鄔松濤 周 英 何 平 黃 麗 黃貴義

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·論著·

Th22細胞及其細胞因子在斑禿患者外周血中的表達

鄔松濤1周 英2何 平3黃 麗1黃貴義4

目的： 檢測Th22及其細胞因子在斑禿患者外周血中的表達。方法： 采用流式細胞儀檢測38例斑禿患者及38例對照的Th22細胞水平，用酶聯(lián)免疫吸附檢測細胞因子IL-22、IL-17的水平。結(jié)果： 斑禿患者外周血Th22、Th17、IL-17+IL-22+CD4+、IFN-γ+IL-22+CD4+T及血清IL-22、IL-17水平均高于正常對照組(P<0.05)；重型斑禿和活動期患者高于輕型斑禿患者和穩(wěn)定期患者的表達(均P<0.05)。結(jié)論： Th22及其細胞因子在斑禿患者中表達升高。

斑禿； Th22； IL-22； IL-17

斑禿(alopecia areata，AA)屬于常見累及毛發(fā)的非瘢痕性、突發(fā)性及慢性炎癥疾病，任何年齡均可發(fā)病，但年輕人屬于多發(fā)群體。已有學者通過研究發(fā)現(xiàn)：斑禿容易復發(fā)，其發(fā)病可能與免疫功能異常、內(nèi)分泌障礙、神經(jīng)精神、遺傳等因素相關(guān)[1]。斑禿不僅加重了家庭負擔，而且還降低了患者自信心，尤其是青年男女。有學者通過動物實驗研究顯示[2]：斑禿的發(fā)病機制可能與皮損處毛囊周圍T細胞相關(guān)。為此，本文為了進一步探討Th22及其細胞因子在斑禿患者外周血中的表達及意義，特選取斑禿患者與健康體檢者進行對比研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 38例斑禿患者來自于我院2015年1月至2016年5月收治患者，所有患者均符合《中國臨床皮膚病學》斑禿診斷標準，入選前2個月內(nèi)未接受全身糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物治療，患者均知情同意，并經(jīng)過我所倫理委員會的批準。無假性禿發(fā)、先天性禿發(fā)、孕婦、嚴重心腎功能疾病、精神病者。38例患者中男20例，女18例，年齡18～56歲，平均(36.12±6.12)歲；重型斑禿為脫發(fā)面積達頭皮30%以上，重型斑禿12例， 12例全禿者表現(xiàn)為頭發(fā)全部脫落，12例全禿者有3例患者為普禿患者(除了全禿外，還表現(xiàn)為一定的胡須、眉毛、腋毛的普遍脫落)。26例局限性斑禿者表現(xiàn)為斑片狀脫發(fā)，可單發(fā)或多發(fā)。根據(jù)拔發(fā)試驗確定觀察組患者是否處于活動期，本觀察組患者中活動期組22例，患者皮損表現(xiàn)為拔發(fā)試驗陽性，穩(wěn)定期組16例，患者皮損表現(xiàn)為拔發(fā)試驗陰性，1個月內(nèi)未出現(xiàn)新的禿發(fā)區(qū)。同時選取同期我院進行體檢的健康者38名，通過查體及實驗室檢查各項指標均正常。其中男25名，女13名，年齡19～55歲，平均(37.21±6.05)歲。兩組在性別、年齡上無顯著差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2 儀器與試劑 流式細胞儀由蘇州陶邁森科學儀器有限公司生產(chǎn)；離心機、微量加樣器由上海曙誠醫(yī)療科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；青島海爾提供的-20℃冰箱、4℃冰箱、生物安全柜；山東新華醫(yī)療器械有限公司提供高壓滅菌器、10 mL肝素鈉抗凝管、吸頭、離心管等；上海博華生物科技有限公司提供的人 IL-22 ELISA 試劑盒、人 IL-17 ELISA試劑盒；中國科學院生物工程研究所提供的淋巴細胞分離液；由天津市華東試劑廠提供的多聚甲醛等。

1.3 檢測方法

1.3.1 外周血單個核細胞培養(yǎng) 取新鮮肝素鈉抗凝外周血，離心去除血漿；充分混勻；吸取4 mL淋巴細胞分離液置于10 mL離心管內(nèi)；沿著離心管側(cè)壁緩慢注入全血，最大限度不讓血液進入淋巴細胞分離液中；1700 r/min離心30 min，取出中間白膜層，將其轉(zhuǎn)移到新的離心管內(nèi)；加入PBS充分混勻，1800 r/min離心15 min洗滌后，加入培養(yǎng)液，混勻；吸取200 μL的細胞混懸液，裝入孵育板中，置于恒溫箱孵育4 h。

1.3.2 Th22的流式細胞儀檢測 4 h后取出孵育板，吸取細胞混懸液，裝入流式管內(nèi)；加入PBS吹打混勻，1200 r/min，離心5 min洗滌1遍；去除上清，加入B 50 μL破膜劑，加入1 μL IL-22、IL-17的熒光標記抗體，待混勻后，置于4℃冰箱內(nèi)保存；24 h后，采用美國BD公司生產(chǎn)的FACS Calibur 型流式細胞儀對其檢測，采用軟件Flowjo(v7.6.2)對檢測數(shù)據(jù)加以分析。

1.3.3 細胞因子的酶聯(lián)免疫吸附檢測 取足夠量的酶標包板，固定于框架上，設(shè)置三孔，即標準品孔(50 μL標準品)、待測樣本孔(加40 μL稀釋液+10 μL待測樣本)、空白對照孔(不加任何物質(zhì))；置于37℃恒溫箱保存30 min；取出酶標包板，采用吸水紙將其拍干，每一孔內(nèi)加入稀釋后的洗滌液，1 min后，甩去洗滌液；除了空白對照孔外，其余兩孔加入50 μL酶標工作液；置于37℃恒溫箱保存30 min；再洗板；每一孔內(nèi)加入50 μL顯色劑A液、50 μL顯色劑B液，均勻混合，置于37℃恒溫箱15 min；取出酶標包板，每一孔內(nèi)加入50 μL終止液，15 min內(nèi)，采用450 nm 波長對每一孔內(nèi)的吸光值加以測量。

1.4 觀察指標 觀察并記錄兩組Th22及其各細胞因子的表達水平。測定圓形脫發(fā)患者的直徑，測定橢圓形脫發(fā)患者的長軸和短軸，計算脫發(fā)面積。

2 結(jié)果

2.1 Th22+CD4+T細胞表達水平標記 見表1。觀察組與對照組在Th22、Th17的表達頻率上均有顯著差異(P<0.0001)；觀察組與對照組在IL-17+IL-22+CD4+、IFN-γ+IL-22+CD4+T的表達上均有顯著差異(P<0.0001)。與輕型斑禿患者和穩(wěn)定期患者相比，重型斑禿和活動期患者Th22、Th17、IL-17+IL-22+CD4+、IFN-γ+IL-22+CD4+T的表達進一步升高(P<0.0001)。

表1 Th22+CD4+T細胞表達水平標記 %

注：*與對照組相比，P<0.05；#與輕型斑禿相比，P<0.05；&與穩(wěn)定期患者相比，P<0.05

2.2 血清IL-22、IL-17的表達水平 見表2。觀察組患者血清中IL-22水平高于對照組，經(jīng)統(tǒng)計分析，有顯著性差異(P<0.0001)；觀察組患者血清中IL-17水平高于對照組，經(jīng)統(tǒng)計分析，有顯著性差異(P<0.0001)，與輕型斑禿患者和穩(wěn)定期患者相比，重型斑禿和活動期患者血清中IL-22和IL-17水平進一步升高(P<0.0001)。

表2 血清IL-22、IL-17、IFN-γ的表達水平比較

注：*與對照組相比，P<0.05；#與輕型斑禿相比，P<0.05；&與穩(wěn)定期患者相比，P<0.05

2.3 血清IL-22、IL-17、Th22+CD4+T細胞百分比與脫發(fā)面積的相關(guān)性 經(jīng)一元線性回歸分析可知，觀察組外周血中Th22、Th17、IL-17+IL-22+CD4+、IFN-γ+IL-22+CD4+T以及血清中IL-22和IL-17水平與脫發(fā)面積呈正相關(guān)(P<0.05)。

3 討論

Th22細胞最先于2000年由Renauld發(fā)現(xiàn)，是最新發(fā)現(xiàn)的新型輔助性T細胞亞群，其效應(yīng)與其他CD4+效應(yīng)T細胞亞群相似[3]。Th22細胞不僅可誘導其他細胞的分化，而且還參與T細胞亞群的極化過程，調(diào)節(jié)自身免疫性疾病的免疫應(yīng)答，參與皮膚病理狀態(tài)的發(fā)展。已有學者通過研究表明[4]：Th22細胞參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)生及發(fā)展，如：風濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等疾病。一般情況下，Th22細胞與其他的細胞群可相互調(diào)控，進而使得機體處于平衡狀態(tài)。若機體處于疾病狀態(tài)下，Th22細胞則可產(chǎn)生其他的細胞因子，如：IL-13、IL-22、IL-26等，其中細胞因子IL-22是最主要的細胞功能因子，該細胞因子獨立于Th1、Th2、Th17細胞亞群[5]。由于IL-22細胞功能因子包括IL-22R1鏈、IL-22R2鏈，其中IL-22R1鏈有著重要作用，對IL-22細胞的特異性有一定影響，而IL-22R2鏈則主要起到信號傳導的作用。人的皮膚、肺、腎內(nèi)都存在IL-22R1鏈，但人體內(nèi)各個組織都存在IL-22R2鏈[6]。因此，IL-22可調(diào)節(jié)特定組織細胞，尤其是上皮細胞功能，如：肝細胞、腺泡細胞、結(jié)腸上皮下肌成纖維細胞等，加以誘導進而生成趨化因子、炎癥因子及S100家族蛋白等[7,8]。

另有學者通過研究表明[9]：Th22細胞在皮膚應(yīng)變性疾病的發(fā)展中有著重要作用，如：銀屑病、紅斑狼瘡等，以上疾病患者中Th22細胞水平均高于健康者，且參與疾病的發(fā)展過程，影響疾病嚴重程度。國外學者[10]對斑禿患者的外周血CD4+CD25+Treg細胞、TGF-β1的研究較多，且取得顯著成效，但對Th22與IL-22水平在斑禿患者中的表達研究幾乎沒有。為此，本研究通過選取38例斑禿患者與38名健康體檢者進行對比研究，得到斑禿患者的Th22水平高于健康體檢者，且IL-22、IL-17水平也高于健康體檢者，與輕型斑禿患者和穩(wěn)定期患者相比，重型斑禿和活動期患者Th22、Th17、IL-17+IL-22+CD4+、IFN-γ+IL-22+CD4+T的表達血清中IL-22和IL-17水平進一步升高，且觀察組外周血中Th22、Th17、IL-17+IL-22+CD4+、IFN-γ+IL-22+CD4+T以及血清中IL-22和IL-17水平與脫發(fā)面積呈正相關(guān)，提示外周血中Th22及其細胞因子可能參與斑禿的發(fā)生、發(fā)展及預后。

綜上所述，斑禿患者外周血中Th22及其細胞因子的水平高于健康者，可作為治療及預后評價的參考依據(jù)。

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(收稿：2016-09-19 修回：2016-10-11)

Peripheral blood levels of Th22 and its associated cytokines in the patients with alopecia areata

WUSongtao1,ZHOUYing2,HEPing3,HUANGLi1,HUANGGuiyi4.

1.ChangdeInstituteofDermatologyandVenereology,Changde415000,Hunan,China;2.DepartmentofDermatovenerology,theSecondXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity,Changsha410000,China;3.DepartmentofDermatovenerology,theFirstPeople'sHospitalofChangde,Changde415000,Hunan,China;4.NanfengCountyInstituteofDermatologyandVenereology,Nanfeng344500,Jiangxi,China

HUANGGuiyi,E-mail:hxfu6688@126.com

Objective: To detect the Th22 and its associated cytokines in the patients with alopecia areata. Methods: The levels of Th22 and associated cytokines (IL-22 and IL-17) in 38 patients with alopecia areata and 38 healthy controls were detected by flow cytometry and ELISA. Results: The expression levels of Th22, Th17, IL-17+IL-22+, CD4+, IFN-gamma+IL-22+CD4+T, IL-22 and IL-17 in the parents were higher than those in controls (P<0.05) and all the cytokines mentioned above in the patients with severe alopecia areata were higher than those in the patients with mild alopecia areata (P<0.05). Conclusion: The levels of Th22 and cytokines in the patients with alopecia areata are increased.

alopecia areata; Th22; IL-22; IL-17

1常德市皮膚病性病防治所,湖南常德,415000 2中南大學湘雅二醫(yī)院皮膚性病科,湖南長沙,410000 3常德市第一人民醫(yī)院皮膚性病科,湖南常德,415000 4南豐縣皮膚病性病防治院,江西南豐,344500

黃貴義， E-mail: hxfu6688@126.com