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(杭州中美華東制藥有限公司 微生物技術(shù)平臺(tái)，浙江 杭州 310011)

淺談微生物發(fā)酵中試的影響因素

平麗英，陳琳，方麗納，匡春蘭，傅立峰

(杭州中美華東制藥有限公司 微生物技術(shù)平臺(tái)，浙江 杭州 310011)

微生物發(fā)酵中試是實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模生產(chǎn)工藝路線打通后，在模擬工業(yè)化生產(chǎn)條件下所進(jìn)行的工藝研究，以驗(yàn)證放大生產(chǎn)后原工藝的可行性，盡可能保證研發(fā)和生產(chǎn)時(shí)工藝的一致性.發(fā)酵中試放大的目的是驗(yàn)證、復(fù)審和完善實(shí)驗(yàn)室工藝所確定的反應(yīng)條件，為正式生產(chǎn)提供數(shù)據(jù).微生物發(fā)酵中試是產(chǎn)品研發(fā)到生產(chǎn)的必經(jīng)之路，是連接研發(fā)和生產(chǎn)的紐帶，不僅為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)積累必要的經(jīng)驗(yàn)及提供數(shù)據(jù)支持，同時(shí)也是降低產(chǎn)業(yè)化實(shí)施風(fēng)險(xiǎn)的有效措施.微生物發(fā)酵中試有諸多影響因素，因此研究并合理利用其影響因素具有重要意義.

微生物發(fā)酵；發(fā)酵中試放大；影響因素

微生物發(fā)酵具有生產(chǎn)工藝相對(duì)簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量高且可工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì).微生物工業(yè)發(fā)酵過程不同于一般化工生產(chǎn)，是借助于微生物個(gè)體在一定培養(yǎng)條件、培養(yǎng)設(shè)備下參與的生化反應(yīng)過程，因此具有其特殊性.微生物發(fā)酵中試是在小試的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究各工藝參數(shù)的變化規(guī)律，以解決實(shí)驗(yàn)室規(guī)模中不能解決或尚未發(fā)現(xiàn)的問題，是降低產(chǎn)業(yè)化實(shí)施風(fēng)險(xiǎn)的有效措施.微生物菌種、培養(yǎng)基、滅菌方式和培養(yǎng)條件(溫度、pH、溶氧、攪拌形式及速度和黏度)等是影響微生物發(fā)酵中試的重要因素，研究并合理利用這些因素可以更好地為產(chǎn)業(yè)化服務(wù)，具有重要意義.

1 菌種及培養(yǎng)基

1.1 菌 種

菌種在微生物發(fā)酵過程中起著重要作用，是發(fā)酵工業(yè)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵.發(fā)酵期間，菌種的生長(zhǎng)速度和產(chǎn)物合成的能力很大程度上取決于菌種的發(fā)酵能力及穩(wěn)定性.為改善菌種的特性，提高發(fā)酵水平，滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的需求，必須進(jìn)行菌種選育工作，菌種選育在提高產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量、改善工藝條件等方面發(fā)揮著重要作用[1].例如，Conte等采用紫外誘變方法，獲得黑曲霉突變株FR13，檸檬酸產(chǎn)率較出發(fā)菌株提高了近一倍[2].上海師范大學(xué)楊正行采用自然篩選及紫外誘變等方法，獲得了莫匹羅星高產(chǎn)突變株，其發(fā)酵產(chǎn)莫匹羅星水平較出發(fā)菌株提高了2.4倍[3].另外，Desai等通過紫外誘變及發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化，使木聚糖酶產(chǎn)量提高了37%[4].

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基不僅為微生物提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，也為微生物生長(zhǎng)創(chuàng)造必要的生長(zhǎng)環(huán)境.生產(chǎn)中培養(yǎng)基的組成及配比是否合適，對(duì)微生物生長(zhǎng)繁殖、產(chǎn)物的生物合成、產(chǎn)品的分離精制乃至產(chǎn)品的質(zhì)量產(chǎn)量都有重要影響.工業(yè)生產(chǎn)中要根據(jù)菌種特性、微生物生長(zhǎng)發(fā)酵階段和發(fā)酵產(chǎn)物特點(diǎn)等因素合理配制使用不同成分及配比的培養(yǎng)基，為微生物提供適宜的營養(yǎng)物質(zhì)，以滿足菌體生長(zhǎng)及合成產(chǎn)物的需求.

培養(yǎng)基配方優(yōu)化能有效提高發(fā)酵代謝水平，在胞外多糖發(fā)酵過程中，通過培養(yǎng)基配方優(yōu)化，5～30 kD的胞外多糖達(dá)到48.57 g/L[5].培養(yǎng)基中的某些金屬離子對(duì)發(fā)酵代謝及產(chǎn)物活性有顯著影響，例如，為了提高BacillussubtilisBS501a發(fā)酵產(chǎn)物的抗真菌活性，通過正交實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基配方進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后其抑菌活性提高了2.4倍，同時(shí)，在優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)Mg2+對(duì)抑菌活性有顯著影響[6].

2 滅 菌

絕大多數(shù)的工業(yè)發(fā)酵是需氧的純種發(fā)酵.在發(fā)酵過程中，除生產(chǎn)菌外，不允許其他雜菌的生長(zhǎng)，這就要求對(duì)使用的培養(yǎng)基、儀器設(shè)備等進(jìn)行徹底的除菌處理.因此，滅菌和無菌操作是工業(yè)發(fā)酵的重要環(huán)節(jié).培養(yǎng)基的滅菌情況對(duì)不同發(fā)酵產(chǎn)品的影響也不盡相同.一般而言隨滅菌溫度的升高、時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)營養(yǎng)成分的破壞作用越嚴(yán)重，進(jìn)而影響微生物的生長(zhǎng)代謝及產(chǎn)物合成.葡萄糖是微生物培養(yǎng)過程中常用的有效碳源，但在高溫滅菌時(shí)，葡萄糖與氨類物質(zhì)會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，使培養(yǎng)基產(chǎn)生有害色素，不利于微生物的生長(zhǎng)，因此，一般應(yīng)對(duì)培養(yǎng)基中的葡萄糖單獨(dú)滅菌，并將溫度控制在115 ℃，滅菌時(shí)間控制在20 min以內(nèi)[7].

3 培養(yǎng)條件

3.1 溫 度

溫度主要通過影響微生物細(xì)胞內(nèi)生物大分子的活性來影響微生物的代謝活動(dòng).同時(shí)，溫度的變化也會(huì)引起其他環(huán)境因素的變化，進(jìn)而影響微生物的生命活動(dòng).微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成需要在其適宜的溫度下進(jìn)行，在發(fā)酵過程中不同的發(fā)酵階段其最適溫度往往不同.例如，乳酸鏈球菌在34 ℃時(shí)繁殖速度最快，在25～30 ℃時(shí)細(xì)胞產(chǎn)量最高，在40 ℃時(shí)發(fā)酵速度最快，在30 ℃時(shí)乳酸產(chǎn)量最高[8].

溫度影響產(chǎn)物合成的同時(shí)還會(huì)影響其代謝的方向.金色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)四環(huán)素的同時(shí)也會(huì)生產(chǎn)金霉素，當(dāng)溫度低于30 ℃時(shí)以合成金霉素為主，隨著溫度的升高合成四環(huán)素的比例增加，當(dāng)溫度達(dá)到35 ℃時(shí)只生產(chǎn)四環(huán)素[9-10].溫度對(duì)大腸桿菌等工程菌發(fā)酵的影響更加顯著，一般在發(fā)酵初期，采用37 ℃培養(yǎng)，以利于大腸桿菌的生長(zhǎng)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中后期，加入誘導(dǎo)劑，同時(shí)降溫培養(yǎng)，以利于目標(biāo)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá).Studie在高密度發(fā)酵蛋白表達(dá)的研究中，大腸桿菌在生長(zhǎng)階段采用37 ℃培養(yǎng)，而蛋白表達(dá)階段采用18 ℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)[11].

3.2 pH

發(fā)酵pH對(duì)微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成有較大影響.pH主要通過引起細(xì)胞膜電荷變化，改變細(xì)胞膜的通透性來影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的排泄，最終影響微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成.不同微生物的最適pH有所不同，一般情況下細(xì)菌和放線菌適于中性偏堿性環(huán)境，而霉菌和酵母菌適于偏酸性環(huán)境.

同一微生物在不同的環(huán)境pH條件下會(huì)表現(xiàn)出不同的生長(zhǎng)狀態(tài)及發(fā)酵水平.例如，耐酸真菌PenicilliumpurpurogenumJS03-21在pH 2的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，且發(fā)酵水平可達(dá)到最大值，隨著pH的上升，發(fā)酵產(chǎn)量逐漸下降，當(dāng)pH為堿性時(shí)，菌株雖能生長(zhǎng)，但卻不產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物[12].同一微生物在不同pH條件下也會(huì)產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物.例如，黑曲霉在pH 2～3的培養(yǎng)環(huán)境下，產(chǎn)物以檸檬酸為主，當(dāng)pH接近中性時(shí)，則大量產(chǎn)生草酸[13-15].谷氨酸生產(chǎn)菌在中性和微堿性條件下積累谷氨酸，在酸性條件下產(chǎn)生谷氨酰胺[12].因此，在發(fā)酵過程中，可根據(jù)不同的目的，采用pH調(diào)控以控制產(chǎn)物的合成.

微生物在不同的生長(zhǎng)代謝階段對(duì)pH的要求也不同.例如，谷氨酸發(fā)酵的前期需控制pH 7.5左右，發(fā)酵后期pH 7.0左右，在接近放罐時(shí)，為了后續(xù)的提取工作，pH以6.5～6.8為最佳[16].在ε-賴氨酸的發(fā)酵過程中，pH對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成有顯著影響，在發(fā)酵初期pH維持5以上，有利于菌體生長(zhǎng)，在發(fā)酵中后期pH維持在4左右以促進(jìn)產(chǎn)物合成[17-18].因此，在發(fā)酵過程的不同階段可分別控制不同的pH范圍，以提高發(fā)酵產(chǎn)量及產(chǎn)品質(zhì)量.

3.3 溶 氧

溶氧是需氧發(fā)酵控制最為關(guān)鍵的參數(shù)之一.氧在水中的溶解度很小，在發(fā)酵液中的溶解度亦是如此.在工業(yè)發(fā)酵過程中，可以通過控制通氣量、罐體壓力、選擇合適的攪拌形式及速度等來滿足微生物發(fā)酵對(duì)氧的需求.

在微生物發(fā)酵過程中，不同的發(fā)酵階段，因微生物自身生長(zhǎng)及代謝水平的變化，對(duì)溶氧的需求也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化.在發(fā)酵前期，菌體大量繁殖，溶氧逐漸降低，當(dāng)降到一定量時(shí)，需要增加通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速來維持溶氧水平；在產(chǎn)物合成期，菌體進(jìn)入穩(wěn)定期，對(duì)溶氧的需求也相對(duì)穩(wěn)定；發(fā)酵后期，由于菌體衰老，溶氧開始回升，一旦菌體自溶，溶氧將明顯上升.

溶氧對(duì)微生物生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成及產(chǎn)量都會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響，因此，通過調(diào)控溶氧可有效促進(jìn)微生物生長(zhǎng)及提高其生產(chǎn)水平.例如，在PhotorhabdustemperataK122分批發(fā)酵生產(chǎn)生物殺蟲劑的過程中，采用控制溶氧的發(fā)酵調(diào)控策略，當(dāng)溶氧控制在50%時(shí)，生物量提高了41.1%，同時(shí)殺蟲劑活性提高了32.1%[19].在谷氨酸發(fā)酵過程中，供氧不足時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量乳酸和琥珀酸，而谷氨酸產(chǎn)量則會(huì)明顯降低[20].

3.4 攪拌形式及速度

攪拌能使發(fā)酵液充分混勻，使發(fā)酵液中的固形物保持懸浮狀態(tài)，以利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝產(chǎn)物的分散.此外，攪拌最主要的作用是打碎氣泡，提高氣-液接觸面積，以提高氣-液間的傳質(zhì)速率.不同的攪拌形式打碎氣泡的能力及流體混合的效果也有所不同.在小試時(shí)由于物料體積小，攪拌效果好，傳質(zhì)、傳熱問題不明顯，但在中試放大時(shí)必須根據(jù)物料性質(zhì)和反應(yīng)特點(diǎn)，注意攪拌形式和攪拌速度對(duì)發(fā)酵的影響規(guī)律，以便選擇符合要求的攪拌器及確定合適的攪拌速度.目前，傳統(tǒng)發(fā)酵罐普遍采用徑向流動(dòng)方式的圓盤渦輪槳，其主要缺點(diǎn)是混合性能差，且能耗較大.針對(duì)這一問題，王展等采用新型軸流式攪拌槳——英力槳，改進(jìn)傳統(tǒng)設(shè)計(jì)，同時(shí)結(jié)合凹面葉渦輪槳的組合應(yīng)用獲得了較好的氣液分散和整體混合效果[21].

提高攪拌速度有利于發(fā)酵體系的傳質(zhì)，提高溶氧水平，但隨著攪拌速度的逐漸增大，其對(duì)微生物的剪切力也逐漸增強(qiáng).不適的剪切力不僅影響菌體的生長(zhǎng)形態(tài)和生長(zhǎng)速度，還會(huì)直接影響產(chǎn)物的合成.例如在ε-賴氨酸發(fā)酵過程中，當(dāng)攪拌速度在400 r/min情況下，菌絲球呈不規(guī)則形狀，影響細(xì)胞代謝及產(chǎn)量[17].

3.5 發(fā)酵液黏度

黏度是發(fā)酵液的一個(gè)重要物理參數(shù).發(fā)酵液黏度測(cè)量方法簡(jiǎn)便、快捷且準(zhǔn)確性高，可作為發(fā)酵調(diào)控的依據(jù)[22].常規(guī)發(fā)酵過程中，發(fā)酵液黏度與菌絲濃度呈正相關(guān)關(guān)系，發(fā)酵液黏度較小，菌量較低直接影響發(fā)酵產(chǎn)量；而發(fā)酵液黏度過大不僅影響物料和氧的傳質(zhì)，還會(huì)使菌體生長(zhǎng)代謝異常，進(jìn)而影響發(fā)酵水平及后續(xù)的分離純化工作.在頭孢菌素C的生產(chǎn)中，發(fā)酵液的黏度對(duì)發(fā)酵效價(jià)影響顯著，發(fā)酵液后期表觀黏度高于120 Pa·s或低于80 Pa·s的罐批比發(fā)酵液后期表觀黏度在90～110 Pa·s的罐批效價(jià)低10%～15%[23].

適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵液黏度是保證發(fā)酵水平的基礎(chǔ)，但在中試放大過程中，常出現(xiàn)發(fā)酵液黏度異常的情況，因此控制發(fā)酵液黏度是發(fā)酵中試的重要研究?jī)?nèi)容.發(fā)酵液黏度過低，可通過增加接種量、升溫培養(yǎng)、降低通氣量及攪拌速度來調(diào)節(jié).發(fā)酵液黏度過高，可采用定期消泡、低糖控制及補(bǔ)料來調(diào)控[22].例如，袁建棟等在紐莫康定Bo的發(fā)酵過程中，通過流補(bǔ)乳糖和氨水，在提高發(fā)酵水平的同時(shí)，能有效降低發(fā)酵液的黏度，進(jìn)而提高后期分離純化效率，降低生產(chǎn)成本[24].

4 結(jié) 論

發(fā)酵過程中各反應(yīng)的本質(zhì)不會(huì)因?qū)嶒?yàn)與生產(chǎn)的不同而改變，但最佳工藝條件可能隨實(shí)驗(yàn)規(guī)模和設(shè)備等外部條件的不同而改變，這就是微生物發(fā)酵中試的意義所在.微生物發(fā)酵受菌種、培養(yǎng)基、滅菌方式和培養(yǎng)條件等因素影響，研究并合理利用這些因素，可以更好地為發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)服務(wù).在具體生產(chǎn)實(shí)踐中，應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特性，綜合考慮影響發(fā)酵過程的因素，以確定最佳工藝參數(shù)，為發(fā)酵產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)積累必要的經(jīng)驗(yàn)及提供數(shù)據(jù)支持，從而降低產(chǎn)業(yè)化實(shí)施風(fēng)險(xiǎn).

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Discussionsontheinfluencingfactorsofpilot-scalemicrobialfermentation

PING Liying, CHEN Lin, FANG Lina, KUANG Chunlan, FU Lifeng

(Microbial Technology Platform, Hangzhou Zhongmei Huadong Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou 310011, China)

Pilot-scale microbial fermentation is based on the small scale experiment in the lab, which is carried out under simulated industrial production conditions. To ensure the possibility for the future manufacture process, the research and the manufacture process should maintain consistency. The aim of the pilot of microbial fermentation is to verify and recheck the reaction conditions of the process obtained from small scale, providing the guidance for the industrial production. As the link between fundamental research and industrial production, pilot of microbial fermentation is not only necessary to the product development but also provides meaningful experiences and data support for industrial production. Moreover, it is an effective way to reduce the risk in realizing industrialization. Pilot of microbial fermentation is influenced by many factors. Thus, it is of great significance to study and utilize these factors.

microbial fermentation; pilot of microbial fermentation; infect factors

2017-09-18

平麗英(1984—)，女，吉林榆樹人，工程師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵工程及代謝調(diào)控，E-mail：pingly@eastchinapharm.com.通信作者：傅立峰工程師，E-mail：fulifeng@eastchinapharm.com.

TQ92

A

1674-2214(2017)04-0212-04

朱小惠)