良好的免疫原性，而MCP基因序列及其編碼氨基酸序列的同源性可以反映不同虹彩病毒毒株之間的遺傳親緣關(guān)系[9]。本研究克隆的全長1 392 bp的大鯢虹彩病毒MCP基因，與GenBank中大鯢虹彩病毒MCP基因進(jìn)行比對，核苷酸序列相似性為99.7%～99.9%，這和周小愿等[10]和徐進(jìn)等[11]研究結(jié)果一致，表明中國GSIV多個流行毒株是同一種GSIV病毒，且不同GSIV毒株的MCP基因的分子特征和結(jié)構(gòu)基本一致。

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(責(zé)任編輯：鄧 薇)

Cloning and prokaryotic expression of MCP gene ofGiantsalamanderiridovirusfrom Guizhou strain

YU Bo1,WANG Fang2,KANG Chao2,LI Yong-xia2,ZHOU Si-xuan1

(1.GuizhouInstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,Guiyang550005,China;2.GuizhouInstituteofBiology,Guiyang550009,China)

According to the MCP (major capsid protein,MCP) gene sequence ofGiantsalamanderiridovirus(GenBank Accession No.KF512820)in GenBank,a pair of specific primer was designed for amplifying the specific fragments of MCP gene.The MCP gene was amplified from the Guizhou isolate ofgiantsalamanderiridovirusby PCR,and then was subcloned into the prokaryotic expression vector pET-32a(+).The recombinant plasmid pET-32a-MCP was transformed intoE.coliBL21(DE3) and expressed under the induction of IPTG and SDS-PAGE.The results show that the MCP gene was 1392bp in length,the homology comparison between the MCP gene sequence and GenBank of MCP gene sequence showed 99.7%～99.9% identities at nucleotide level.The result of SDS-PAGE showed the expressed protein was about 67 KD.Western-blot analysis indicated that the expressed protein could react with rabbit anti- GSIV serum,which had immunological activity.

Giantsalamanderiridovirus;MCP gene;prokaryotic expression;immunological activity

2016-06-14；

2016-10-08資助項(xiàng)目：貴州省科學(xué)技術(shù)基金計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合J字[2014]2115號)；貴州省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合NZ字[2012]3023號)；2014年省級財(cái)政漁業(yè)發(fā)展(大鯢產(chǎn)業(yè))專項(xiàng)資金

余 波(1981- )，男，副研究員，主要從事預(yù)防獸醫(yī)研究。E-mail:yubonky@163.com

S917.4

A

1000-6907-(2017)02-0018-05