康亞龍, 孫文慶,劉建國(guó),蔣桂英**

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PLFA方法研究連作對(duì)加工番茄根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響*

康亞龍1,2, 孫文慶1,劉建國(guó)1,蔣桂英1**

(1. 石河子大學(xué)新疆兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 石河子 832003; 2. 巴州農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心 庫(kù)爾勒 841000)

通過在石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站開展加工番茄連作定點(diǎn)微區(qū)試驗(yàn), 采用氯仿熏蒸和磷脂脂肪酸(PLFA)法相結(jié)合, 研究了不同連作處理(種植1 a、連作3 a、5 a和7 a)對(duì)新疆加工番茄花果期和成熟期根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及土壤微生物量的影響。結(jié)果表明, 連作導(dǎo)致土壤微生物量碳(SMBC)、微生物量氮(SMBN)和微生物熵(MB)下降, SMBC/SMBN升高, 而微生物量磷(SMBP)隨連作年限和生育期的變化而不同。連作顯著增加了真菌PLFAs含量, 降低了細(xì)菌PLFAs含量、土壤PLFAs總量及細(xì)菌/真菌PLFAs的比值, 而放線菌PLFAs含量變化無規(guī)律。連作7 a時(shí), 成熟期的細(xì)菌PLFAs含量、土壤PLFAs總量較對(duì)照分別減少62.9%、50.3%(<0.05), 而真菌PLFAs含量較對(duì)照升高60.2%(<0.05)。從多樣性指數(shù)分析看, Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、Brillouin指數(shù)和Pielou指數(shù)均隨連作年限的延長(zhǎng)呈先升后降的變化, 其中連作3 a時(shí)各項(xiàng)指數(shù)最大, 連作7 a時(shí)最小, 表明在本試驗(yàn)?zāi)晗薹秶鷥?nèi), 連作使得微生物群落多樣性與均勻程度皆出現(xiàn)了一定程度的降低。相關(guān)性分析表明, 土壤微生物各類群PLFAs量、微生物量及土壤肥力之間存在相關(guān)性, 說明土壤微生物量與土壤肥沃程度相關(guān), 可作為評(píng)價(jià)土壤肥力的生物學(xué)指標(biāo)?？梢? 加工番茄連作改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu), 降低了土壤微生物量, 最終在根際土壤微生態(tài)系統(tǒng)和環(huán)境因子等因素的綜合作用下產(chǎn)生連作障礙。

加工番茄; 連作; 土壤微生物量; 微生物群落結(jié)構(gòu); 磷脂脂肪酸分析法

作物長(zhǎng)期連作可導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化、土壤生物活性下降, 并最終表現(xiàn)為土壤養(yǎng)分失衡等系列問題, 而引起連作障礙的主要原因是土壤微生物群落發(fā)生了變化[1-2]。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及種群多樣性在土壤質(zhì)量演變過程中起關(guān)鍵作用, 是土壤生態(tài)系統(tǒng)中預(yù)警土壤質(zhì)量受損程度或恢復(fù)潛力的敏感指標(biāo)[3]。新疆加工番茄(Mill.)已形成區(qū)域化布局、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的局面, 連作現(xiàn)象普遍, 連作障礙問題已成為限制加工番茄穩(wěn)產(chǎn)和高產(chǎn)的主要原因[4]。因此, 開展加工番茄連作對(duì)根際土壤微生物群落的研究, 明確改善土壤健康狀況的方向, 可促進(jìn)新疆加工番茄產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

有關(guān)加工番茄連作障礙成因的研究, 一方面以作物根際與土壤之間的微生態(tài)學(xué)較多。結(jié)果表明: 連作使土壤質(zhì)量惡化, pH升高, 土壤養(yǎng)分失衡及次生鹽漬化, 作物殘根腐解及根系分泌的自毒物質(zhì)累積, 土壤酶活性下降, 土壤由“細(xì)菌性”向“真菌型”轉(zhuǎn)化, 微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變等[4-5]; 另一方面, 缺乏從土壤微生物量、微生物熵等角度分析加工番茄連作障礙問題。但是前人在研究黃瓜(L)、棉花(spp.)等作物連作時(shí)發(fā)現(xiàn)土壤微生物量碳(SMBC)、微生物量氮(SMBN)、微生物量磷(SMBP)及微生物熵受連作年限的影響呈下降趨勢(shì)[3,6]。與傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法相比, 磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acids, PLFAs)法可以通過特定菌群的PLFA數(shù)量變化反映出原位土壤真菌、細(xì)菌活體生物量與菌群結(jié)構(gòu), 能夠提供更多的微生物類群生物量信息, 技術(shù)成熟、分析速度快、成本低、結(jié)果穩(wěn)定可靠, 近年來在微生物生態(tài)學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用[7]。前人利用PLFA分析法研究大豆(L. Merill)[8]、地黃(Libosch)[9]及桉樹(Smith)[10]連作時(shí)發(fā)現(xiàn)土壤PLFAs總量顯著降低, 真菌和細(xì)菌 PLFAs比例顯著增加, 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)明顯發(fā)生變化。

目前, 有關(guān)加工番茄連作障礙的研究已從土壤養(yǎng)分失衡、生物學(xué)環(huán)境變化及植株的化感作用等不同角度進(jìn)行了報(bào)道[4-5,11], 并且利用DGGE方法[2]和稀釋平板計(jì)數(shù)法[5]研究了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的變化。但是一方面土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成相當(dāng)復(fù)雜, 數(shù)量巨大, 采用單一的傳統(tǒng)培養(yǎng)法或分子生物學(xué)技術(shù)取得的土壤微生物信息并不能全面地反映自然狀況下的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化, 這是因?yàn)橥寥乐锌膳囵B(yǎng)的微生物僅占環(huán)境微生物總數(shù)的0.1%~1%[12], 另一方面很難定量地分析土壤微生物隨連作年限的演變規(guī)律。因此, 本研究采用磷脂脂肪酸分析法(PLFAs)對(duì)加工番茄種植1 a、連作3 a、5 a和7 a的定點(diǎn)微區(qū)根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量分析, 同時(shí)結(jié)合氯仿熏蒸法測(cè)定土壤微生物量及微生物熵隨連作年限的變化規(guī)律, 旨在揭示加工番茄在長(zhǎng)期種植過程中根際微生物種群變化規(guī)律, 闡明加工番茄連作障礙形成機(jī)理, 研究結(jié)果為改善土壤質(zhì)量、提高加工番茄產(chǎn)量和品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)在新疆石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站(85°59′50″E, 44°18′58″N)的加工番茄連作定點(diǎn)微區(qū)試驗(yàn)田進(jìn)行。試驗(yàn)地點(diǎn)海拔437~450 m, 年日照時(shí)數(shù)2 721~2 818 h, 無霜期168~171 d, ≥10 ℃年活動(dòng)積溫3 570~3 729 ℃, 年平均降水量208 mm, 平均蒸發(fā)量1 660 mm。屬于典型的大陸性氣候, 光照充足但干燥少雨, 晝夜溫差大, 適合灌溉農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。土壤類型為典型灌耕灰漠土(Calcaric Fluvisal), 土壤質(zhì)地為砂壤土。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2007年4月在石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)站選取3 a以上休閑空地, 長(zhǎng)12 m, 寬5 m, 南北走向, 總面積為60 m2。將該空地劃分成3個(gè)小區(qū)做3次重復(fù), 每區(qū)面積均20 m2。同時(shí), 開始種植加工番茄, 番茄主栽品種‘里格爾87–5’, 種植密度為4.8萬(wàn)株?hm-2。采用機(jī)采模式, 一膜兩行直播種植, 寬窄行配置80 cm+ 40 cm, 株距35 cm。7~8 d滴水1次, 共計(jì)10次, 生育期內(nèi)滴水5 250 m3·hm-2。隨水滴肥, 生育期內(nèi)滴施純氮(N) 207 kg·hm-2, 磷(P2O5) 84.86 kg·hm-2, 鉀(K2O) 56.18 kg·hm-2。其他管理同大田生產(chǎn)。自2007年10月到2014年10月加工番茄收獲, 連續(xù)分別形成了種植1 a (CK)、連作1 a、2 a、3 a、4 a、5 a、6 a、7 a的7個(gè)加工番茄連作處理。取CK (2007年)、連作3 a (2010年)、5 a (2012年) 和7 a (2014年) 4個(gè)加工番茄根際土壤, 分析土壤微生物量及群落多樣性的變化。

1.3 供試土壤采集及預(yù)處理

于2007年、2010年、2012年和2014年加工番茄花果期(FS)和成熟期(MS), 在各小區(qū)按照5點(diǎn)法分別選取長(zhǎng)勢(shì)均勻的加工番茄植株15株, 然后輕微抖動(dòng)根系, 收集緊附于根系不易脫落的土壤, 即為根際土[13], 充分混勻。一份土壤采集后立即過1 mm篩并存放于 4 ℃冰箱保鮮, 用于土壤微生物量碳、氮、磷含量測(cè)定; 另一份土壤置于無菌袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室, 立即過2 mm土篩后保存于-80 ℃冰箱用于土壤磷脂脂肪酸(PLFAs)含量的分析。加工番茄不同連作地土壤的基本理化性質(zhì)見表1。

表1 不同連作年限加工番茄土壤的理化性質(zhì)

表中不同小寫字母表示不同連作處理間差異顯著(<0.05)。Different lowercase letters within the same column indicate significant differences between different treatments (i.e., years of continuous cropping) at< 0.05.

1.4 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.4.1 微生物量及微生物熵的測(cè)定

土壤微生物量和微生物熵的測(cè)定: 采用氯仿滅菌-K2SO4提取法測(cè)定土壤微生物量碳、氮的含量[14], 土壤微生物量磷的測(cè)定采用氯仿滅菌-NaHCO3提取法[15]。微生物熵(MB)按照Anderson等[16]的方法計(jì)算, 即微生物量碳與有機(jī)碳的比值。

1.4.2 土壤磷脂脂肪酸(PLFAs)含量的測(cè)定

參照修正的Bligh-Dyer[17]方法測(cè)定土壤磷脂脂肪酸(PLFAs)含量, 分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。PLFAs的鑒定采用美國(guó)MIDI公司(MIDI, Newark, Delaware, USA)開發(fā)的基于細(xì)菌細(xì)胞脂肪酸成分鑒定的Sherlock MIS 4.5系統(tǒng)(Sherlock Microbial Identification System)。

1.4.3 微生物群落多樣性指數(shù)分析

參照Garland和Mills[18]方法, 利用Shannon- Wiener多樣性指數(shù)、Brillouin多樣性指數(shù)、Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)分析加工番茄連作土壤微生物群落多樣性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、相關(guān)分析、方差分析、主成分分析(principal components analysis, PCA)及聚類分析(cluster analysis), 采用Duncan法進(jìn)行處理間差異的多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 加工番茄連作對(duì)土壤微生物量碳、氮和磷的影響

連作3 a內(nèi), 成熟期的土壤微生物量碳(SMBC)、土壤微生物量氮(SMBN)、土壤微生物量磷(SMBP)及微生物熵(MB)均大于花果期,連作5 a年后則相反(表2)。連作3 a時(shí), 成熟期SMBC、SMBN、SMBP和MB分別是花果期的1.11倍、1.18倍、1.81倍和1.11倍, 差異極顯著(0.01)。

加工番茄連作導(dǎo)致SMBC、SMBN和MB下降, SMBC/SMBN升高(表2)。連作7 a時(shí), 成熟期的SMBC、SMBN和MB較對(duì)照分別降低達(dá)52.3%、78.8%和48.2%, 而SMBC/SMBN是對(duì)照的2.25倍, 差異極顯著(0.01)?；ü? SMBP隨連作年限的延長(zhǎng)呈增大趨勢(shì); 成熟期, SMBP隨連作年限的延長(zhǎng)呈先升后降趨勢(shì)。其中, 連作7 a時(shí), SMBP含量較對(duì)照降低54.9%, 且花果期SMBP含量是成熟期的4.77倍, 差異極顯著(0.01)。

表2 不同連作年限加工番茄不同生育期根際土壤微生物量的變化

同列數(shù)值后不同大、小寫字母分別表示不同連作處理間差異顯著(<0.05)和極顯著(<0.01)。SMBC, SMBN, SMBP andMB mean soil microbial biomass C, soil microbial biomass N, soil microbial biomass P, and soil microbial biomass entropy, respectively. Different lowercase and capital letters within the same column indicate significant differences between treatments of continuous cropping years at< 0.05 and< 0.01, respectively.

2.2 不同連作年限加工番茄根際土壤微生物的磷脂脂肪酸標(biāo)記

本試驗(yàn)在供試土壤樣品中共檢測(cè)出16種PLFAs (圖1)。其中, 有14種標(biāo)記細(xì)菌磷脂脂肪酸, 其中標(biāo)記G+細(xì)菌的PLFA有6種, 分別是12Me13:0、12Me14:0、14Me15:0、14Me16:0、i16Me17:0、17Me18:0; 標(biāo)記G-細(xì)菌的PLFA有1種, 為16:1ω11c; 標(biāo)記好氧細(xì)菌的PLFA有2種, 分別是16:1ω7、16:1ω9c; 標(biāo)記其余細(xì)菌的PLFA有5種, 依次是14:0、15:0、16:0、17:0、20:0。此外, 放線菌有1種, 為10Me18:0; 真菌有1種, 為18:1ω9c。

加工番茄根際土壤PLFAs總量隨生育期和連作年限的變化而變化(圖1)?；ü? 連作3 a時(shí)土壤PLFAs標(biāo)記含量最大的是14Me15:0, 其次是16:1ω9c; 成熟期, 連作7 a時(shí)土壤PLFAs標(biāo)記含量最大的是18:1ω9c。整體上看, 不同連作年限下, 土壤中PLFAs標(biāo)記含量最大的有14Me15:0、16:0、i16Me17:0、18:1ω9c。

2.3 連作對(duì)加工番茄土壤PLFA總量的影響

加工番茄根際土壤各類群微生物PLFAs總量隨連作年限的延長(zhǎng)呈顯著下降趨勢(shì), 但隨著生育期的變化則呈先升后降的規(guī)律(表3)。連作7 a時(shí), 花果期和成熟期的土壤微生物PLFAs總量較對(duì)照分別減少了41.8%、50.3%, 差異極顯著(<0.01)。土壤微生物PLFAs總量在連作5 a內(nèi)的變化為成熟期>花果期, 而連作7 a時(shí)則相反(表3)。其中, 連作7 a時(shí), 成熟期土壤微生物PLFAs總量較花果期時(shí)下降達(dá)10%。可見, 加工番茄根際土壤PLFAs總量因生育期和連作年限而表現(xiàn)出較大差異。

2.4 連作對(duì)加工番茄土壤主要微生物(PLFAs)含量的影響

根據(jù)不同PLFA標(biāo)記類型可大致將土壤微生物類群分為細(xì)菌、真菌、放線菌和原生動(dòng)物等4大類[19]。由表3可知, 不同連作年限下土壤微生物的類群包括細(xì)菌、放線菌和真菌, 未檢測(cè)到原生動(dòng)物?；ü诤统墒炱? 連作土壤中微生物PLFAs含量的高低順序均為細(xì)菌>真菌>放線菌, 其中細(xì)菌磷脂脂肪酸占微生物PLFAs總量的69%~93%, 真菌磷脂脂肪酸占微生物PLFAs總量的5%~28%, 放線菌磷脂脂肪酸占微生物PLFAs總量的2%~26%。

i、Me、cy和a依次代表異、甲基分枝、環(huán)丙基和反異脂肪酸; ω、t和c依次代表脂肪端、反式和順式空間構(gòu)造。i, Me, cy and a respectively mean iso, methyl branching, cyclopropyl and anteiso fatty acids. ω, t and c respectively mean the aliphatic end, trans and cis configuration.

表3 加工番茄不同生育期不同連作年限根際土壤微生物類型的PLFA含量的變化

同列數(shù)值后不同大、小寫字母分別表示不同連作處理間差異顯著(<0.05)和極顯著(<0.01)。Different lowercase and capital letters within the same column indicate significant differences between treatments of continuous cropping years at< 0.05 and< 0.01, respectively.

加工番茄連作導(dǎo)致細(xì)菌PLFAs含量顯著下降, 真菌PLFAs含量顯著升高(表3)。連作7 a時(shí), 成熟期的細(xì)菌PLFAs含量較對(duì)照降低62.9%, 而真菌PLFAs含量較對(duì)照升高151.4%, 差異顯著(<0.05)。連作3 a內(nèi), 細(xì)菌PLFAs含量變化為成熟期>花果期, 連作5 a后則相反。相同連作年限下, 真菌PLFAs含量表現(xiàn)為成熟期>花果期, 與放線菌PLFAs含量的變化相反(表3)。成熟期, 連作3 a時(shí)放線菌PLFAs含量達(dá)到最大值, 是對(duì)照的1.29倍, 差異極顯著(<0.01)。

2.5 連作對(duì)加工番茄土壤微生物(PLFAs)含量之間比值的影響

從革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌與陰性細(xì)菌PLFAs含量的比值(G+/G-)看, 加工番茄花果期其比值隨連作年限的增加呈先升后降的變化, 與成熟期其比值變化相反(圖2)?；ü? 連作3 a時(shí)G+/G-值最大為12.65, 是對(duì)照的1.6倍, 差異極顯著(<0.01)。成熟期, 連作7 a時(shí)G+/G-值達(dá)到最大值22.38, 是對(duì)照的3.3倍, 差異極顯著(<0.01)。

細(xì)菌與真菌的PLFAs比值(用B/F表示)是表征土壤生態(tài)系統(tǒng)緩沖能力的重要指標(biāo)[20]。加工番茄連作導(dǎo)致B/F值顯著降低, 且B/F值在生育期的大小順序?yàn)榛ü?成熟期(圖2)。連作7 a時(shí), 花果期和成熟期的B/F值較對(duì)照分別降低71.1%、93.5%, 差異極顯著(<0.01)?？梢? 加工番茄在成熟期時(shí)土壤生態(tài)系統(tǒng)應(yīng)對(duì)連作的緩沖能力最弱。

不同大、小寫字母分別表示不同連作處理間差異顯著(<0.05)和極顯著(<0.01)。Different lowercase and capital letters indicate significant differences between treatments of continuous cropping years at< 0.05 and< 0.01, respectively.

2.6 加工番茄連作土壤中微生物磷脂脂肪酸的主成分分析

由圖3可知, PC1解釋了連作年限64.92%的變異, PC2解釋了連作年限23.55%的變異?？梢? PC1和PC2基本上能把連作處理下根際土壤微生物群落PLFA區(qū)分開。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn), 種植1 a(CK)的磷脂脂肪酸投影點(diǎn)在PCA圖中的分布最集中, 相距最近, 說明花果期和成熟期的根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)非常相似。連作3 a后土壤微生物PLFAs投影點(diǎn)在主成分分析圖中的分布較分散, 相距較遠(yuǎn), 說明連作導(dǎo)致加工番茄不同生育期根際土壤微生物群落組成差異很大。

對(duì)16種磷脂脂肪酸進(jìn)行主成分分析(圖4), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)PC1和PC2可以解釋總變異的82.51%, 其中PC1占58.46%, PC2占24.05%。采用方差極大正交旋轉(zhuǎn)法進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn), PC1的代表因子有5個(gè)變量, 分別是12Me14:0、17Me18:0、14Me15:0、16:1ω7、12Me13:0(載荷值>0.800); PC2的代表因子有6個(gè)變量, 分別是20:0、14:0、16:1ω9c、i16Me17:0、10Me18:0、17:0(載荷值>0.800)。連作導(dǎo)致標(biāo)記細(xì)菌的特有磷脂脂肪酸14Me15:0、16:0含量減少, 標(biāo)記真菌的特征磷脂脂肪酸18:1ω9c含量增加?？梢? 加工番茄連作土壤有真菌化的趨勢(shì)。

2.7 加工番茄連作土壤中微生物群落磷脂脂肪酸標(biāo)記的聚類分析

當(dāng)歐氏距離為10時(shí), 各處理的土壤PLFAs生物標(biāo)記均可分成3個(gè)大的類群(圖5)。類型Ⅰ包括的土壤PLFAs生物標(biāo)記有12Me13:0、14:0、12Me14:0、15:0、16:1ω7、16:1ω9c、16:1ω11c、14Me16:0、17:0、i16Me17:0、10Me18:0、17Me18:0、20:0, 其特征為在加工番茄連作7 a內(nèi)分布不均勻且分布量偏低; 類型Ⅱ包括PLFAs生物標(biāo)記是14Me15:0、18:1ω9c, 其表現(xiàn)為完全分布且分布量較高; 只有16:0屬于類型Ⅲ, 其特征是完全分布且分布量最高?？梢? 在試驗(yàn)的年限內(nèi), 加工番茄連作雖然未明顯改變土壤微生物PLFAs不同標(biāo)記物的聚類優(yōu)勢(shì)類群, 但是顯著地導(dǎo)致優(yōu)勢(shì)類群的分布量下降。

a: 12Me13:0; b: 14:0; c: 12Me14:0; d: 15:0; y: 14Me15:0; f: 16:0; g: 16:1ω7; h: 16:1ω9c; i: 16:1ω11c; j: 14Me16:0; k: 17:0; l: i16Me17:0; m: 18:1ω9c; n: 10Me18:0; o: 17Me18:0; p: 20:0.

2.8 加工番茄連作根際土壤微生物群落多樣性分析

Shannon-Wiener指數(shù)、Brillouin指數(shù)和Simpson指數(shù)均隨加工番茄連作年限的延長(zhǎng)呈先升后降的變化(表4), 其中連作3 a時(shí)其根際土壤微生物各項(xiàng)指數(shù)最大, 連作7 a最小, 說明連作3 a內(nèi)有利于根際土壤微生物種類的增多和群落豐富度的提高, 但當(dāng)連作超過3 a時(shí)土壤微生物多樣性出現(xiàn)一定程度的下降, 微生物個(gè)體數(shù)量在減少。

表4 不同連作年限加工番茄不同生育期根際土壤微生物群落多樣性指數(shù)

同列數(shù)值后不同小寫字母表示不同連作處理間差異顯著(<0.05)。Different lowercase letters within the same column indicate significant differences between treatments of continuous cropping years at< 0.05.

從加工番茄生育期看, Shannon-Wiener指數(shù)和Brillouin指數(shù)的變化呈花果期>成熟期, 而Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)則相反。這可能是在新疆, 加工番茄收獲后進(jìn)入漫長(zhǎng)寒冷的冬季, 土壤中殘存的根茬、枯葉和殘枝等幾乎不分解, 到翌年夏初時(shí)節(jié), 地溫快速回升, 微生物的活動(dòng)趨于旺盛, 加速了殘根枯葉的腐解, 同時(shí)植株生長(zhǎng)進(jìn)入旺季, 根系分泌物增多, 增加了土壤中可供微生物利用的碳源、氮源, 刺激和加速微生物的代謝活動(dòng), 提高了土壤微生物多樣性, 也使得某些微生物類群成為優(yōu)勢(shì)菌群; 然而, 當(dāng)加工番茄處于成熟期時(shí), 氣候依然較熱, 地溫變化不大, 但根系分泌物減少在一定程度上造成微生物多樣性有所降低。

Pielou均勻度指數(shù)表示生物物種在群落中的相對(duì)密度, 均勻度指數(shù)高, 相對(duì)密度大[20]。由表4可知, 均勻度指數(shù)在連作3 a時(shí)最大, 連作7 a最小, 但各處理間差異不顯著, 說明連作超過3 a后導(dǎo)致均勻度指數(shù)出現(xiàn)一定程度的下降, 但土壤微生物類群在群落中的相對(duì)密度并沒有明顯改變。

2.9 加工番茄連作土壤理化性質(zhì)與土壤生物活性的相關(guān)性

2.9.1 土壤理化性狀與土壤微生物量的相關(guān)性

由相關(guān)性可知, pH對(duì)土壤微生物量有顯著抑制作用(<0.05), 不利于微生物的繁殖與生存。土壤主要養(yǎng)分與微生物量、MB呈顯著或極顯著正相關(guān)。細(xì)菌PLFAs及土壤總PLFAs與土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、速效鉀含量存在極顯著正相關(guān)(<0.01); 真菌PLFAs與土壤主要養(yǎng)分極顯著負(fù)相關(guān)(<0.01); 全鉀、速效磷含量與放線菌PLFAs呈極顯著正相關(guān)(表5)?？梢? 加工番茄土壤各菌群 PLFAs可用作表征土壤肥力的重要指標(biāo), 而且土壤養(yǎng)分含量的高低也直接影響到土壤微生物數(shù)量和種類的多少。

表5 加工番茄連作土壤理化性質(zhì)與根際土壤微生物PLFAs的相關(guān)關(guān)系

*和**分別表示在<0.05和<0.01水平顯著相關(guān)。* and ** mean significant correlation at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

2.9.2 土壤微生物量與根際土壤微生物PLFAs的相關(guān)性

將PLFAs分析法測(cè)得的土壤微生物PLFAs含量與氯仿熏蒸法測(cè)得的土壤微生物量的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析(表6), 結(jié)果表明: 真菌PLFAs量與SMBC、SMBN、SMBP及MB呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)(< 0.01); 細(xì)菌PLFAs總量、細(xì)菌/真菌的PLFAs比值及土壤總PLFAs與SMBC、SMBN和MB之間呈極顯著正相關(guān), 而與SMBC/SMBN極顯著負(fù)相關(guān)(< 0.01); 放線菌PLFAs與SMBP達(dá)到極顯著正相關(guān)(=0.963,<0.01)。可見, 采用這兩種方法測(cè)定加工番茄連作對(duì)土壤微生物的影響時(shí)結(jié)果具有一致性, 表現(xiàn)為連作顯著減少了土壤微生物量。因此, 將土壤熏蒸法與磷脂脂肪酸分析法相結(jié)合可以更加有效、準(zhǔn)確地從土壤微生物量受連作影響而變化的角度揭示連作障礙發(fā)生機(jī)理。

表6 土壤微生物量與根際土壤微生物PLFAs的相關(guān)關(guān)系

SMBC、SMBP和MB分別為土壤微生物量氮、土壤微生物量磷和土壤微生物熵。*和**分別表示在<0.05和<0.01水平顯著相關(guān)。SMBC, SMBN, SMBP andMB mean soil microbial biomass C, soil microbial biomass N, soil microbial biomass P, and soil microbial biomass entropy, respectively.* and ** mean significant correlation at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

3 討論與結(jié)論

3.1 加工番茄連作對(duì)土壤微生物量的影響

微生物生物量反映著土壤有效養(yǎng)分含量、生物活性和能量循環(huán)[20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明, 加工番茄長(zhǎng)期連作明顯降低了土壤微生物生物量, 這與前人研究黃瓜、棉花、大豆等長(zhǎng)期連作對(duì)土壤生物活性的影響結(jié)果相一致[3,6]。這是因?yàn)橐环矫? 土壤長(zhǎng)期在人為翻耕等劇烈的農(nóng)作措施下, 表層土侵蝕嚴(yán)重, 加速有機(jī)物質(zhì)的礦化, 同時(shí)加工番茄收獲時(shí)將秸稈等移除田外, 直接減少了土壤腐殖質(zhì)的形成, 使得土壤中可供微生物利用的碳源、氮源減少, 不利于微生物的繁殖與活動(dòng); 另一方面, 長(zhǎng)期連作使得根系分泌的自毒物質(zhì)在土壤中不斷累積, 土壤pH升高, 促使土壤呈真菌化, 改變了土壤微生物區(qū)系[1-3], 也不利于土壤微生物生長(zhǎng), 最終引起根際微生物總量下降。

微生物熵(MB)反映微生物利用碳源、氮源的效率, 可揭示加工番茄連作根際土壤生物學(xué)性質(zhì)的變異情況[16]。本研究結(jié)果表明, 加工番茄連作引起MB減小, 說明加工番茄長(zhǎng)期連作一方面使土壤中土壤活性有機(jī)碳含量不斷降低, 有機(jī)碳周轉(zhuǎn)速率減緩, 不利于土壤礦物對(duì)有機(jī)質(zhì)的固定, 造成一定的土壤碳、氮損失; 另一方面, 長(zhǎng)期連作造成組成微生物的碳氮等成分比例失衡, 導(dǎo)致微生物在需求外界能源時(shí)也有所差異, 從而在整體上影響到MB的大小[16], 最終反映出土壤微生物區(qū)系的變化[2-3]。

土壤微生物量碳氮比(SMBC/SMBN)的變化與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化有關(guān)[21]。本研究結(jié)果表明, SMBC/SMBN在加工番茄長(zhǎng)期連作條件下呈增大趨勢(shì), 變化范圍為4.84~10.88。一般情況下, 真菌的C/N值一般為7~12, 細(xì)菌為3~6[22]?？梢? 加工番茄連作年限越長(zhǎng), 土壤由細(xì)菌型向真菌型轉(zhuǎn)化, 導(dǎo)致地力衰竭, 連作障礙明顯, 這與前人等的研究結(jié)果相一致[2-3]。前人研究也認(rèn)為作物根系分泌物的種類、數(shù)量會(huì)改變根際土壤微生物區(qū)系組成, 使得根際土壤微生物種群平衡遭到破壞, 有害菌大量繁殖, 有益菌明顯減少, 最終表現(xiàn)出連作障礙[23-24]。

3.2 加工番茄連作根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化

利用磷脂脂肪酸譜圖分析法可以準(zhǔn)確客觀地判斷土壤中微生物量的變化情況, 揭示微生物群落結(jié)構(gòu)的差異性, 對(duì)研究土壤環(huán)境的質(zhì)量變化具有重要作用。本研究表明, 加工番茄不同年限土壤中所含PLFAs的種類相同, 共檢測(cè)到13種PLFA生物標(biāo)記, 但其含量存在顯著差異, 即土壤的PLFAs總量對(duì)照> 連作3 a>連作5 a>連作7 a, 說明長(zhǎng)期連作造成土壤微生物量的急劇下降, 這與前人研究大豆[25]、玉米[10]連作時(shí)發(fā)現(xiàn)土壤微生物量有所下降的結(jié)果相一致。原因是長(zhǎng)期高強(qiáng)度的農(nóng)業(yè)耕作措施破壞了土壤穩(wěn)定結(jié)構(gòu), 減小底物的豐度和均勻度, 不利于土壤微生物的代謝, 導(dǎo)致微生物多樣性減少, 最終表現(xiàn)為土壤微生物量的降低。

本研究發(fā)現(xiàn), 加工番茄連作對(duì)根際土壤中指示不同微生物類群的PLFAs含量的影響也存在顯著差異。長(zhǎng)期連作導(dǎo)致土壤細(xì)菌和放線菌PLFAs含量降低, 真菌PLFAs含量升高, 說明連作后根際土壤由細(xì)菌型向真菌型轉(zhuǎn)化, 與前人的研究結(jié)果一致[2-3]。有研究認(rèn)為, 連作后根系分泌物的數(shù)量增多會(huì)誘導(dǎo)土壤真菌數(shù)量的增加[23]。從細(xì)菌與真菌的PLFAs比值看, 加工番茄連作顯著降低了細(xì)菌與真菌的PLFAs比值, 說明加工番茄土壤的生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性在連作影響下逐漸降低, 表明長(zhǎng)期連作導(dǎo)致土壤抗逆境脅迫的緩沖能力減弱, 從而表現(xiàn)出連作障礙。Li等[26]在研究大豆連作時(shí)認(rèn)為根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變是根系分泌的化感物質(zhì)引起的, 且其根際化感物質(zhì)黃酮含量與土壤微生物群落存在正相關(guān)[10]。研究發(fā)現(xiàn), 加工番茄化感作用明顯, 主要化感物質(zhì)有鄰苯二甲酸、苯甲酸和肉桂酸等[27], 但這些化感物質(zhì)含量的多少是否也與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)存在相關(guān)性, 有待今后進(jìn)一步的研究。

3.3 土壤微生物生物量與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

本試驗(yàn)在利用熏蒸法對(duì)土壤中整體微生物量進(jìn)行測(cè)定的同時(shí), 采用磷脂脂肪酸分析法研究了特定菌群生物量, 將該兩種方法結(jié)合起來有助于更加全面地說明土壤微生物量的情況。研究發(fā)現(xiàn), 真菌PLFAs總量與土壤微生物量呈極顯著負(fù)相關(guān)(<0.01), 這與Zhao等[28]的研究結(jié)果不一致, 原因是選取的土壤樣品、試驗(yàn)處理等不同, 但可以推斷土壤微生物量的變化主要是源于土壤中細(xì)菌、真菌數(shù)量的變化, 導(dǎo)致二者變化趨勢(shì)顯著相關(guān)。細(xì)菌PLFAs總量、土壤PLFAs總量與土壤微生物量碳氮均呈極顯著正相關(guān)(<0.01), 放線菌PLFAs含量與土壤微生物量磷極顯著正相關(guān)(=0.963 0,<0.01)。這與前人研究認(rèn)為的在農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)中, 土壤微生物多樣性與微生物生物量之間顯著相關(guān)的結(jié)論相符合[3,25]。

土壤微生物最主要的3大類群細(xì)菌、真菌和放線菌構(gòu)成了主要的土壤微生物生物量, 其區(qū)系組成和數(shù)量的變化表征著土壤生物活性大小。本試驗(yàn)相關(guān)分析表明, 真菌PLFAs與土壤主要養(yǎng)分之間顯著或極顯著負(fù)相關(guān), 細(xì)菌PLFAs和土壤總PLFAs與有機(jī)質(zhì)、全氮含量存在極顯著正相關(guān)(<0.01)。一方面, 意味著有機(jī)質(zhì)和全氮可能是影響土壤微生物生長(zhǎng)的主要因素, 可以用土壤總PLFAs量、細(xì)菌和真菌PLFAs量來反映土壤碳、氮水平; 另一方面, 加工番茄長(zhǎng)期連作土壤趨于貧瘠化, 有機(jī)質(zhì)和全氮含量下降, 抑制了細(xì)菌、放線菌的生長(zhǎng), 使得細(xì)菌、放線菌的生物量減小, 說明土壤微生物量與土壤肥力相關(guān)[29]。相反, 真菌的生長(zhǎng)并沒有受到連作土壤貧瘠化的影響, 而是表現(xiàn)為真菌生物量的不斷增加, 這是因?yàn)橐延醒芯堪l(fā)現(xiàn)真菌較細(xì)菌更能適應(yīng)養(yǎng)分貧瘠的土壤[30]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)的年限范圍內(nèi), 加工番茄連作導(dǎo)致細(xì)菌PLFAs含量、土壤微生物量及微生物熵下降, 真菌PLFAs含量升高, 土壤由“細(xì)菌型”趨向“真菌型”, 使得土壤微生物多樣性與均勻度皆出現(xiàn)了一定程度的降低, 土壤微生物活性受到抑制, 從而不利于土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和利用, 最終表現(xiàn)出連作障礙。土壤微生物各類群PLFAs量、微生物量及土壤肥力之間存在相關(guān)性, 表明土壤微生物量與土壤的肥沃程度相關(guān), 可作為評(píng)價(jià)土壤肥力的生物學(xué)指標(biāo)。

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Microbial community structure in rhizosphere soils of long-term continuously cropped processing tomato based on PLFA method*

KANG Yalong1,2, SUN Wenqing1, LIU Jianguo1, JIANG Guiying1**

(1. Laboratory of Oasis Ecology Agriculture of Xinjiang Bingtuan, Shihezi University, Shihezi 832003, China; 2.BavariaAgricultural Technology Promotion Center, Kuerle 841000, China)

Xinjiang Uygur Autonomous Region is a major production base of processing tomato in China. In the effort to meet market demand for processing tomato, mono-cropping has been widely adopted. Unfortunately, this phenomenon has become the dominant factor limiting the stable production and yield of tomato in the region. Here, we conducted a field study to determine the impact of continuous cropping over the long-term on microbe community structurein rhizosphere soil of processing tomato using phospholipid fatty acid (PLFA) and chloroform fumigation extraction method. The mono-cropping field experiment started in 2007 at a station belonging to the College of Agriculture of Shihezi University. The processing tomato cultivar used in the experiment was ‘Ligeer 87-5’. Soil samples were collected for analysis from plots with different cultivation histories (3, 5 and 7 years of continuous cropping) and a control plot that was under fallow for 3 years. The results showed that soil microbial biomass C (SMBC), soil microbial biomass N (SMBN) and soil microbial biomass entropy(MB) significantly decreased, while soil microbial biomass C/N increased with increasing duration of continuous cropping (0.05). However, soil microbial biomass P (SMBP) exhibited a different response to both continuous cropping and various growth stages. PLFA analysis indicated that continuous cropping significantly increased fungal PLFAs, whereas the reverse trend was observed for bacterial PLFAs, total PLFAs and the ratio of bacterial PLFAs to fungal PLFAs. However, actinomycetous PLFAs had no regular change with increasing duration of continuous cropping. After 7 years of continuous cropping, bacterial PLFAs and total PLFAs amount decreased by 62.9% and 50.3% (0.05), respectively, but fungal PLFAs amount significantly increased by 60.2% compared with control. Based on diversityindex analysis, Shannon-Wiener index, Simpson index, Brillouin index and Pielou index all initially increased and then decreased with increasing years of continuous cropping of processing tomato. Soil microbial diversityindex was highest in the treatment of 3 years continuous cropping and was lowest for the treatment of 7 years continuous cropping.It was concluded that microbial community diversity and uniformity decreased with increasing of continuous cropping years in this area. Correlation analysis showed significant correlation among PLFAs of bacteria, fungi and actinomycetes, total PLFAs, soil microbial biomass and soil fertility, which indicated that soil microbial biomass was highly related with soil fertility. Therefore, soil microbial biomass could be used as an available biological index for the evaluation of soil fertility. The results suggested that years of mono-cropping had a major influence on microbial community structure and soil microbial biomass in rhizosphere soil of processing tomato, which in turn limited sustainable development of processing tomato.

Processing tomato; Continuous cropping; Soil microbial biomass; Microbial community structure; Phospholipid fatty acid biomarker

10.13930/j.cnki.cjea.160844

S311; S314

A

1671-3990(2017)04-0594-11

2016-09-19

2016-11-23

Sep. 19, 2016; accepted Nov. 23, 2016

* 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260142)資助

* This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (31260142).

** Corresponding author, E-mail: jgy67@126.com

**通訊作者:蔣桂英, 主要從事農(nóng)田生態(tài)環(huán)境與作物生理研究。E-mail: jgy67@126.com

康亞龍, 研究方向?yàn)樽魑锷砩鷳B(tài)。E-mail: 1175015468@qq.com

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