，

(1.新疆大學(xué) 科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新疆 阿克蘇 843000；2.上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食用菌研究所， 農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201403)

用SSR分子標(biāo)記分析香菇原生質(zhì)體單核體的遺傳多樣性

吳錦榮1,2，鮑大鵬2

(1.新疆大學(xué) 科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新疆 阿克蘇 843000；2.上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食用菌研究所， 農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201403)

運(yùn)用根據(jù)香菇全基因組設(shè)計(jì)的104 對(duì)SSR引物，對(duì)香菇21 株原生質(zhì)體單核體進(jìn)行了遺傳多樣性分析，有58 對(duì)SSR引物表現(xiàn)出多態(tài)性，多態(tài)性引物比例為55.8%，獲得了430 條擴(kuò)增條帶，其中多態(tài)性條帶占298 條，多態(tài)性條帶比例達(dá)69.3%.運(yùn)用NTSYS-pc21軟件分析了供試菌株之間的遺傳相似性，研究表明：栽培品種和野生菌株之間存在明顯的遺傳差異性，但具有很高的相似系數(shù)的栽培品種之間則存在很近的親緣關(guān)系；同一雙核體得到的兩個(gè)原生質(zhì)體單核體菌株之間存在非常近的遺傳關(guān)系.

香菇；原生質(zhì)體單核體；SSR標(biāo)記；遺傳多樣性

中國(guó)是香菇栽培的發(fā)源地，距今已有近900 年的香菇栽培歷史.香菇在我國(guó)食用菌產(chǎn)業(yè)鏈中占有舉足輕重的地位.香菇是世界第二大人工栽培食用菌，其產(chǎn)量?jī)H次于雙孢蘑菇.香菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展對(duì)香菇育種工作提出許多新的要求，香菇菌株遺傳多樣性分析是育種工作中一項(xiàng)非常重要的基礎(chǔ)性研究,目前已經(jīng)有很多學(xué)者對(duì)我國(guó)香菇自然種質(zhì)資源和栽培品種的遺傳背景進(jìn)行了研究[1-5]，我國(guó)香菇野生品種擁有豐富的多樣性，但是栽培品種的親緣關(guān)系很近，遺傳背景單一，多樣性不豐富.

香菇屬于四極性異宗結(jié)合擔(dān)子菌，有性生活史中絕大部分是以雙核體菌絲體形式存在.目前對(duì)香菇遺傳多樣性的研究都是以雙核體為研究材料，因而所獲得的遺傳差異是兩個(gè)可親和的細(xì)胞核的共同表現(xiàn).而在香菇的雜交育種中，雜交親本通常是單核體菌株.原生質(zhì)體單核體菌株在雜交育種中的優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)為：?jiǎn)魏梭w直接來(lái)源于營(yíng)養(yǎng)菌絲體，無(wú)減數(shù)分裂過(guò)程，從而有利于保存和穩(wěn)定表達(dá)親本優(yōu)良性狀；直接從菌絲體中獲得單核體，減少了育種工作量，也縮短了育種時(shí)間；拓寬了無(wú)法形成子實(shí)體的野生菌質(zhì)的雜交親本基因型.1995年，楊岱筠等[6]得到金針菇菌絲體單核體，并分析了其遺傳特性；1993年，潘迎捷[7]在異宗結(jié)合食用菌原生質(zhì)體制備的研究中發(fā)現(xiàn)，單核體是重要的遺傳材料，為食用菌育種開(kāi)辟新的道路；1999年，上海市農(nóng)科院以香菇栽培菌種Le1和野生菌種0426單核體為親本，雜交選育出了申香8號(hào)菌種，相比親本增產(chǎn)24%～30%[8].2002年，焦海濤等[9]進(jìn)行了香菇單核體雜交試驗(yàn)研究，研究顯示:雜交雙核菌絲生長(zhǎng)速度明顯快于其親本單核體；2008年，宋春艷等進(jìn)行單核體雜交試驗(yàn)時(shí)，以單核體香菇939和中19為親本，考查雜交體和親本菌種子實(shí)體性狀，研究結(jié)果表明：10 個(gè)雜交體的子實(shí)體與親本有明顯差異，且雜交后代的性狀與親本的交配類型有一定的關(guān)聯(lián)性[10].所以，對(duì)香菇單核體菌株的遺傳多樣性的研究不僅能夠?qū)ζ贩N資源有更加深入的了解，而且能夠有助于選擇雜交親本，以及有助于了解品種的遺傳背景，開(kāi)展品種溯源研究.筆者選取了7 對(duì)栽培品種的原生質(zhì)體單核體和7 個(gè)野生菌株的原生質(zhì)體單核體作為供試材料，采用基于香菇全基因組中發(fā)掘的SSR分子標(biāo)記對(duì)這些單核體的遺傳多樣性進(jìn)行分析.研究表明：21株香菇原生質(zhì)體單核體間存在遺傳差異性，相互之間存在一定的遺傳多樣性.這是首次對(duì)香菇單核體之間的親緣關(guān)系進(jìn)行報(bào)道.

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試香菇菌株共21 株(表1)，均為原生質(zhì)體單核體，其中9 對(duì)菌株分別來(lái)源于同一香菇雙核體菌株，Xd2-6-1，Xd2-3-1和Xd3-3-1菌株分別來(lái)源于3個(gè)不同親本.

表1 供試香菇菌株Table 1 Lentinus edodes strains tested in this study

1.2 SSR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)香菇全基因組數(shù)據(jù)(http://172.17.21.49/)，運(yùn)用Primer primer 5軟件設(shè)計(jì)SSR引物，并由上海生工生物技術(shù)公司合成.

1.3 香菇單核體菌絲中基因組DNA提取

采用改進(jìn)的CTAB法[11]提取香菇單核菌絲體中的基因組DNA.

1.4 PCR擴(kuò)增和凝膠電泳

10 μL PCR反應(yīng)體系中含有：1 μL的基因組DNA(50～100 ng/μL)，1 μL 10×PCR緩沖液，0.2 μL dNTP(10 nmol/L)，1 μL MgCl2(25 nmol/L)，0.1 μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL，Takara公司)，引物(10 μmol/L)各0.75 μL，5.2 μL ddH2O.

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃下5 min；然后在94 ℃下50 s，55 ℃下50 s，72 ℃下50 s，共30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃保持5 min.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入6 μL加樣緩沖液，混合均勻后在95 ℃下變性5 min，然后置于冰水混合物中冷卻3 min，取3 μL于6%變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，電泳緩沖液為1×TBE，電泳條件為：電壓1 000 V，電流200 mA，功率200 W，電泳時(shí)間為45 min.電泳結(jié)果銀染顯色后拍照，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)電泳結(jié)果，有擴(kuò)增條帶記為1，無(wú)條帶記為0，生成距陣，利用NTSYS-pc軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ΜPGMA聚類分析[12].

2 結(jié)果與分析

2.1 供試SSR引物的多態(tài)性分析

根據(jù)香菇全基因組序列設(shè)計(jì)了共顯性、穩(wěn)定性、多態(tài)性和易操作性高，具有擴(kuò)增產(chǎn)物的104 對(duì)SSR引物，經(jīng)對(duì)21 個(gè)單核體菌株的遺傳多樣性分析，其中有58 對(duì)引物表現(xiàn)出多態(tài)性，占總數(shù)的55.8%，如表2所示.

表2 具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記對(duì)應(yīng)引物Table 2 The information on polymorphic SSR maker and corresponding primers

注：1) (GGA)5-1為(GGA)5gtcgaaggtggaggaggttgttgaggaggaatcccctgcaccggcacctt(CCA)5；2) (TCG)5-2為(TCG)5tcatcatccgaggaatgttccga(ACC)8.

在具有多態(tài)性的58 對(duì)SSR引物標(biāo)記中，以遺傳穩(wěn)定、多態(tài)性高和可靠性強(qiáng)的重復(fù)單位二核苷酸和三核苷酸的類型最多，分別為18 個(gè)和22 個(gè)，分別占總數(shù)的31.0%和37.9%.即不采用單拷重復(fù)位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，從而有效地提高原生質(zhì)體單核體遺傳多樣性的鑒定成功率.

上述58 對(duì)多態(tài)性SSR引物在21 個(gè)單核體菌株中共擴(kuò)增出430 條條帶，其中多態(tài)性條帶為298 條，比例達(dá)69.3%.

2.2 供試單核體菌株的遺傳多樣性分析

應(yīng)用NTSYS-pc21軟件對(duì)21 個(gè)供試香菇單核體菌株進(jìn)行遺傳聚類分析(圖1)，以0.58相似性為切割點(diǎn)，供試菌株可以分為三大類群：類群一為4 株來(lái)自湖南張家界的野生菌株的單核體；類群二為3 株來(lái)自四川喜德縣野生菌株的單核體；類群三為14 株來(lái)自栽培菌種的單核體.其中2 株單核體親本為日本栽培菌株.

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在相似系數(shù)很高的點(diǎn)，約為0.78，有一個(gè)聚集類群，即來(lái)自于國(guó)內(nèi)的7 個(gè)(表1中的菌株編號(hào)為1，2，3，4，5，6，7)栽培菌株的原生質(zhì)體單核體，從而揭示出它們之間很相似的遺傳背景.遺傳背景最相似的是源自親本L66、申18、241及9015菌株的單核體，它們之間存在著最高的相似系數(shù)，約為0.88.這一現(xiàn)象暗示了它們可能有比較近的共同祖先，也表明來(lái)自相同親本的單核體間得到的親本遺傳物質(zhì)較豐富且穩(wěn)定.

圖1 基于58個(gè)SSR標(biāo)記的21個(gè)香菇單核體的聚類圖Fig.1 Cluster analysis dendrogram based on 58 SSR markers in 21 monokaryons of L. edodes

3 結(jié) 論

已經(jīng)有很多學(xué)者對(duì)香菇栽培品種和野生菌株的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，對(duì)親本的遺傳多樣性進(jìn)行研究是育種工作的基礎(chǔ)，成功選育優(yōu)良性狀的菌種，關(guān)鍵在于正確選擇雜交親本，在雜交過(guò)程中將親本的優(yōu)良性狀保留并傳遞下去.迄今為止，所開(kāi)展的香菇遺傳多樣性研究都是以雙核體菌株為供試材料，導(dǎo)致發(fā)生遺傳距離偏向于雙核菌種中某一單核受體親本的情況.而以單核體為供試材料的香菇遺傳多樣性研究則不會(huì)出現(xiàn)這種狀況.本文的供試原生質(zhì)體單核體與孢子單核體完全不同：一是依靠原生質(zhì)體單核化技術(shù)得到；二是雙核菌絲體未經(jīng)減數(shù)分裂階段.因最終獲得的單核體未經(jīng)基因重組階段，因此供試菌株的雜交遺傳背景被純粹、完整和準(zhǔn)確地反映出來(lái).此次研究的21 株供試單核體的聚類分析結(jié)果表明：所試香菇的栽培與野生菌株之間具有較大的遺傳距離，栽培菌株之間的親緣關(guān)系非常相近，與之前對(duì)香菇雙核體的遺傳多樣性的研究結(jié)果相一致[13-14].本研究首次對(duì)香菇單核體的遺傳多樣性進(jìn)行了報(bào)道，為以后對(duì)香菇遺傳多樣性的研究開(kāi)辟了一條新路徑.筆者的研究方法助推了今后對(duì)香菇雜交親本遺傳背景的全面、細(xì)致地解剖與了解.在本研究的聚類分析中一個(gè)比較有趣的結(jié)果：來(lái)自同一親本的兩個(gè)原生質(zhì)體單核體多數(shù)聚集在一個(gè)小類群中，具有相似性，表明它們之間具有很近的親緣關(guān)系.這種現(xiàn)象不僅表現(xiàn)在栽培菌株中，如L66-1和L66-2，武香1號(hào)-1和武香1號(hào)-2，44-1和44-2，而且也表現(xiàn)在野生菌株中，如L321-1和L321-2，L391-1和L391-2.可以將這個(gè)結(jié)果稱之為“親本近緣”現(xiàn)象，雖然目前所獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)尚不足以充分證明“親本近緣”這一結(jié)論，但這種自然現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)值得進(jìn)一步開(kāi)展研究，并從中揭示新的自然規(guī)律，有意識(shí)地引入外來(lái)類型和野生菌株等重要的種質(zhì)資源，拓寬育種基礎(chǔ)，為香菇雜交育種工作提供新的理論指導(dǎo).

[1] 宋瑩,劉娜,肖千明,等.十五個(gè)香菇菌株遺傳特異性研究[J].北方園藝,2014,22(18):163-166.

[2] 宋瑩,張忠偉,劉俊杰,等.香菇遼撫4號(hào)遺傳差異性分析[J].育種馴化,2016,38(5):19-20.

[3] 羅海凌,鄒龍玉,方雪婷,等.香菇遺傳多樣性研究進(jìn)展[J].北方園藝,2014,24(21):185-187.

[4] 巫萍,章?tīng)t軍,張丹,等.利用SSR標(biāo)記鑒定香菇單核體及雜交后代[J].微生物學(xué)通報(bào),2016,43(2):444-455.

[5] 劉靖宇,宋秀高,葉夏,等.香菇菌株遺傳多樣性ISSR、RAPD

和SRAP綜合分析[J].食用菌學(xué)報(bào),2011,18(3):1-8.

[6] 楊岱筠,張丕奇,鄭美媛,等.白色金針茹原生質(zhì)體單核菌系的建立及其遺傳特性分析[J].食用菌學(xué)報(bào),1995,2(4):18-21.

[7] 潘迎捷.異宗結(jié)合食用菌的原生質(zhì)體單核化[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),1993,9(2):1-5.

[8] 譚埼,潘迎捷,等.用單核原生質(zhì)體雜交育成香茹新菌株申香8號(hào)[J].食用菌學(xué)報(bào),1999,6(2):3-6.

[9] 焦海濤,楊先新,周偉,等.香茹原生質(zhì)體單核體雜交方法試驗(yàn)[J].中國(guó)食菌,2002,21(6):8-10.

[10] 宋春艷,尚曉冬,譚琦,等.香茹原生質(zhì)體單核體雜交后代性狀變異初探[J].食用菌學(xué)報(bào),2008,15(3):1-6.

[11] 張紅,秦蓮花,譚琦,等.用改進(jìn)的CTAB法提取香菇基因組DNA[J].上海大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2006,12(5):547-550.

[12] JAIN N, JAIN S, SAINI N, et a1. SSR analysis of chromosome 8 regions associated with aroma and cooked kernel elongation in Basmati rice[J]. Euphytica, 2006,152(2):259-273.

[13] 龔利娟,李玉,劉淑艷.香菇品種遺傳多樣性RAPD分子標(biāo)記的研究[J].菌物研究,2005,3(1):17-21.

[14] 劉春滟,李南羿,張玉瓊.香菇EST-SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用[J].食用菌學(xué)報(bào),2010,17(2):1-6.

TheanalysisofgeneticdiversityofLentinulaedodesprotoplastedmonokaryonsbySSRmarkers

WU Jinrong1,2, BAO Dapeng2

(1.School of Science and Technology, Xinjiang University, Akesu 843000, China;2.Key Laboratory of Applied Mycological Resources and Utilization, Ministry of Agriculture, Edible Fungi Institute, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201403, China)

By using 104 pairs of SSR primers designed from the whole genome ofLentinulaedodes, the genetic diversity of 21 protoplasted monokaryons ofLentinulaedodeswas analyzed. The results showed that 58 pairs of SSR primers, accounting for 55.8% of the designed primers, produce 298 polymorphic fragments, accounting for 69.3% of the total 430 amplified fragments. The genetic similarity among the tested stains was analyzed by using NTSYS-pc21 software, and the results found significant differences existed between the cultivated strain and the wild strain. However, the cultivars with high similarity coefficients exhibited close genetic relationships between each other. At the same time, the study also showed that very close genetic relationship exists between the two protoplast mononuclear strains obtained from the same two nucleosomes.

Lentinulaedodes; protoplasted monokaryon; SSR marker; genetic diversity

2017-09-11

上海市科委重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(10391900900)；上海市農(nóng)委種業(yè)專項(xiàng)(滬農(nóng)科種字(2012)第6號(hào)資助)

吳錦榮(1985—)，女，新疆博樂(lè)人，講師，碩士，研究方向?yàn)槭秤镁z傳，E-mail：850640619@qq.com.

S646

A

1674-2214(2017)04-0233-05

朱小惠)