王夢(mèng)菲

摘 要：介紹了血紅蛋白的提取和分離方法有凝膠色譜法和電泳法的原理和方法。

關(guān)鍵詞： 凝膠色譜法；凝膠電泳法； 血紅蛋白

G633.91

DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)包括DNA的粗提取與鑒定、PCR技術(shù)和血紅蛋白的提取和分離等，是開(kāi)展分子生物學(xué)研究的基本技術(shù)。蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)不可或缺的物質(zhì)。血紅蛋白是人和其他脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞的主要組成成分，負(fù)責(zé)血液中的氧氣和二氧化碳的運(yùn)輸。

一、 血紅蛋白蛋白質(zhì)提取和分離的原理

血紅蛋白蛋白質(zhì)提取和分離的原理是根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等，可以分離不同種類(lèi)的蛋白質(zhì)。

二、 血紅蛋白蛋白質(zhì)提取和分離技術(shù)方法有凝膠色譜法和電泳法。

凝膠色譜法是根據(jù)分子量的大小來(lái)分離蛋白質(zhì)的，而電泳法是根據(jù)各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身形狀、大小的不同來(lái)把蛋白質(zhì)分離開(kāi)的。

1. 凝膠色譜法

凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理：在多孔球體的凝膠內(nèi)，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小不同，大分子通過(guò)多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；小分子通過(guò)凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長(zhǎng)，流動(dòng)慢。相對(duì)分子質(zhì)量的不同蛋白質(zhì)因此得以分離。凝膠材料是微小的多孔性球體，如葡聚糖或瓊脂糖。

2.凝膠電泳法

電泳法是帶電顆粒在電場(chǎng)中向電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。凝膠電泳法原理是：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)（正電荷或負(fù)電荷）、電量、形狀和大小不同，在電場(chǎng)中受到的作用力大小、方向和阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同，因而可聚集形成不同的條帶，因而達(dá)到分離的目的。影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度的因素中，蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)決定蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)方向，蛋白質(zhì)帶電荷量的多少?zèng)Q定電場(chǎng)作用力的大小，分子形狀和大小形成阻力大小，蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)速率由電荷量、分子形狀和分子大小共同決定。

實(shí)驗(yàn)探究 蛋白質(zhì)為什么帶有帶電荷？

蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的，還有一個(gè)羧基和一個(gè)氨基，在一定的PH下，蛋白質(zhì)可解離的基因會(huì)帶上電荷。

三、實(shí)驗(yàn)操作步驟

蛋白質(zhì)的提取和操作一般分為五個(gè)階段：材料的選擇和預(yù)處理、粗分離（細(xì)胞的破碎）、提取、純化（包括鹽析，層析，有機(jī)溶劑提取，有機(jī)溶劑沉淀等）和濃縮干燥及保存。我們?nèi)〔溉閯?dòng)物紅細(xì)胞（豬的新鮮血液）為材料，來(lái)進(jìn)行血紅蛋白的分離方法。

1.樣品處理及粗分離

⑴ 樣品前處理 包括細(xì)胞的破碎有機(jī)械方法、物理方法和化學(xué)及生物化學(xué)方法。

⑵ 細(xì)胞器的分離 從樣品水溶液中提取、用有機(jī)溶劑提取、利用表面活性劑提取和對(duì)提取物進(jìn)行保護(hù)。

①樣品分離器材：離心機(jī)，0.9%的NaCl溶液和20mmol/L的磷酸緩沖液。

②步驟包括：紅細(xì)胞的洗滌、血紅蛋白的釋放、分離血紅蛋白溶液和透析。采集的血樣要及時(shí)分離紅細(xì)胞，分離時(shí)采用低速短時(shí)間離心（500r/min離心2min），然后用膠頭吸管吸上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的0.9%的NaCl溶液，緩慢攪拌10min，低速短時(shí)離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至上清液不再呈現(xiàn)黃色為止。將洗滌好的紅細(xì)胞倒入燒杯中，加蒸餾水到原血液的體積，再加40%體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0min。然后轉(zhuǎn)移到離心管中，以2000r/min的速度離心10min，就可以明顯看到試管中溶液分四層，從上往下數(shù)，第一層為無(wú)色透明的甲苯層，第二層為白色波層固體，是脂溶性物質(zhì)沉淀層，第三層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第四層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的分層液體用濾紙過(guò)濾，除去脂溶性沉淀層，靜置后分出下層的紅色透明液體。取1mL血紅蛋白溶液裝入透析袋子中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量濃度20%mmol/L的磷酸緩沖液中（PH為7.0），透析12h即可。

⒉ 凝膠色譜操作

⑴凝膠色譜柱的制作 取長(zhǎng)40cm，內(nèi)徑為1.6cm的玻璃管，兩端磨平。玻璃管兩端色上合適的橡皮塞，中間打孔，孔徑為0.5mL插入移液管，在色譜柱下端用移液管頭部作出口部位，連接一細(xì)的尼龍管，用螺旋塞控制尼龍管的打開(kāi)與關(guān)閉，尼龍管的另一端放入收集色譜液的收集器內(nèi)。

⑵ 凝膠色譜柱的裝填凝膠用蒸餾水充分溶脹后，配成配成凝膠懸浮液，在于下端連接的

尼龍管打開(kāi)的情況下，一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)，輕輕敲動(dòng)色譜柱使凝膠裝填均勻。并立即用20mmol/L的磷酸緩沖液充分洗滌，使凝膠裝填緊密。

⑶血紅蛋白樣品的加入和洗脫 加樣前，打開(kāi)色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液下降到與凝膠面平，關(guān)閉出口。用吸管小心地將透析后的樣品加到色譜柱的頂端，并打開(kāi)下端出口，是樣品滲入凝膠床內(nèi)。等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口，并加入20mmol/L的磷酸緩沖液到適當(dāng)?shù)母叨?，連接洗脫瓶，打開(kāi)下邊出口，進(jìn)行洗脫。待紅色色譜柱接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，連續(xù)收集。

⒊ SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

⑴原理 蛋白質(zhì)在十二烷基硫酸鈉（SDS）和巰基乙醇的作用下，分子中的二硫鍵還原，氫鍵等打開(kāi)，形成按1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)比例的SDS-蛋白質(zhì)多肽復(fù)合物，該復(fù)合物帶負(fù)電，故可在聚丙烯酰胺凝膠電泳中向正極遷移，且主要由于凝膠的分子篩作用，遷移速率與蛋白質(zhì)的分子量大小有關(guān)，因此可以濃縮和分離蛋白質(zhì)多肽。

聚丙烯酰凝膠電泳分離蛋白質(zhì)多數(shù)采用一種不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)，主要分為較低濃度的成層膠和較高濃度的分離膠，配制凝膠的緩沖液，其pH值和離子強(qiáng)度也相應(yīng)不同，故電泳時(shí)，樣品中的SDS-多肽復(fù)合物沿移動(dòng)的界面移動(dòng)，在分離膠表面形成了一個(gè)極薄的層面，大大濃縮了樣品的體積，即SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮效應(yīng)。

⑵具體操作包括：①紅細(xì)胞的洗滌 ；②色譜柱填料的處理；③凝膠色譜柱的裝填；④蛋白質(zhì)的分離。

⑶ 小結(jié)

蛋白質(zhì)在聚丙烯凝膠中電泳時(shí)，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等。蛋白質(zhì)在凝膠中的遷移率，不受蛋白質(zhì)原的電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大小，他們以相等的遷移速度從濃縮膠進(jìn)入分離膠，在聚丙烯胺的分子篩作用下，小分子的蛋白質(zhì)可以容易的通過(guò)凝膠孔徑，阻力小，遷移速度快；大分子蛋白質(zhì)則受到較大的阻力而被滯后，這樣蛋白質(zhì)在電泳過(guò)程中就會(huì)根據(jù)其各自分子量的大小而被分離。因而SDS聚丙烯胺凝膠電泳可以用于測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。