，，，

(1.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津 300457；2.天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津 300457；3.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457)

琥珀酸對大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的影響

劉鎮(zhèn)瑜1,2,3，蔡萌萌1,2,3，劉子強(qiáng)1,2,3，徐慶陽1,2,3

(1.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津 300457；2.天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津 300457；3.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457)

以色氨酸生產(chǎn)菌EscherichiacoliTRTH為出發(fā)菌株，在30 L發(fā)酵罐上進(jìn)行實驗，在發(fā)酵10 h后隨糖外源流加1 g/L的琥珀酸，以降低代謝抑制物質(zhì)的積累量，提高L-色氨酸的產(chǎn)量.實驗結(jié)果顯示：外源流加1 g/L的琥珀酸發(fā)酵與未流加琥珀酸發(fā)酵相比，菌體生物量與L-色氨酸產(chǎn)量分別提高了5.4%和10.0%，乙酸積累量下降了9.5%，糖酸轉(zhuǎn)化率提高了4.0%.這表明外源流加1 g/L琥珀酸發(fā)酵可以提高L-色氨酸的產(chǎn)量，降低乙酸的積累量，提高糖酸轉(zhuǎn)化率.

L-色氨酸；琥珀酸；乙酸；糖酸轉(zhuǎn)化率

L-色氨酸是一種芳香族氨基酸，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥與衛(wèi)生等行業(yè)[1].L-色氨酸作為人體所必需的八種氨基酸之一，在生物體的生理生化、代謝等方面有著重要作用[2].L-色氨酸的生產(chǎn)方法主要包括酶法、微生物轉(zhuǎn)化法與微生物發(fā)酵法[3].其中微生物發(fā)酵法由于具有材料來源廣泛、價格低廉等優(yōu)勢而得到大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用[4].微生物發(fā)酵法的研究主要集中在菌種改造以及發(fā)酵過程控制優(yōu)化等方面[5-8].截至目前，通過菌種改造與發(fā)酵過程控制優(yōu)化等手段，L-色氨酸的產(chǎn)量可以達(dá)到54.5 g/L[9].發(fā)酵法生產(chǎn)L-色氨酸常用的菌株包括大腸桿菌與谷氨酸棒狀桿菌，由于大腸桿菌具有發(fā)酵周期短、易培養(yǎng)，并能實現(xiàn)基因的高效表達(dá)等特性，因此是目前工業(yè)化生產(chǎn)的常用菌株[10].

大腸桿菌發(fā)酵法生產(chǎn)L-色氨酸的過程中，乙酸一直是抑制產(chǎn)色氨酸的主要因素[11].為了減少發(fā)酵過程中乙酸的積累量，提高色氨酸的產(chǎn)量，可對發(fā)酵培養(yǎng)基的成分進(jìn)行優(yōu)化，或者結(jié)合菌體的代謝特性，在發(fā)酵過程中流加一定的物質(zhì)，從而達(dá)到減緩乙酸的積累量、提高色氨酸產(chǎn)量的目的.有研究報道，枯草芽孢桿菌連續(xù)發(fā)酵時，葡萄糖與檸檬酸聯(lián)合應(yīng)用會減弱EMP途徑，阻遏有機(jī)酸的生物合成[12]，依據(jù)大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的代謝流分布，添加的硫酸鹽質(zhì)量濃度達(dá)到8 g/L時會降低大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的生物轉(zhuǎn)化率，而添加4 g/L的磷酸二氫鉀會顯著地提高L-色氨酸合成的代謝流[13].在菌體的生物代謝過程中，琥珀酸作為TCA循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，廣泛存在于動物、植物以及微生物中[14-15].在微生物代謝過程中，微生物利用葡萄糖合成琥珀酸可以為菌體的生長提供所需要的能量以及其他生物大分子前體物，并且琥珀酸還是TCA循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，在代謝過程中可以補(bǔ)充能量損耗[16].因此筆者研究了外源添加一定量的琥珀酸對大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸過程中菌體生物量、L-色氨酸產(chǎn)量、乙酸積累量與糖酸轉(zhuǎn)化率的影響.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌 株

EscherichiacoliTRTH菌株由天津科技大學(xué)工業(yè)微生物菌種保藏室提供.

1.1.2 培養(yǎng)基

活化斜面培養(yǎng)基：葡萄糖1 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 2.5 g/L，瓊脂條20 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃ 滅菌20 min.

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母粉3 g/L，檸檬酸1.6 g/L，(NH4)2SO43 g/L，K2HPO45.6 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.8 mg/L，MgSO4·7H2O 1.6 g/L，VB11.3 mg/L，VH0.3 mg/L，115 ℃滅菌15 min.

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母粉2 g/L，檸檬酸1 g/L，琥珀酸1 g/L，(NH4)2SO45 g/L，K2HPO47.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 70 mg/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，氯化膽堿0.5 g/L，VB12 mg/L，VH0.5 mg/L，微量元素1 ml/L，115 ℃滅菌15 min.

微量元素溶液成分：鉬酸銨0.28 mg/L，硼酸5 mg/L，CoCl2·6H2O 1.4 mg/L，CuSO4·7H2O 0.5 mg/L，ZnSO4·7H2O 0.6 mg/L.

1.2 儀器與設(shè)備

5 L和30 L自動控制發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備公司；恒溫培養(yǎng)箱，杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；氨基酸色譜分析儀器，美國Laballiance設(shè)備公司；752分光光度計，上海分析儀器廠；TGL-16G臺式高速離心機(jī)，上海醫(yī)用分析儀器廠；生物傳感分析儀，山東科學(xué)院生物研究所.

1.3 方 法

1.3.1 斜面活化培養(yǎng)

取斜面菌種劃線接種于250 mL茄形瓶中，然后將活化斜面放置于36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20 h.

1.3.2 5 L罐種子培養(yǎng)

取200 mL滅菌后的無菌水倒于250 mL茄形瓶中并用接種針將菌體懸浮，采用火焰接種的方式將菌體懸浮液接種于5 L種子罐中.培養(yǎng)溫度為36 ℃，通過自動流加25%的氨水保持pH在7.0[17].種子培養(yǎng)過程保持溶氧水平在30%.培養(yǎng)12 h后至種子OD600接近于15，準(zhǔn)備接入發(fā)酵罐.

1.3.3 30 L罐發(fā)酵培養(yǎng)

以15%的接種量將種子液接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的30 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵.維持溶氧水平在20%～30%.通過自動流加25%的氨水維持pH在7.0，以泡敵消泡.培養(yǎng)過程中待初始葡萄糖消耗完畢時，以一定的速率流加葡萄糖，發(fā)酵過程中每隔2 h取樣測定，在發(fā)酵10 h后開始隨糖流加1 g/L的琥珀酸.

1.3.4 pH值測定

采用pH電極與pH 6.4～8.0精密pH試紙測定。

1.3.5 溶氧水平測定

采用溶氧電極實時檢測發(fā)酵液中的溶解氧含量。通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速與通氣量維持發(fā)酵過程中的溶氧水平在20%～30%。

1.3.6 菌體生物量測定

取10 mL發(fā)酵液，8 000 r/min離心5 min，用蒸餾水洗滌離心兩次，105 ℃烘干至恒重。用電子分析天平稱重。

1.3.7 葡萄糖濃度的測定

采用SBA-40C(山東科學(xué)院生物研究所)生物傳感儀測定。先吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖乳酸樣液25 μL進(jìn)樣標(biāo)定，直至標(biāo)定結(jié)束，取發(fā)酵液1 mL離心，取上清液10 μL，稀釋100倍后，取25 μL稀釋液進(jìn)樣直接讀數(shù)。

1.3.8 L-色氨酸質(zhì)量濃度的測定

L-色氨酸質(zhì)量濃度采用高效液相色譜法與比色法分別進(jìn)行測定。

1) 高效液相色譜法

發(fā)酵液的預(yù)處理：取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL EP管中，13 000 r/min離心2 min，取上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，過膜待測，同時取5 g/L的L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣液，分別稀釋到相應(yīng)倍數(shù)作為對照。

高效液相色譜分離條件：Agilent C18(15 mm×4.6 mm，3.5 μm)，流動相V(0.03% KH2PO4溶液)∶V(甲醇)=90∶10，流速1 mL/min，檢測波長278 nm。

2) 比色法

準(zhǔn)確量取不同濃度的色氨酸溶液20 μL與對二甲氨基苯甲醛5 mL混合，移入比色管中沸水加熱2 min，加入亞硝酸鈉1滴，再繼續(xù)加熱3 min，冷水浴冷卻，以試劑作空白，用1 cm比色皿在600 nm處測定吸光值。

1.3.9 乙酸質(zhì)量濃度的測定

乙酸質(zhì)量濃度測定采用高效液相色譜法進(jìn)行測定。發(fā)酵液預(yù)處理：取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL離心管中，13 000 r/min離心2 min，取上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，過膜待測。

高效液相色譜分離條件：色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87 h(300 mm×7.8 mm，L×I.D.)；流動相為0.005 mol/L H2SO4，柱溫30 ℃，流速0.5 mL/min，檢測波長210 nm。

2 結(jié) 果

2.1 琥珀酸對菌體生物量及比生長速率的影響

在色氨酸的發(fā)酵過程中，在發(fā)酵10 h后隨葡萄糖外源流加1 g/L的琥珀酸，與普通發(fā)酵(未流加琥珀酸)相比其菌體生物量與比生長速率如圖1所示.由圖1可知：在發(fā)酵10 h后流加1 g/L琥珀酸有利于提高菌體的生物量，與普通發(fā)酵相比，發(fā)酵10 h后流加1 g/L的琥珀酸，菌體生物量由48.4 g/L提高到51 g/L，提高了5.4%.這主要是由于琥珀酸是TCA循環(huán)的中間代謝物，在代謝過程中可以補(bǔ)充能量損耗.發(fā)酵過程中外源流加琥珀酸可以提高TCA循環(huán)能力，為菌體生長提供更多的能量來源.由于琥珀酸可以增加TCA循環(huán)的碳代謝通量，這就使得流向EMP途徑與TCA循環(huán)的代謝溢流現(xiàn)象得到緩解，解決了由于碳代謝溢流現(xiàn)象導(dǎo)致的乙酸積累問題.主要的抑制性代謝副產(chǎn)物乙酸的積累量下降進(jìn)一步提高了菌體生物量.由于外源流加琥珀酸使菌體的TCA循環(huán)能力進(jìn)一步加強(qiáng)，菌體能量供應(yīng)充足，使得發(fā)酵過程中菌體的比生長速率處于相對較高的水平.

圖1 琥珀酸對菌體生物量與比生長速率的影響Fig.1 Effect of succinic acid on biomass and specific growth rate

2.2 琥珀酸對L-色氨酸質(zhì)量濃度和比產(chǎn)酸速率的影響

在發(fā)酵10 h后隨糖流加1 g/L的琥珀酸對L-色氨酸質(zhì)量濃度與比產(chǎn)酸速率的影響如圖2所示.由圖2可知：外源流加1 g/L的琥珀酸使L-色氨酸的質(zhì)量濃度得到了一定程度的提高，與未流加琥珀酸發(fā)酵相比，流加琥珀酸后L-色氨酸的質(zhì)量濃度由36.1 g/L提高到39.7 g/L，提高了10.0%，比產(chǎn)酸速率也得到一定程度的提高.L-色氨酸質(zhì)量濃度的提高主要是由于菌體生物量的增長與抑制性代謝副產(chǎn)物乙酸積累量的下降.L-色氨酸作為細(xì)胞代謝產(chǎn)生的初級代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)量的高低與菌體生物量濃度有著密切關(guān)系.由于外源流加琥珀酸提高了TCA循環(huán)的代謝通量，減少了E.coli需要乙酸合成途徑來填補(bǔ)菌體對ATP和NADH的能量需求，從而降低了乙酸的積累量.抑制性代謝副產(chǎn)物乙酸積累量的減少以及菌體生物量的增加使得L-色氨酸的產(chǎn)量得到一定程度的提高.

圖2 琥珀酸對L-色氨酸質(zhì)量濃度與比產(chǎn)酸速率的影響Fig.2 Effect of succinic acid on L-tryptophan production and specific acid production rate

2.3 琥珀酸對乙酸積累量的影響

在發(fā)酵10 h后外源流加1 g/L的琥珀酸，整個發(fā)酵過程中的乙酸積累量如圖3所示.由圖3可知：發(fā)酵10 h后流加1 g/L的琥珀酸，與未流加琥珀酸相比，乙酸積累量有一定程度的下降，流加1 g/L的琥珀酸時發(fā)酵32 h乙酸的最大質(zhì)量濃度為7.6 g/L，而未流加琥珀酸時乙酸的最大質(zhì)量濃度為8.4 g/L，乙酸的最大積累量下降了9.5%.乙酸作為大腸桿菌發(fā)酵L-色氨酸過程中主要的抑制性副產(chǎn)物，對菌體生長與目的產(chǎn)物的生成均有不利影響[18].在大腸桿菌好氧發(fā)酵過程中，乙酸的生成主要是為菌體的生長提供ATP.在發(fā)酵10 h菌體的生物量達(dá)到一定量的時候開始流加琥珀酸，可以加強(qiáng)TCA循環(huán)的代謝流，為菌體的生長提供充足的ATP和NADH，避免了菌體利用乙酸途徑彌補(bǔ)能量代謝的不足.乙酸積累量的下降也使得L-色氨酸發(fā)酵過程中主要的反饋抑制作用得到解除，促進(jìn)了菌體生物量與L-色氨酸產(chǎn)量的提高.

圖3 琥珀酸對乙酸積累量的影響Fig.3 Effect of succinic acid on the accumulation of acetic acid

2.4 琥珀酸對糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

在發(fā)酵時長10 h，菌體生物量達(dá)到一定量的時候開始流加1 g/L的琥珀酸，糖酸轉(zhuǎn)化率變化情況如圖4所示，琥珀酸對發(fā)酵過程總糖酸轉(zhuǎn)化率的影響如圖5所示.

圖4 琥珀酸對糖酸轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of succinic acid on glcose conversion rate

圖5 琥珀酸對發(fā)酵過程總糖酸轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of succinic acid on total glcose conversion rate during fermentation

由于外源流加琥珀酸發(fā)酵時菌體生物量的提高，以及主要抑制性副產(chǎn)物乙酸積累量的下降，細(xì)胞能夠以較高的速率合成色氨酸，使得發(fā)酵過程中的糖酸轉(zhuǎn)化率也得到一定程度的提高.由圖4可知：相對于未流加琥珀酸發(fā)酵，在發(fā)酵10 h后開始流加琥珀酸的糖酸轉(zhuǎn)化率一直處在相對較高的水平.從圖5可知：整個發(fā)酵過程中流加1 g/L的琥珀酸時的總糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到18.2%，而常規(guī)未添加琥珀酸發(fā)酵時的總糖酸轉(zhuǎn)化率為17.5%，糖酸轉(zhuǎn)化率提高了4.0%.

3 結(jié) 論

琥珀酸對三羧酸循環(huán)有促進(jìn)作用，對乙醛酸循環(huán)有抑制作用[19].在大腸桿菌體內(nèi)的TCA循環(huán)代謝過程中，琥珀酸作為代謝過程的中間代謝產(chǎn)物，在發(fā)酵過程中可以補(bǔ)充細(xì)胞代謝過程的能量損耗.在色氨酸發(fā)酵的過程中，發(fā)酵10 h后開始隨糖流加1 g/L的琥珀酸，可增加TCA循環(huán)的碳代謝通量，為菌體生長提供更多的能量來源，減少EMP途徑與TCA循環(huán)的碳代謝溢流現(xiàn)象，從而降低抑制性副產(chǎn)物乙酸的積累量，提高L-色氨酸的產(chǎn)量.實驗結(jié)果表明：在發(fā)酵10 h后隨糖流加1 g/L的琥珀酸，菌體生物量與L-色氨酸質(zhì)量濃度分別達(dá)到51，39.7 g/L，與未添加琥珀酸發(fā)酵相比分別提高了5.4%與10.0%.整個發(fā)酵過程中乙酸的最大積累量與未添加琥珀酸相比下降了9.5%.由于抑制性副產(chǎn)物乙酸積累量的降低和菌體生物量的提高，添加1 g/L的琥珀酸后糖酸轉(zhuǎn)化率也得到了一定程度的提高.筆者只研究了外源流加1 g/L的琥珀酸對色氨酸發(fā)酵過程的影響，更為有效的外源流加物的選擇與流加物濃度的確定還有待于后續(xù)研究.

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TheeffectofsuccinicacidonthefermentationofL-tryptophanbyEscherichiacoli

LIU Zhenyu1,2,3, CAI Mengmeng1,2,3, LIU Ziqiang1,2,3, XU Qingyang1,2,3

(1.National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology, Tianjin 300457, China; 2.Tianjin Engineering Lab of Efficient and Green Amino Acid Manufacture, Tianjin 300457, China; 3.College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

EscherichiacoliTRTH was taken as the starting strain for tryptophan production. The succinic acid was added with glucose after 10 h fermentation in the 30 L fermenter to reduce the accumulation of metabolic inhibitors and increase the L-tryptophan yield. When 1 g/L succinic acid was added, the biomass, L-tryptophan production and glucose conversion rate were increased by 5.4%, 9.98% and 4% respectively, while the accumulation of acetic acid was decreased by 9.5%. The results suggests that the addition of 1 g/L succinic acid can increase the production of L-tryptophan, reduce the accumulation of the acetic acid and improve the glucose conversion rate.

L-tryptophan; succinic acid; acetic acid; glucose conversion rate

2017-07-03

天津市科技支撐計劃重點項目(14ZCZDSY00015)；天津市科技特派員項目(15JCTPJC57000)

劉鎮(zhèn)瑜(1990—)，男，河南安陽人，碩士研究生，研究方向為代謝控制發(fā)酵，E-mail:1905302718@qq.com.通信作者:徐慶陽副研究員，E-mail:xuqingyang@tust.edu.cn.

TQ922

A

1674-2214(2017)04-0238-05

朱小惠)