周 萌 劉保國 顧 靜 苗國英 李小靜 劉 青

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·論著·

Raptor、Rictor和磷酸化Akt在日光性角化病、Bowen病及鱗狀細胞癌中的表達

周 萌1劉保國2顧 靜1苗國英2李小靜2劉 青2

目的： 檢測Raptor、Rictor和磷酸化Akt(p-Akt)在日光性角化病、Bowen病和鱗狀細胞癌中的表達。方法： 采用免疫組化法檢測Raptor、Rictor及p-Akt(Ser473)在20例正常皮膚、20例日光性角化病、20例Bowen病及40例鱗狀細胞癌中的表達。結果： Raptor在鱗狀細胞癌、Bowen病和日光性角化病中的陽性表達率分別為87.50%、70.00%和60.00%，均高于正常皮膚的25.00%(均P<0.05)；其中低分化鱗狀細胞癌中Raptor的陽性表達率為100%，高于高分化鱗狀細胞癌的陽性表達率75%(P<0.05)。Rictor在鱗狀細胞癌、Bowen病和日光性角化病中的陽性表達率分別為80.00%、70.00%及55.00%，均高于正常皮膚陽性表達率的20%(均P<0.05)；p-Akt(Ser473)在鱗狀細胞癌、Bowen病和日光性角化病中的陽性表達率分別為77.50%、65.00%及50.00%，而正常皮膚陽性表達率為0。鱗狀細胞癌、Bowen病和日光性角化病中Rictor的陽性表達水平和p-Akt(Ser473)的陽性表達水平均呈正相關(均P<0.05)。結論： Raptor、Rictor和p-Akt(Ser473)的高表達可能與日光性角化病、Bowen病和鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展有關。

鱗狀細胞癌； Bowen?。?日光性角化?。?Raptor； Rictor

哺乳動物雷帕霉素蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在感受營養(yǎng)信號、調(diào)節(jié)細胞生長與增殖中起著重要作用，其異?；罨c人類多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。生物體內(nèi)mTOR主要有mTORC1、mTORC2兩種復合體，雷帕霉素靶蛋白調(diào)節(jié)相關蛋白(regulatory-associated protein of mammalian target of rapamycin, Raptor)、雷帕霉素不敏感的伴侶蛋白(rapamycin insensitive companion of mTOR, Rictor)分別為mTORC1、mTORC2的關鍵蛋白，磷酸化Akt的絲氨酸473(Ser473)位點p-Akt(Ser473)可反映mTORC2的活化狀態(tài)。本研究旨在通過檢測日光性角化(Actinic Keratosis，AK)、Bowen病(Bowen's disease，BD)、鱗狀細胞癌(Squamous cell carcinoma，SCC)中Raptor、Rictor、p-Akt(Ser473)的水平，初步探討其在AK、BD、SCC發(fā)生發(fā)展中的作用與意義，為臨床早期診斷和治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2009年1月至2015年12月河北工程大學附屬醫(yī)院皮膚病理室臨床資料完整的患者的石蠟組織標本，AK 20例，男9例，女11例，年齡51～75歲，平均(66.61±7.34)歲；BD 20例，男13例，女7例，年齡51～70歲，平均(61.05±6.71)歲；SCC 40例，男22例，女18例，年齡49～75歲，平均(65.06±7.32)歲,其中高分化(I～II級)20例,低分化(III～IV級)20例?；颊咂p部位均為頭面部，無其他皮膚病或系統(tǒng)性疾病,術前未經(jīng)激光、光動力等特殊治療。所有標本均經(jīng)兩位資深病理醫(yī)生復查并明確診斷，重復病理檢查的病例僅入選首次資料。另選取河北工程大學附屬醫(yī)院整形外科手術切除的20例面部正常皮膚作為對照組，男10例，女10例，年齡25～56歲，平均(37.20±9.34)歲。SCC分級[1]：I級：未分化細胞數(shù)<25%，癌組織向真皮侵犯，不超過汗腺水平；II級：未分化細胞數(shù)25%～50%，癌組織到達真皮層；III級：未分化細胞數(shù)50%～75%，角化不明顯，胞核不典型；IV級：未分化細胞數(shù)>75%，癌細胞幾乎全為非典型鱗狀細胞。

1.2 主要試劑 兔抗人Raptor多克隆抗體(英國Abcam公司)工作濃度為1∶50；兔抗人Rictor單克隆抗體(英國Abcam公司)工作濃度為1∶500；兔抗人p-Akt(Ser473)單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology 公司)工作濃度為1∶50；PV-9001試劑盒、DAB酶底物試劑盒及PBS購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法 石蠟標本4 μm連續(xù)切片，采用免疫組化聚合物酶標二抗法，行pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液92℃水浴15分鐘修復抗原，具體步驟參照試劑盒說明書進行，DAB顯色，蘇木精復染。正常皮膚作為對照，PBS代替一抗作為空白對照。實驗分組：正常皮膚組、AK組、BD組、SCC組。

1.4 結果判定標準 光鏡下觀察染色陽性物質(zhì)為黃色、棕黃色或者棕褐色顆粒狀物質(zhì)。計數(shù)方法:每張切片均隨機選取10個高倍鏡視野(×400),計算出陽性細胞的平均百分率(陽性細胞數(shù)/全視野細胞數(shù))作為每例標本陽性表達率的判定依據(jù)。結果判定采用二級計分法,按陽性細胞的百分比分級:<25%為0分,25%～50%為1分,51%～75%為2分,>75%為3分；按染色強度分級:無色為0分,淺黃色為1分,黃色或黃褐色為2分,棕褐色或褐色為3分。兩級計分相加計算總得分,可分為四個等級:0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+),4～5分為中度陽性(++),6分為強陽性(+++),計算陽性表達率時,總得分≥2判定為陽性。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，陽性率之間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。Spearman秩相關分析比較Rictor和p-Akt(Ser473)之間的相關性，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Raptor在SCC、BD、AK和正常皮膚中的表達 Raptor在細胞中的陽性表達主要為胞質(zhì)染色。35例(87.50%)SCC中Raptor呈陽性表達，且染色強度多為中度陽性或強陽性(圖1a)；14例(70.00%)BD為陽性表達，多為弱陽性及中度陽性(圖1b)；12例(60.00%)AK為陽性表達，多呈弱陽性(圖1c)，正常皮膚中僅5例(25.00%)陽性表達，呈弱陽性(圖1d)。SCC中Raptor陽性表達率高于AK、正常皮膚(Fisher確切概率法P<0.05；χ2=23.438，P<0.05)；BD、AK中Raptor陽性表達率均高于正常皮膚，差異均有統(tǒng)計學意義(χ12=8.120，P<0.05；χ22=5.013，P<0.05)；低分化SCC高于高分化SCC，差異有統(tǒng)計學意義(Fisher確切概率法P<0.05)；SCC與BD、BD與AK相比，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 Raptor在日光性角化、Bowen病、鱗狀細胞癌和正常皮膚中的表達 例

注:a與正常皮膚比較，P<0.05;b與日光性角化比較，P<0.05;c與高分化鱗狀細胞癌比較，P<0.05

2.2 Rictor在SCC、BD、AK和正常皮膚中的表達 Rictor在細胞中的陽性表達主要為胞質(zhì)染色。32例(80.00%)SCC中Rictor呈陽性表達，其中癌巢中央陽性表達較少，邊緣表達較多(圖2a)；14例(70.00%)BD為陽性表達，多呈中度陽性或弱陽性(圖2b)；11例(55.00%)AK為陽性表達，多呈中度陽性表達(圖2c)；正常皮膚中僅4例(20.00%)呈弱陽性表達(圖2d)。SCC中Rictor陽性表達率高于AK、正常皮膚，差異均有統(tǒng)計學意義(χ12=4.104,P<0.05;χ22=20.000,P<0.05);BD、AK中Rictor陽性表達率均高于正常皮膚，差異均有統(tǒng)計學意義(χ12=10.101,P<0.05;χ22=5.227,P<0.05)；低分化SCC與高分化SCC、SCC與BD、BD與AK相比，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 Rictor在日光性角化、Bowen病、鱗狀細胞癌和正常皮膚中的表達 例

注:a與正常皮膚相比，P<0.05;b與日光性角化相比，P<0.05

2.3 p-Akt(Ser473)在SCC、BD、AK和正常皮膚中的表達 p-Akt(Ser473)在細胞中的陽性表達主要為胞質(zhì)染色。31例(77.50%)SCC中p-Akt(Ser473)呈陽性表達(圖3a)；13例(65.00%)BD為陽性表達(圖3b)；10例AK(50.00%)為陽性表達，呈中度陽性或弱陽性表達(圖3c)；正常皮膚中無陽性表達，僅在基底層呈極低的局灶性弱表達(圖3d)。SCC中p-Akt(Ser473)陽性表達率高于AK、正常皮膚，差異均有統(tǒng)計學意義(χ12=4.660,P<0.05；χ22=32.069,P<0.05)；BD、AK中p-Akt(Ser473)的陽性表達率均高于正常皮膚(χ12=19.259,P<0.05;χ22=13.333,P<0.05)；p-Akt(Ser473)在低分化SCC與高分化SCC、SCC與BD、BD與AK相比，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表3。

表3 p-Akt(Ser473)在日光性角化、Bowen病、鱗狀細胞癌和正常皮膚中的表達 例

注:a與正常皮膚相比，P<0.05;b與日光性角化相比，P<0.05

2.4 Rictor與p-Akt的相關性分析 經(jīng)Spearman相關分析表明，AK、BD、SCC中Rictor的陽性表達水平和p-Akt(Ser473)的陽性表達水平均呈正相關(r=0.503,P<0.05;r=0.663,P<0.05;r=0.629,P<0.05)。

圖1 Raptor的表達(免疫組化，×200):1a鱗狀細胞癌；1b Bowen?。?c日光性角化；1d正常皮膚 圖2 Rictor的表達(免疫組化，×200):2a鱗狀細胞癌；2b Bowen??；2c日光性角化；2d正常皮膚 圖3 p-Akt(Ser473)的表達(免疫組化，×200):3a鱗狀細胞癌；3b Bowen病；3c日光性角化；3d正常皮膚

3 討論

SCC系起源于表皮或附屬器角質(zhì)形成細胞的一種惡性腫瘤,發(fā)病率在皮膚惡性腫瘤中位居第二，具有侵襲性較高，對組織破壞性較大等特點[1]。BD是一種表皮內(nèi)鱗狀細胞癌，又稱原位鱗狀細胞癌，約3%～5%，也有認為高達20%～30%患者可演變?yōu)榍忠u癌[1]。AK是長期日光暴露所引起的一種癌前期病變，約0.01%～0.3%可轉(zhuǎn)變?yōu)镾CC[1]。

mTOR被認為參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展,并且可能成為抗癌藥物發(fā)展的重要靶點[2]。其復合體mTORC1、mTORC2的組織結構不同，功能也有所差別。mTORC1可被雷帕霉素所抑制，其主要通過磷酸化下游靶蛋白S6激酶1(70 kDa ribosomal protein S6 kinase，S6K1/p70S6K)及真核啟動因子4E結合蛋白1(eukaryotic initiation factor-4E-binding protein 1，4EBP1)來調(diào)節(jié)下游蛋白質(zhì)翻譯。mTORC1對蛋白質(zhì)合成的影響被認為與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關，其能夠感受生長因子、能量狀態(tài)、氨基酸等細胞內(nèi)外的多種因素，從而調(diào)控細胞合成和分解代謝過程,它的異常激活將促進一系列與細胞生長、增殖和分化相關蛋白的合成增加,導致腫瘤的發(fā)生[3,4]。除此之外，mTORC1介導的脂質(zhì)合成和自噬也可能參與了腫瘤形成[3]。本研究結果顯示Raptor在正常皮膚細胞質(zhì)中少量表達，在AK、BD中表達逐漸增強，在SCC中，尤其是低分化SCC細胞質(zhì)中則高表達，提示Raptor不僅在AK、BD、SCC中存在異?；罨?同時也可能與腫瘤的惡性程度及分化程度相關，此結果與張洪旺等[5]在膠質(zhì)瘤中的研究一致。這為mTORC1在AK、BD、SCC中的活化提供了新的證據(jù)。

mTOR另一復合體mTORC2則通過作用于Akt，PKCα和SGK1等來調(diào)控多項生命活動，如胚胎發(fā)育、細胞骨架重建、細胞遷移、蛋白質(zhì)翻譯和修飾等[3,6]。Guertin[7]研究發(fā)現(xiàn)在PTEN缺陷的小鼠中,Rictor是前列腺癌細胞和實體瘤生長所必須的。mTORC2可能參與了腫瘤細胞運動和轉(zhuǎn)移，其影響膠質(zhì)瘤細胞的增殖及侵襲潛能[8]。通過沉默Rictor的表達降低mTORC2的活性能夠有效抑制卵巢癌細胞、乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移[9,10]。Carr[11]等認為， Rictor對正常表皮增殖并不是必須的，但其與皮膚腫瘤的生成與發(fā)展密切相關，抑制Rictor可延緩皮膚腫瘤的發(fā)展。本文研究顯示Rictor在AK、BD、SCC中的表達均高于正常皮膚，說明Rictor的表達上調(diào)參與了AK、BD、SCC的發(fā)生發(fā)展，其在SCC癌巢邊緣的表達強于中央部位，由于癌巢周邊的腫瘤細胞容易侵襲和轉(zhuǎn)移，提示Rictor可能參與SCC的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。Akt是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，當其蘇氨酸-473位點被磷酸化時可被部分激活。p-Akt(Ser473)可反映mTORC2活化狀態(tài)，其可通過滅活多種凋亡效應分子、調(diào)控細胞周期、激活端粒酶活性、促進血管生成和遷移相關程序等途徑而促進腫瘤的生長和侵襲[12]。本文結果顯示p-Akt(Ser473)在SCC、BD、AK中的表達水平均高于正常皮膚，SCC中表達水平又高于AK，這與連昕等[13]報道相符。p-Akt(Ser473)的不同程度表達水平與Rictor的表達水平呈正相關，表明在AK、BD、SCC中mTORC2參與了Akt的Ser473位點活化。

以上結果表明，Raptor、Rictor和p-Akt(Ser473)共同參與了AK、BD、SCC的發(fā)生和發(fā)展，所起的作用可能不同，其具體機制值得進一步的研究。國內(nèi)學者發(fā)現(xiàn)作為mTORC1特異性抑制劑雷帕霉素可以抑制皮膚鱗癌細胞A431、Colo-16的增殖[14,15]，使細胞增殖停止在G1期，發(fā)揮抗腫瘤作用。本實驗采用免疫組化方法證實了Raptor在SCC中高表達，進一步表明雷帕霉素可能有治療SCC的作用。實驗結果同時顯示Rictor、p-Akt(Ser473)在SCC中呈高表達狀態(tài)，且兩者具有正相關性，提示抑制mTORC2可能對SCC也有一定的殺傷作用，由于mTORC2結構的復雜性，單獨mTORC2抑制劑的發(fā)現(xiàn)還存在一定的困難性[16]，但mTORC1/2共同的抑制劑目前已應用于乳腺癌、白血病的體外試驗中[10,17]，且較雷帕霉素顯示出更強的殺傷腫瘤細胞作用，其在SCC中是否也有類似治療效果還有待更一步的實驗研究。

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(收稿：2016-10-07 修回：2016-10-10)

Expression of Raptor, Rictor and p-Akt in actinic keratosis, Bowen's disease and squamous cell carcinoma

ZHOUMeng1,LIUBaoguo2,GUJing1,MIAOGuoying2,LIXiaojing2,LIUQing2.

1.PostgraduateSchool,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China; 2.DepartmentofDermatology,theHospitalAffiliatedtoHebeiEngineeringUniversity,Handan056002,China

LIUBaoguo,E-mail:lbg66@163.com

Objective:To detect the expression of Raptor, Rictor and p-Akt in the lesions of actinic keratosis (AK), Bowen's disease (BD) and squamous cell carcinoma (SCC). Methods: Immunohistochemistry was used to detect the expression of Raptor, Rictor, p-Akt (Ser473) in the tissue samples from the patients with AK, BD, SCC and normal human skin. Results: The positivity rates of Raptor in SCC, BD and AK were 87.50%, 70.00% and 60.00%, which was significantly higher than that in normal skin (Ps<0.05). The positivity rate was 100% in poorly differentiated squamous cell carcinoma and 75% in well differentiated squamous cell carcinomas, with a significant difference (P<0.05). The positivity rates of Rictor in SCC, BD and AK were 80.00%, 70.00% and 55.00%, which was significantly higher than that in normal skin (P<0.05). The positivity rates of p-Akt (Ser473) in SCC, BD and AK were 77.50%, 65.00% and 50.00%, while there was no positive staining in normal skin. There was a positive correlation between the expression level of Rictor and p-Akt (Ser473) in SCC, BD and AK (P<0.05). Conclusion: The high expression of Raptor, Rictor and p-Akt (Ser473) may play a key role in the occurrence and development of AK, BD and SCC.

Squamous cell carcinoma; Bowen's disease; actinic keratosis; Raptor; Rictor

河北省政府資助臨床優(yōu)秀人才培訓項目(編號：361037) 邯鄲市科技技術研究項目(編號：1523108076)

1承德醫(yī)學院研究生院，河北承德,067000 2河北工程大學附屬醫(yī)院皮膚科，河北邯鄲,056002

劉保國，E-mail：lbg66@163.com