臺雪姣， 郭興榮， 羅超， 單勐也， 劉欣， 阮緒芝*

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北十堰442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院胚胎干細胞湖北省重點實驗室，湖北十堰442000)

小鼠頜下采血法改良

臺雪姣1， 郭興榮2， 羅超1， 單勐也1， 劉欣1， 阮緒芝1*

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北十堰442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院胚胎干細胞湖北省重點實驗室，湖北十堰442000)

目的 介紹一種簡易、可重復(fù)、采血量較大的小鼠采血方法——改良小鼠頜下采血法。方法 解剖觀察小鼠面部血管，選取最佳體表進針點；選用微量毛細吸管快速高效采集小鼠血液。選用20只18～22 g SPF級ICR雄性小鼠，用改良采血針通過面部進針點采血。結(jié)果 單人40～60 s內(nèi)可完成1只小鼠頜下采血，采血量0.5～0.7 mL。結(jié)論 改良頜下采血法具有對實驗動物創(chuàng)傷小、采血量大并可重復(fù)采血等優(yōu)點，尤為適用于初學(xué)者及大批量實驗動物采血者。它是一種可廣泛推廣的簡便、安全、快速、高效、采血量多的采血方法。

小鼠；采血；頜下靜脈； 頜下采血

小鼠由于自身基因序列與人類高度相似而成為醫(yī)學(xué)科研及臨床實驗中最常用的模型動物，特別是在生理學(xué)、藥理學(xué)、藥物代謝動力學(xué)等研究中，經(jīng)常要采集其血液進行常規(guī)質(zhì)量檢測、細胞學(xué)實驗或生理、生化分析，能夠順利采集小鼠血液樣本是實驗成功必不可少的一步。目前小鼠的采血方法較多，但各有利弊。心臟穿刺操作難度大，易導(dǎo)致小鼠死亡(吳曉晴，郝晨霞，2004)；斷頭取血不可重復(fù)，且血液常被毛發(fā)、組織液等污染(蘇麗娜等，2010)；眼眶后動脈、股動脈、靜脈、頸動脈、腹主動脈等穿刺取血法，需先進行麻醉，操作復(fù)雜，對小鼠的損傷較大，且采血的次數(shù)有限(宗阿南等，2008)；斷尾取血操作簡單，卻耗時長、取血少(崔潔等，2013)。Vahl等(2005)、吳劍平等(2010)的研究表明，常規(guī)實驗操作，特別是采血操作，都會使實驗動物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，使大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素及皮質(zhì)醇等相應(yīng)生理生化指標(biāo)發(fā)生改變，因此，實驗操作應(yīng)盡量減少對實驗動物的刺激。頜下采血法是當(dāng)今最快速、簡單、人性化的小鼠采血方法，在保證實驗血樣順利采集的基礎(chǔ)上將對小鼠的傷害減小到最小(Goldeetal.，2005)。但該方法尚未被廣泛應(yīng)用，文獻報道很少。我們在動物實驗過程中，實踐了上述各種采血方法，結(jié)合自身經(jīng)驗對頜下采血法進行了關(guān)鍵技術(shù)改良。本文介紹了一種可廣泛推廣的簡便、安全、快速、高效、采血量多的改良小鼠頜下采血方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級ICR雄性小鼠20只，體質(zhì)量18～22 g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院SPF級動物實驗中心提供[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2011-0008；實驗動物使用許可證號：SYXK(鄂)2011-0031]。

1.1.2 實驗器材 20 μL微量毛細吸管(批號：140208，姜堰市健華醫(yī)療器械有限公司)、常規(guī)1.5 mL滅菌離心管、酒精棉球、滅菌干棉球、肝素等。

1.2 方法

改良頜下采血法步驟如下：

確定采血進針點：用5%水合氯醛溶液按照0.1 mL/10 g麻醉小鼠，整體觀察頭面部，可見下頜處左右各有1處明顯少毛或無毛的位點，取名為下頜斑點(圖1：a，b)。進行頜面部血管解剖，解剖可見頸外靜脈在頜面部表淺部位主要分為2支(圖1：c)：一支上行到眼部，一支下行沿咬肌下緣走行(圖1：d，e)，走行區(qū)經(jīng)過下頜斑點，該處血管位置表淺，且體表投影位置明確、易于識別，即為實驗采血點。

改良采血針：選用簡單易獲得的20 μL微量毛細吸管代替金屬采血針，使用前高壓滅菌消毒，將微量毛細吸管一端折去，使斷面平整，保留6 cm(圖2：a)。

捉持法固定：以右手提鼠尾，將小鼠放于粗糙面上，將鼠尾輕向后拉，以左手拇指、食指捏雙耳、頭部皮膚，無名指、小指及掌心夾住背部皮膚和鼠尾，避免小鼠頭部擺動(圖1：a)。

頜下采血：左手捉持固定小鼠，將其倒立數(shù)秒使頭面部血管充盈，在小鼠頭面下頜部找到下頜斑點(圖1：a)，右手用酒精棉球擦拭采血部位消毒后，拇指、食指、中指持微量毛細吸管于血管體表投影點垂直頜面部旋轉(zhuǎn)迅速刺入皮下，血液即流出(圖2：b)。采血結(jié)束，立即用滅菌干棉球壓迫止血。

將血液收集于1.5 mL滅菌離心管內(nèi)，編號備用(圖2：c)。采血結(jié)束后，小鼠正常培養(yǎng)觀察10 d，觀察其進水、飲食、行為活動、感染、死亡等情況。

圖1 改良小鼠頜下采血進針點——下頜斑點

a. 小鼠下頜采血進針斑點體表位置， b. 小鼠下頜血管走行與進針斑點位置， c. 小鼠下頜內(nèi)部血管走行， d. 小鼠單側(cè)頜下血管， e. 小鼠雙側(cè)頜下血管走行。

a. mouse mandibular freckle position on the surface, b. mouse mandibular blood vessel and the mandibular freckle, c. mouse mandibular vascular line, d. unilateral mandibular vascular of mouse, e. bilateral mandibular blood vessels of mouse.

圖2 小鼠頜下采血針——微量毛細吸管

a. 20 μL微量毛細吸管， b. 微量毛細吸管采血， c. 采集到的血量。

a. 20 μL microcapillary pipet, b. blood collected from mouse submandibular point, c. blood volume.

2 結(jié)果

采用改良頜下采血法對20只小鼠進行采血操作，每只小鼠采血量為0.5～0.7 mL。所取血液基本無溶血發(fā)生，離心后上層血清澄清透明。

單人操作采血20次，每次在40～60 s內(nèi)即可完成對1只小鼠的采血過程，每2只間隔休息1 min，單人40 min內(nèi)可完成20只小鼠采血工作，采血成功率達100%，為后期檢測工作的順利進行奠定了良好基礎(chǔ)。采血數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計見表1。

表1 小鼠采血數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析Table 1 Blood collection data and statistical analysis

采血過程中，1只小鼠采血成功但采血后死亡。其余小鼠未發(fā)生傷殘、死亡等情況。采血后常規(guī)條件下培養(yǎng)觀察10 d，小鼠進水、飲食正常，毛發(fā)光滑，無行為活動異常、無感染、無死亡。

3 討論

頜下采血法是目前最簡易、最快捷、損傷小的采血方法，符合3R原則和動物福利。與傳統(tǒng)采血法結(jié)果(張帥帥等，2016)比較見表2。

頜下采血法不僅不會給小鼠造成大的傷害，而且可反復(fù)采血，操作方便，采血后小鼠恢復(fù)快。但在操作過程中有幾點不足：第一，采血位置定位模糊。余琛琳等(2008)描述“下頜骨后方咬肌邊緣”；張帥帥等(2016)介紹“鼠的下唇、眼、耳根下緣可組成近似等腰三角形，在下唇與耳根下緣所組成的底邊中心偏耳根的位置處，有約2 mm2的軟組織”。這些定位描述對于未接觸過動物實驗或無解剖學(xué)基礎(chǔ)的人而言增加了難度。第二，各類文獻中報道的頜下采血工具都是靜脈專用采血針或注射器針頭，刺破皮膚后使血液滴入收集管，但血液在接觸到皮膚毛發(fā)后極易被污染。郝婉君等(2009)通過對比摘眼、斷尾、心臟、頜下采血法后，認為“采血量要求高，且不要求重復(fù)使用，可以采用心臟采血或摘眼取血；而對采血量要求不高的最好選擇頜下靜脈采血”。通過改進，我們用類似小鼠眶后靜脈叢采血的微量毛細吸管進行采血，將血液由體內(nèi)直接導(dǎo)入收集管中，避免了血樣被污染，采血量要求高的實驗也可選擇此法；且下頜斑點的明確定位大大提高了實驗的成功率和可重復(fù)性，使初學(xué)者也能快速準(zhǔn)確地找到采血點進行采血。

表2 各種小鼠采血方法比較Table 2 Comparison of different blood collection methods

針對上述問題，我們對小鼠頜下采血法進行了改良，改良后主要有以下幾個方面的優(yōu)點：(1)采血所需實驗器械簡易、普遍；(2)采血點明確，簡單易識別，特別適合初學(xué)者；(3)對小鼠損傷小，采血所需時間很短，尤其是操作熟練的實驗人員，可很好地把握采血位置和深度，將損傷降至最低；(4)血液采集量較大，成年小鼠單次采血量平均可達0.5 mL；(5)使用微量毛細吸管采血，有利于避免局部皮膚、毛發(fā)及組織液的污染，不易發(fā)生溶血；(6)可多次重復(fù)采集血液樣本，滿足對血樣的不同需求。該方法簡易實用，既減少醫(yī)學(xué)工作者采集血液的難題，又減輕實驗動物的痛苦，是一種快速、簡單、人性化的小鼠采血方法。

為了更好地運用頜下采血法，以下幾點值得注意：(1)小鼠頭部固定是采血成功的關(guān)鍵，左手抓住頭部皮膚使其緊繃，更易于采血針的刺入，固定住頭部后可將小鼠短暫倒立10 s使頭部血管充盈；(2)切忌將頸部皮膚抓持過緊，造成小鼠窒息死亡；(3)找準(zhǔn)進針點，垂直面部進針，一般刺破皮膚進針1～3 mm即可出血，觸及頜骨應(yīng)停止進針；(4)采血過程中使小鼠倒立可增加采血量；(5)采血遵循無菌原則；(6)采血前禁食不禁水12～24 h，或于當(dāng)天采血前0.5～1 h內(nèi)用1 mL水灌胃，增加血容量，能減少采血造成的死亡。

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Improved Experimental Techniques of Blood Collection from the Submandibular Vein Plexus in Mice

TAI Xuejiao1， GUO Xingrong2， LUO Chao1， SHAN Mengye1， LIU Xin1， RUAN Xuzhi1*

(1. Faculty of Basic Medical Sciences， Hubei University of Medicine， Shiyan， Hubei Province 442000， China;2. Hubei Key Laboratory of Embryonic Stem Cell Research， Taihe Hospital， the Affiliated Hospitals of Hubei University of Medicine， Shiyan， Hubei Province 442000， China)

Objective To introduce a simple and repeatable blood collection method from the submandibular vein plexus of mice. The operators can collect a large amount of blood by using this method. Methods We first chose the best point of blood collection by anatomical observation of facial blood vessels in mice， then the microcapillary pipets were used to collect blood quickly and efficiently. About 20 SPF ICR male mice with a weight range of 18-22 g were selected， and the blood was collected from the submandibular point using the microcapillary pipet. Results Appropriately， a volume of 0.5-0.7 mL blood could be collected from each mouse within 40-60 s by one operator. Conclusion The improved blood collection method had the advantages of smaller trauma to the experimental mice and can collect more blood. In addition， the operation process can be easily repeated. This method was particularly suitable for the beginners or people who needed large amounts of blood from mice. This improved blood collect method was an easy， safe， fast and efficient method to get more blood from mice， which should become an extensively used method.

mouse; blood collection; submandibular vein; blood collection from the submandibular vein plexus

2016-07-28 接受日期：2016-11-18

湖北省自然科學(xué)基金項目(2015CFC812)； 湖北十堰市社發(fā)指導(dǎo)項目(16y03)

臺雪姣(1990—)， 女， 碩士研究生， 研究方向：腫瘤病理學(xué)， E-mail：taixuejiao0109@163.com

*通信作者Corresponding author， 博士， 教授， 碩士生導(dǎo)師， 研究方向：腫瘤分子生物學(xué)， E-mail：ruanxuzhi117@163.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20160201

R-33

A

1000-7083(2017)02-0211-04