李 琳 晁紅梅 裴銀輝

華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河北唐山 063000

正交設(shè)計(jì)優(yōu)化淋病奈瑟菌滅活疫苗免疫條件

李 琳 晁紅梅 裴銀輝

華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河北唐山 063000

①目的 應(yīng)用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化淋病奈瑟菌滅活疫苗免疫條件，為淋病奈瑟菌滅活疫苗的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。②方法 將淋病奈瑟菌稀釋為1×109CFU/mL、1×108CFU/mL和1×107CFU/mL 3個(gè)濃度備用；選擇皮內(nèi)注射、肌肉注射、皮下注射三種免疫途經(jīng)，設(shè)定初次免疫與第二次免疫的時(shí)間間隔依次為2、3、4周；根據(jù)L9(34)正交設(shè)計(jì)表的方案對(duì)家兔進(jìn)行免疫，末次免疫7天后應(yīng)用玻片凝集試驗(yàn)分別測(cè)定各試驗(yàn)組家兔血清中抗體效價(jià)。③結(jié)果 抗原濃度分別為1×107CFU/mL、1×108CFU/mL和1×109CFU/mL時(shí)血清中抗體效價(jià)幾何均值分別為4.6357、5.7196、6.0206，濃度為1×109CFU/mL免疫效價(jià)最高；采用皮內(nèi)注射、肌肉注射和皮下注射三種免疫途經(jīng)的家兔血清中抗體效價(jià)幾何均值分別為為5.7195、5.4185和5.2379，皮內(nèi)注射抗體凝集效價(jià)高于其他兩種方式；免疫間隔2周、3周和4周時(shí)血清中抗體效價(jià)幾何均值分別為5.2379、5.5991和5.5389，其中間隔在3周為最佳。④結(jié)論 免疫劑量為1×109CFU/mL、皮內(nèi)注射、初次與二次免疫間隔在3周為最佳免疫組合。

淋病奈瑟菌 正交設(shè)計(jì) 免疫條件

[KEY WORS] Neisseria gonorrhoeae.Orthogonal design.Immune condition

淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)為淋病(gonorrhea)的病原體。人類是淋病奈瑟菌唯一的自然宿主，主要通過性接觸而傳播。感染患者主要發(fā)生泌尿生殖系統(tǒng)損害，表現(xiàn)為尿道炎和宮頸炎，以及附睪炎、盆腔炎等并發(fā)癥，女性患者還可由于并發(fā)癥造成不育、宮外孕等嚴(yán)重后果，研制主動(dòng)免疫預(yù)防和治療免疫制劑，積極采取包括疫苗研制在內(nèi)的防治控制措施顯得更為迫切。目前淋病奈瑟菌疫苗主要包括淋球菌全細(xì)胞疫苗、亞單位疫苗、基因工程疫苗等幾種類型。全細(xì)胞疫苗作為傳統(tǒng)疫苗，具有保留良好的免疫原性及安全有效的優(yōu)點(diǎn)。確立全細(xì)胞疫苗免疫效果與其注射途徑、注射劑量及免疫接種時(shí)間的相互關(guān)系，是正確應(yīng)用全細(xì)胞疫苗主動(dòng)免疫淋病的關(guān)鍵[1]。本研究旨在通過正交設(shè)計(jì)優(yōu)化免疫條件，為淋病奈瑟菌滅活疫苗的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 CMCC 29403(購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定所)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性家兔，體重2.0～2.5kg，華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 淋病奈瑟菌培養(yǎng) CMCC 29403標(biāo)準(zhǔn)菌珠接種于血瓊脂平板，5%～10% CO2厭氧培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48小時(shí),形成直徑為1.0～1.5mm無(wú)色、透明、圓形光滑菌落；無(wú)菌挑取2～3個(gè)菌落加入胎牛血清肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)，60℃恒溫水浴箱滅活20分鐘，吸取滅活后菌液培養(yǎng)液1mL加入巧克力色血瓊脂平板中培養(yǎng)，無(wú)菌落生長(zhǎng)，證實(shí)培養(yǎng)液中淋病奈瑟菌已經(jīng)完全滅活，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以無(wú)菌胎牛血清分別稀釋為1×107CFU/mL、1×108CFU/mL、1×109CFU/mL 3種免疫濃度。

1.2.2 免疫佐劑制備 稱取羊毛脂10g加入45mL液體石蠟中加熱融化冷卻至室溫，入研缽中同方向研磨成乳劑后8磅高壓滅菌15分鐘，放至室溫后4℃冰箱冷藏備用。于上述液體中邊研磨邊逐滴加入卡介苗75mg，加完后繼續(xù)研磨成乳劑，滴于水上5～10分鐘內(nèi)完全不擴(kuò)散為合格；8磅高壓滅菌15分鐘，放置室溫后4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 正交設(shè)計(jì)免疫方案 選擇體質(zhì)量2.0～2.5kg健康雄性家兔45只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為9組，每組5只。分別采用滅活疫苗濃度1×107CFU/mL、1×108CFU/mL和1×109CFU/mL經(jīng)皮內(nèi)、皮下及肌肉注射三種注射方式進(jìn)行免疫，免疫劑量為1mL，初次免疫與第2次免疫時(shí)間間隔分別選擇第2、3、4周3組時(shí)間間隔進(jìn)行。按L9(34)的免疫程序進(jìn)行免疫，見表1。

表1 淋病奈瑟菌全細(xì)胞疫苗免疫方案正交設(shè)計(jì)表

1.2.4 免疫血清效價(jià)測(cè)定 每組家兔末次免疫7天后，抽取耳緣靜脈血2mL置于滅菌試管中，室溫靜置1小時(shí)至血液凝固后入4℃冰箱過夜析出血清，凝集試驗(yàn)測(cè)定免疫血清效價(jià)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)均采用雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

抗原濃度為1×107CFU/mL、1×108CFU/mL和1×109CFU/mL時(shí)血清中抗體效價(jià)幾何均值分別為4.6357、5.7196和6.0206，濃度為1×109CFU/mL免疫效價(jià)最高，與其他兩種抗原濃度所產(chǎn)生的免疫效價(jià)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；皮內(nèi)注射、肌肉注射和皮下注射給藥三種免疫途經(jīng)血清中抗體效價(jià)幾何均值分別為為5.7195、5.4185和5.2379，皮內(nèi)注射抗體效價(jià)高于其他兩種免疫途徑產(chǎn)生的抗體效價(jià)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；免疫間隔2周、3周和4周時(shí)血清中抗體效價(jià)幾何均值分別為5.2379、5.5991和5.5389，其中二次免疫間隔在3周為最佳選擇，與免疫間隔2周、3周時(shí)血清抗體效價(jià)幾何均值比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，由正交設(shè)計(jì)確定的最佳免疫條件組合是：免疫劑量1×109CFU/mL、皮內(nèi)注射、初次與二次免疫間隔為3周。見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化淋病奈瑟菌滅活疫苗免疫條件結(jié)果

注：免疫劑量1=1×107CFU/mL,2=1×108CFU/mL,3=1×109CFU/mL;

免疫途徑1=皮內(nèi),2=皮下,3=肌肉注射;免疫時(shí)間間隔1=2周,2=3周,3=4周

3 討論

淋病為全球發(fā)病率較高的性傳播疾病之一，人類是淋病奈瑟菌的唯一宿主，經(jīng)性行為傳播，多侵襲泌尿生殖道黏膜，主要引起男性急性尿道炎、前列腺炎、附睪炎等。在女性主要以隱性感染為主，常因不及時(shí)治療而導(dǎo)致盆腔炎、子宮內(nèi)膜炎,甚至不孕證的發(fā)生[2]。近年來(lái)，淋病奈瑟菌的耐藥性日益增強(qiáng)，淋病的治療變得越發(fā)困難[3]。因此，研制有效的淋球菌疫苗及合理的免疫程序無(wú)疑會(huì)為淋病的防治提供有效的主動(dòng)免疫方案。

目前淋病奈瑟菌疫苗的研制已發(fā)展為包括全細(xì)胞疫苗、亞單位疫苗、基因工程疫苗和DNA疫苗在內(nèi)的多個(gè)種類。淋病奈瑟菌全細(xì)胞疫苗屬于顆粒性抗原，具有較強(qiáng)的免疫原性，可直接注射動(dòng)物產(chǎn)生相應(yīng)的抗血清[4]。機(jī)體在抗原物質(zhì)的刺激下產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)的過程，大體上可分為3個(gè)階段。①致敏階段(加工處理抗原階段)：當(dāng)顆粒性抗原初次進(jìn)入人體內(nèi)時(shí)，首先被巨噬細(xì)胞吞噬。通過胞漿內(nèi)溶酶體酶的作用，把抗原物質(zhì)消化降解，而保留其抗原決定簇(特異性抗原成分)。經(jīng)過處理的抗原與巨噬細(xì)胞的RNA結(jié)合成為抗原-RNA復(fù)合物，具有強(qiáng)烈吸引免疫活性細(xì)胞的作用，能把抗原-RNA復(fù)合物傳遞給免疫活性細(xì)胞(Immunologically competent cell),啟動(dòng)免疫反應(yīng)。②反應(yīng)階段(淋巴細(xì)胞分化增殖階段)：免疫活性細(xì)胞在受到抗原信息的刺激后，發(fā)生母細(xì)胞化，進(jìn)而大量增殖。由于抗原的性質(zhì)不同，刺激T細(xì)胞分化成致敏淋巴細(xì)胞；刺激B細(xì)胞使其分化成漿細(xì)胞。在分化過程中小部分成為“記憶”細(xì)胞。由于“記憶”細(xì)胞的存在，即使抗原在漿內(nèi)消失很久(數(shù)月至數(shù)年或更長(zhǎng))以后，仍能與再度進(jìn)入體內(nèi)的相應(yīng)抗原迅速引起較強(qiáng)的免疫反應(yīng)(回憶反應(yīng))。③效應(yīng)階段(發(fā)生免疫反應(yīng)階段)：當(dāng)致敏淋巴細(xì)胞再次遇到相應(yīng)抗原的刺激后，能釋放出多種具有生物活性的物質(zhì)(淋巴因子)，參與細(xì)胞免疫反應(yīng)；漿細(xì)胞可形成各種類型的免疫球蛋白(抗體)，參與體液免疫反應(yīng)。在免疫期間，不同的動(dòng)物，在不同的時(shí)間內(nèi)抗血清效價(jià)、特異性、親合力等均可能發(fā)生變化，因此必須設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定，以確定其變化規(guī)律[5]。

抗原的免疫劑量是依照給予動(dòng)物的種類、免疫周期以及所要求的抗體特性等不同而不同。免疫劑量過低不能引起足夠強(qiáng)的免疫刺激，免疫劑量過多，有可能引起免疫耐受。在一定的范圍內(nèi)，抗體的效價(jià)是隨注射劑量的增加而增高。本試驗(yàn)抗原為顆粒性抗原，依據(jù)其強(qiáng)弱、分子量大小、動(dòng)物個(gè)體情況及免疫時(shí)間間隔分別選擇全細(xì)胞疫苗濃度1×107CFU/mL、1×108CFU/mL和1×109CFU/mL三個(gè)劑量[6]。

對(duì)免疫途徑的選擇決定于抗原的生物學(xué)特性和理化特性，以能使機(jī)體獲得最好免疫效果為原則。根據(jù)不同抗原及試驗(yàn)要求，可選取皮內(nèi)、皮下、肌肉注射、靜脈或淋巴結(jié)等不同途徑進(jìn)行免疫；凡能造成全身性感染的疾病，以皮下或肌肉注射為好；而主要侵入呼吸道或體表感染的疾病，以噴霧接種疫苗的效果好；以消化道為入侵途徑的感染或消化道感染，則以口服接種方式為好[7]。

兩次注射的間隔時(shí)間應(yīng)長(zhǎng)短適宜，太短起不到再次反應(yīng)的效果，太長(zhǎng)則失去了前一次激發(fā)的敏感作用[8]。一般初次免疫應(yīng)答時(shí)間為7～10天左右，分泌IgM抗體；二次免疫應(yīng)答在隔周；初次免疫應(yīng)答以后1周達(dá)到峰值，分泌IgG抗體。因此應(yīng)當(dāng)選擇二次免疫應(yīng)答時(shí)進(jìn)行免疫可能會(huì)有較好的免疫效果。在一定范圍內(nèi)，接種次數(shù)增加，免疫效果增強(qiáng)，但過多也會(huì)產(chǎn)生免疫麻痹現(xiàn)象[9]。

為了確保得到理想的試驗(yàn)結(jié)果，本次試驗(yàn)在免疫過程中分別加入弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑來(lái)增強(qiáng)機(jī)體對(duì)淋病奈瑟菌滅活疫苗的特異性免疫應(yīng)答，其中初次免疫應(yīng)用弗氏完全佐劑，即在弗氏不完全佐劑中加入BCG，為避免佐劑對(duì)全細(xì)胞疫苗抗原可能產(chǎn)生的破壞，進(jìn)而影響免疫效果[10]，佐劑與抗原分別注入家兔體內(nèi)，且接種部位在抗原附近或?qū)?cè)。

通過上述試驗(yàn)條件的篩選，經(jīng)過正交表L9(34)確定試驗(yàn)方案進(jìn)行動(dòng)物免疫，根據(jù)顆粒性抗原與抗體反應(yīng)可以產(chǎn)生肉眼可見的凝集反應(yīng)的特征，采用凝集試驗(yàn)進(jìn)行免疫血清效價(jià)測(cè)定，各免疫組家兔的抗體結(jié)果表明：免疫劑量、免疫途徑及免疫時(shí)間間隔三個(gè)因素對(duì)淋病奈瑟菌全細(xì)胞疫苗免疫效果均有影響；三者對(duì)免疫效價(jià)影響程度順序?yàn)槊庖邉┝?免疫途徑>免疫時(shí)間間隔；不同免疫劑量免疫效價(jià)存在差異：抗原濃度1×107CFU/mL免疫動(dòng)物后血清中抗體效價(jià)幾何均值為4.6357，抗原濃度1×108CFU/mL免疫動(dòng)物后血清中抗體效價(jià)幾何均值為5.7196，抗原濃度1×109CFU/mL免疫動(dòng)物后血清中抗體效價(jià)幾何均值為6.0206，其中濃度為1×109CFU/mL免疫效價(jià)最高，與其他兩種濃度抗原產(chǎn)生的免疫效價(jià)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同免疫途徑的免疫效價(jià)同樣存在差異：皮內(nèi)注射免疫動(dòng)物后血清中抗體效價(jià)幾何均值為5.7195，肌肉注射免疫動(dòng)物后血清中抗體效價(jià)幾何均值為5.4185，皮下注射免疫動(dòng)物后血清中抗體效價(jià)幾何均值則為5.2379，皮內(nèi)注射免疫效價(jià)高于其他兩種途徑，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。初次免疫與第二次加強(qiáng)免疫的時(shí)間間隔對(duì)家兔抗體的產(chǎn)生也有所不同：免疫間隔2周時(shí)免疫動(dòng)物后血清中抗體效價(jià)幾何均值為5.2379，間隔3周時(shí)免疫動(dòng)物后血清中抗體效價(jià)幾何均值為5.5991，4周時(shí)免疫動(dòng)物后血清中抗體效價(jià)幾何均值為5.5389，其中二次間隔為3周時(shí)免疫效價(jià)高于其他兩種間隔時(shí)間，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果得到最佳免疫組合方式為：淋病奈瑟菌全細(xì)胞疫苗劑量1×109CFU/mL、初次與二次免疫間隔為3周、皮內(nèi)注射的方式進(jìn)行免疫。

[1] 田 文，裴銀輝.冷酚法淋病奈瑟菌多糖疫苗制備及其對(duì)體液免疫的效果[J].河北聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2015，17(4)：1-3

[2] Ohnishi M.Ceftriaxone-resistant neisseria gonorrhoeae in Japan[J].Emerg Infect Dis,2011,17(27):148-149

[3] Allen VG.Molecular analysis of antimicrobial resistance mechanisms in neisseria gonorrhoeae isolates from ontario,Canada[J].Antimicrob Agents Chemother,2011,55(16):703-712

[4] Michael,Frank St,Chakraborti,et al.Phase-variable heptose I glycan extensions modulate efficacy of 2C7 vaccine antibody directed against neisseria gonorrhoeae lipooligosa ccharide[J].The Journal of Immunology,2016,196(11):4576-4586

[5] 張建華,施恒亮,翟艷華,等.兔抗Myosin X多克隆抗體的制備及初步應(yīng)用[J].東北師大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2012,44(1):140-144

[6] 王 帥,陳根元,胡建軍,等.苦馬豆素人工抗原對(duì)家兔的免疫原性研究[J].中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué),2012,21(2)205-207

[7] Hadad R,Jacobsson S,Pizza M,et al.Novel meningococcal 4CMenB vaccine antigens-prevalence and polymorphisms of the encoding genes in neisseria gonorrhoeae[J].APMIS:acta microbiologica，2012,120(9):750-60

[8] Li G,Jiao H,Jiang G, et al.Neisseria gonorrhoeae NspA induces specific bactericidal and opsonic antibodies in mice[J].Clin Vaccine Immunol,2011,18(11):1817-1822

[9] Neisseria gonorrhoeae that recruit C4b-binding protein[J].J Immunol,2012,188(7):3416-3425

[10] Johnson MB,Criss AK.Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils[J].Cell Microbiol,2013,4(1):2718-2725

(2016-12-2 收稿)(張愛國(guó) 編輯)

Optimaization of inactived neisseria gonorrhoeae vaccination by orthogonal design

LILin,CHAOHongmei,PEIYinhui

(NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To optimize inactived neisseria gonorrhoeae vaccination by orthogonal design,so to establish experiment basis for further test. Methods Gonorrhea neisseria bacteria was diluted into 1×109CFU/mL,1×108CFU/mL and 1×107CFU/mL respectively,intradermal injection,intramuscular injection and subcutaneous injection were adopted for antigen entrance 2,3,4 weeks were the intervals between primary and second immune.Immunization was performed according to the orthogonal design table L9 (34).Slide agglutination test was performed to test the specific antibody titer of each groups 7 days later. Results The geometry means at the following cell density1×109CFU/mL,1×108CFU/mL and 1×107CFU/mL were 4.6357,5.7196 and 6.0206 respectively，the geometry mean with 1×109CFU/mL was higher than the others,and the difference was significantly.The geometry means with intradermal injection,intramuscular injection and subcutaneous injection were 5.7195,5.4185 and 5.2379 respectively,the geometry mean with intradermal injection was higher than the others,and the difference was significantly.The geometry means with 2,3 and 4 weeks were 5.2379,5.5991 and 5.5389 respectively,the geometry mean with 3 weeks interval was higher than the others, and the difference was significantly.Conclusion With the dosage of 109CFU/mL bacteria,intradermal injection,and 3 weeks interval between the first and the second injection are the optimization immune combination.

李 琳(1964-)，女，本科，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師。研究方向：病原生物學(xué)。

R 392.3

A

2095-2694(2017)02-085-5