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(1.梅花生物科技集團股份有限公司，河北 廊坊 065001；2.廊坊梅花生物技術開發(fā)有限公司，河北 廊坊 065001)

L-異亮氨酸高效液相色譜檢測方法的研究

唐艷1，李晶1，吳濤2

(1.梅花生物科技集團股份有限公司，河北 廊坊 065001；2.廊坊梅花生物技術開發(fā)有限公司，河北 廊坊 065001)

L-異亮氨酸在紫外光區(qū)無吸收峰，需將其進行衍生后才能測定.通過對比兩種柱前衍生方法，建立高效液相色譜法柱前衍生檢測L-異亮氨酸質量分數的方法.OPA自動衍生法檢測耗時15 min，R=1，加標回收率99%～100.1%，RSD<1.0%；PITC手動衍生法檢測耗時30 min，加標回收率96%～98%，RSD<1%.OPA自動衍生法在檢測的時效性和準確性方面均具有明顯優(yōu)勢，可用來高效地檢測L-異亮氨酸的質量分數，在生物發(fā)酵、飼料添加劑、食品添加劑和制藥等領域具有較高的應用價值.

異亮氨酸；高效液相色譜；OPA；自動衍生；手動衍生

L-異亮氨酸(L-isoleucine)是人體必需氨基酸，是支鏈氨基酸的重要一員，具有促進體內蛋白質、酶和肽類激素合成等功能，在肌肉蛋白代謝中尤為重要[1]，主要用于治療神經障礙、食欲減退和貧血等，有增強機體免疫力的功能，是氨基酸輸液、氨基酸口服劑不可缺少的組分[2].此外，L-異亮氨酸被廣泛運用于食品工業(yè)、化妝品、光化學和電化學等領域[3-4].L-異亮氨酸主要通過發(fā)酵法生產[5]，在生產中準確、高效地檢測L-異亮氨酸質量分數顯得至關重要.目前，介紹L-異亮氨酸測定方法的文獻較少，采用紙層析法[6]、化學比色法[7]測定L-異亮氨酸準確度低，使用氨基酸分析儀測定成本較高[8]，不適用于生產測定.筆者對比了兩種柱前衍生方法，建立了一種高效液相色譜法柱前衍生檢測L-異亮氨酸質量分數的方法.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器

高效液相色譜儀(Agilent technologies 1200)，Mili-Q超純水機(元原科貿)，電子天平(精度±0.000 1 g)(梅特勒-托利多)，真空泵磁力攪拌器、pH計FE20(梅特勒-托利多).

1.1.2 主要試劑

二水合磷酸二氫鈉(分析純)，氫氧化鈉(分析純)，乙腈(色譜純)，甲醇(色譜純)，鄰苯二甲醛試劑(OPA)，硼酸緩沖液(安捷倫公司)，L-異亮氨酸標準物質(Sigma公司)，三乙胺、異硫氰酸苯酯(PITC)，蛋氨酸(生化試劑)，乙酸鈉(色譜純).

1.2 溶液的配制

1.2.1 OPA自動衍生法

流動相A：稱取6.24 g二水合磷酸二氫鈉，轉移到1 000 mL玻璃燒杯中，加入1 000 mL超純水，攪拌，直到所有晶體完全溶解，用氫氧化鈉調節(jié)溶液pH值至7.80.

流動相B：V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10.

1.2.2 PITC手動衍生法

三乙胺乙腈溶液(1 mol/L)：取三乙胺695 μL，加乙腈4.30 mL.

異硫氰酸苯酯乙腈溶液(1 mol/L)：取60 μL PITC，加乙腈4.94 mL.

流動相A：V(乙腈)∶V(水)=80∶20.

流動相B：乙酸鈉水溶液50 mmol/L.

1.3 樣品處理

1.3.1 OPA自動衍生法

準確稱取樣品0.100 0 g，用蒸餾水定容至200 mL，備用.

準確稱取L-異亮氨酸標準物質0.100 0 g，用蒸餾水定容至100 mL，稀釋成不同質量濃度(0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 g/L).

1.3.2 PITC手動衍生法

內標物溶液制備：準確稱取蛋氨酸0.400 0 g于100 mL容量瓶中，加水溶解，定容，備用.

對照品溶液制備：稱取L-異亮氨酸適量，加水溶解，配制質量濃度為1 mg/mL的溶液.移取5 mL L-異亮氨酸標準物質溶液和2 mL內標物溶液，加水20 mL，混勻，備用.

樣品溶液制備：稱取1 g異亮氨酸成品于100 mL容量瓶中，加水溶解并定容.移取5 mL樣品溶液和2 mL內標物溶液，加水20 mL，混勻，備用.

1.4 色譜條件

1.4.1 OPA自動衍生色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse AAA 4.6 mm×75 mm 3.5-Micron，柱溫40 ℃，檢測波長338 nm，進樣量0.5 μL，流動相A為磷酸二氫鈉溶液，流動相B為V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10，流速為2 mL/min；梯度洗脫：0～1 min，0% B；1～9.8 min，57% B；9.8～10 min，100% B；10～12 min，100% B.

1.4.2 PITC手動衍生色譜條件:

色譜柱：Hypersil 5 AA-ODS 200 mm×2.1 mm，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，檢測波長254 nm，進樣量3 μL.梯度洗脫條件：φ(流動相A)∶φ(流動相B)=24%∶76%，保持20 min；φ(流動相A)∶φ(流動相B)=10%∶90%，保持10 min.

1.5 操作步驟

1.5.1 OPA自動衍生法

將樣品和標品稀釋液過膜上機，自動衍生化反應，吸取硼酸緩沖液2.5 μL，樣品0.5 μL，OPA 0.5 μL，混合空氣3 μL，最大速度混合5 次，再吸取水32 μL，混合空氣18 μL，最大速度混合2 次，注入色譜柱，進行色譜分析.

1.5.2 PITC手動衍生法

吸取對照品溶液及樣品溶液各300 μL，分別置于1.5 mL離心管中，向每個離心管中加入三乙胺乙腈溶液150 μL，異硫氰酸苯酯乙腈溶液150 μL，混勻，室溫放置1 h，然后加入正己烷600 μL，振搖后放置10 min，取下層溶液，用0.22 μm水相針式過濾器過濾.

待液相色譜穩(wěn)定后，取上述溶液進行色譜分析.

2 結果與討論

2.1 OPA自動衍生法

2.1.1 進樣量的選擇

采用0.2，0.5，1.0，1.5 μL進樣量進行衍生化反應，其中0.5 μL反應完全，平行測定樣品RSD<1%，其他三種RSD>2%.綜合考慮反應程度、結果精密度和準確度，確定進樣量為0.5 μL.

2.1.2 檢測波長的選擇

用紫外檢測器測定異亮氨酸質量分數，在波長338 nm有最大吸收峰，基線穩(wěn)定，靈敏度高，在<262 nm處無峰.綜合考慮待測組分最大吸收波長、靈敏度、分離度、基線穩(wěn)定性，最終確定檢測波長為338 nm.

利用自動衍生方法，對不同質量濃度的標品(0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 g/L)進行色譜分析，出峰譜圖見圖1，X軸為標品濃度，Y軸為峰面積，出峰時間為7.5 min.制作標準曲線見圖2，線性方程為Y=1 445.024 4X-2.090 2，相關系數R2=1.

圖1 樣品出峰譜圖Fig.1 Chromatogram of the sample

圖2 自動衍生法標準曲線圖Fig.2 Automatic derivation of L-isoleucine standard curve

按本測定方法所確定的實驗條件，對L-異亮氨酸標準品作質量分數驗證，測定樣品加標回收率，確保檢測系統(tǒng)無影響，質量分數為99.5%的標準品，檢測結果為99.2%，樣品檢測RSD<2%，加標回收率>99%，此方法準確度高、結果可靠.具體檢測結果見表1.

表1 樣品檢測結果和回收率Table 1 Determination results and recovery of samples

2.2 PITC手動衍生法

采用手動衍生方法測定L-異亮氨酸質量分數，蛋氨酸與異亮氨酸分離度高且穩(wěn)定.選用蛋氨酸作為內標物質，采用加內標物質計算樣品質量分數，排除系統(tǒng)進樣量不精確導致的結果不準確.蛋氨酸出峰時間為10.5 min，L-異亮氨酸出峰時間為14.8 min，具體譜圖見圖3.

圖3 L-異亮氨酸樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of L-isoleucine sample

采用加內標物蛋氨酸來計算結果：加標回收率為96%～98%，RSD<2%，檢測結果見表2.

表2 樣品檢測結果和回收率Table 2 Determination results and recovery of the samples

3 結 論

通過上述結果可以得出：與PITC手動衍生法相比，采用OPA自動衍生法操作簡單，引入人為誤差小，檢測耗時短，加標回收率高，檢測結果更可靠.筆者建立的OPA自動衍生高效液相色譜法可準確、高效地檢測L-異亮氨酸質量分數.

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[5] 龍輝.發(fā)酵法生產L-異亮氨酸的優(yōu)化與控制策略研究[D].天津:天津科技大學,2014.

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StudyonL-isoleucineanalysisbyhighperformanceliquidchromatography

TANG Yan1, LI Jing1, WU Tao2

(1.Meihua Holdings Group, Langfang 065001, China; 2.Meihua Biotech (Langfang) Co., Ltd., Langfang 065001, China)

L-Isoleucine has no absorption in the ultraviolet (UV) region and needs to be derivatized before determination by UV detector. The aim of this work is to compare the two pre-column derivatization methods: OPA automatic derivatization and PITC manual derivatization, and establish an efficient method for the determination of L-isoleucine content by high performance liquid chromatography. The total detection time with OPA automatic derivatization method took 15 minutes withR-value of 1, and the recoveries were from 99% to 100.1% with RSD<1%. The PITC manual derivatization took 30 min, with the recovery rate of 96% to 98% (RSD<1%). OPA automatic derivatization exhibited obvious advantages in the detection timeliness and accuracy, which can be used to efficiently detect L-isoleucine content. It has high application value in microbial fermentation, feed additives, food additives and pharmaceuticals.

L-isoleucine; HPLC; OPA; automatic derivatization; manual derivatization

2017-08-10

河北省氨基酸工程技術研究中心創(chuàng)新平臺建設資助項目(131000021)

唐 艷(1987—)，女，內蒙古通遼人，助理工程師，研究方向為氨基酸分析檢測，E-mail：1041647978@qq.com.

O657.72

A

1674-2214(2017)04-0220-04

朱小惠)