田 莉，李海萍，袁亞宏,*，岳田利，魏建平

（1.西北農(nóng)林科技大學食品學院，陜西 楊凌 712100；2.咸陽市城市綠化管理處，陜西 咸陽 712000）

真空耦合超聲波提取蘋果渣多酚的工藝優(yōu)化

田 莉1，李海萍2，袁亞宏1,*，岳田利1，魏建平1

（1.西北農(nóng)林科技大學食品學院，陜西 楊凌 712100；2.咸陽市城市綠化管理處，陜西 咸陽 712000）

在單因素試驗基礎上，采用響應面優(yōu)化法建立基于真空耦合超聲波提取蘋果渣中多酚類物質的工藝條件優(yōu)化，并通過高效液相色譜檢測多酚組成且對抗氧化活性進行分析。結果表明，最佳提取工藝條件為乙醇溶液體積分數(shù)50%、提取溫度50 ℃、真空度0.08 MPa、超聲功率420 W、提取時間13 min、料液比1∶30（g/mL），在此條件下，蘋果渣中多酚提取得率為6.46 mg/g。與超聲波提取法相比，該方法可以明顯縮短提取時間，獲得多酚中表兒茶素及蘆丁含量較高，并且具有較強的抗氧化活性。

蘋果渣；多酚；真空耦合超聲波；響應面法；高效液相色譜；抗氧化活性

我國有著豐富的蘋果資源，也是濃縮蘋果汁最大的生產(chǎn)國，2015年產(chǎn)量達4261.3萬 t[1]，因而產(chǎn)生巨量的鮮果渣，這些果渣除少量用作飼料外，大部分被廢棄。蘋果多酚是一類具有生物活性的天然產(chǎn)物，主要集中在果皮和果籽中，在榨汁過程中隨果皮進入果渣中，已被證實具有極強的抗氧化活性[2-6]，具有抗菌消炎[7-9]、預防冠心病[10]、抗腫瘤[11-12]、保肝[13]、抗癌[14]等多種藥理功能。因此從蘋果渣中提取多酚類物質是資源充分利用的科學舉措。

目前，對蘋果渣多酚的提取多采用超聲波、微波[15]、生物酶解[16]、超高壓、超臨界等輔助方法，其中超聲波提取技術利用其空化效應、機械效應和熱效應增大介質穿透力，加速活性物質的溶出。因其操作較簡單，提取率較高而應用較廣，但缺點是用時較長。近幾年又提出了減壓提取法，主要應用于中藥提取，減壓提取法通過抽真空降低了熱敏性活性物質隨溫度升高造成的氧化和降解，且使體系更活躍，從而加快提取速率[17-20]。因此，將超聲波與減壓2 種方法耦合，以提高天然活性物質的提取率并且保護活性物質不受破壞。目前，關于減壓耦合超聲波提取法，應用于茶多酚、棗皮多酚、高烏甲素等的研究[21-23]，而鮮見應用于蘋果多酚提取報道。本研究主要采用陜西紅富士蘋果渣為原料，以乙醇溶液為溶劑，利用響應面法優(yōu)化了真空（減壓）耦合超聲波提取蘋果渣多酚的工藝，并通過高效液相色譜檢測多酚組成且對抗氧化活性進行了分析，以期為更好、更系統(tǒng)地開發(fā)和利用蘋果渣資源提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果渣：市購陜西紅富士蘋果，鮮榨后于45 ℃烘干48 h，粉碎過60 目篩。

多酚標準品：沒食子酸、兒茶素、綠原酸、香草酸、咖啡酸、表兒茶素、原花青素B2、阿魏酸、蘆丁、根皮苷、槲皮素（均為色譜純） 上海源葉生物科技有限公司；冰乙酸（色譜純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；乙腈（色譜純） 美國天地有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海源葉生物科技有限公司；2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-tris(2-pyridyl)-S-triazine，TPTZ） 北京索萊寶科技有限公司；福林-酚試劑 上海荔達生物科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

KQ-700GVDV型三頻恒溫數(shù)控超聲波清洗器 江蘇省昆山市超聲波儀器有限公司；UV-1240型紫外-可見分光光度計、LC-20AD高效液相色譜儀 日本島津公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 真空耦合超聲波提取蘋果渣多酚

將蘋果渣裝入250 mL燒瓶內，按一定料液比加入乙醇，如圖1所示，連接好提取設備，使燒瓶內樣液液面低于超聲儀中水的液面，開啟真空泵形成負壓，通過三通閥調節(jié)壓力大小，使燒瓶中提取液保持微沸狀態(tài)，再開啟超聲波在頻率為45 kHz條件下進行提取，過濾收集蘋果渣多酚提取液。

1.3.2 單因素試驗

由于乙醇的低毒性與提取多酚的高效性[4]，本實驗選擇乙醇溶液作為提取溶劑。每次試驗重復3 次，取平均值。

1.3.2.1 超聲功率對提取得率的影響

在料液比1∶30（g/mL）、體積分數(shù)50%乙醇溶液、提取溫度50 ℃、真空度0.08 MPa、提取時間10 min條件下，分別考察280、350、420、490、560 W的超聲功率對蘋果渣多酚提取得率的影響，確定最佳超聲功率。

1.3.2.2 乙醇溶液體積分數(shù)對提取得率的影響

在料液比1∶30（g/mL）、超聲功率420 W、提取溫度50 ℃、真空度0.08 MPa、提取時間10 min條件下，考察體積分數(shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液對蘋果渣多酚提取得率的影響，確定提取液的最佳體積分數(shù)。

1.3.2.3 料液比對提取得率的影響

在體積分數(shù)50%乙醇溶液、超聲功率420 W、提取溫度50 ℃、真空度0.08 MPa、提取時間10 min條件下，考察料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）對蘋果渣多酚提取得率的影響，確定物料與提取液的最佳料液比。

1.3.2.4 真空度對提取得率的影響

在超聲功率420 W、提取溫度50 ℃、體積分數(shù)50%乙醇溶液、料液比1∶30、提取時間10 min的條件下，考察真空度0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 MPa對蘋果渣多酚提取得率的影響，確定最佳真空度。

1.3.2.5 提取溫度對提取得率的影響

在料液比1∶30、提取時間10 min、體積分數(shù)50%乙醇溶液、真空度0.08 MPa、超聲功率420 W條件下，考察提取溫度30、40、50、60、70、80 ℃對蘋果渣多酚提取得率的影響，確定最佳提取溫度。

1.3.2.6 提取時間對提取得率的影響

在料液比1∶30、體積分數(shù)50%乙醇溶液、提取功率420 W、提取溫度50 ℃、真空度0.08 MPa條件下，考察5、10、15、20、25 min的提取時間對蘋果渣多酚提取得率的影響，以確定最佳提取時間。

1.3.3 響應面法試驗設計

在單因素試驗基礎上，選擇提取溫度、提取時間、乙醇溶液體積分數(shù)、料液比4 個因素，應用Design-Expert V8.0.6軟件，根據(jù)Box-Behnken原理設計四因素三水平的響應面試驗，以多酚提取得率Y為響應值，利用響應面分析法對真空耦合超聲波提取蘋果渣多酚工藝進行優(yōu)化，見表1。

1.3.4 多酚提取得率的計算

采用福林-酚法，以沒食子酸為基準物質計算蘋果渣提取液中多酚含量[24]。按公式（1）計算提取得率：

式中：c為多酚質量濃度/（mg/mL）；v為提取液體積/mL；m為原料樣品質量/g。

1.3.5 高效液相色譜對多酚成分分析

高效液相色譜檢測方法參考文獻[25-28]。色譜柱：Agilent 5 TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流速0.8 mL/min；進樣量20 μL；檢測波長280、360 nm；流動相：A為2%冰乙酸溶液，B為含0.5%冰乙酸的乙腈-水（1∶1，V/V）溶液；線性梯度洗脫：0～50 min，10%～55% B；50～60 min，55%～100% B；60～65 min，100%～10% B；65～75 min，10%～10% B。

樣品為多酚粗提液，用AB-8大孔樹脂純化后，過0.45 μm微孔濾膜。

1.3.6 抗氧化性測定

1.3.6.1 DPPH自由基清除率的測定

參照Shahidi等[29]的方法，將不同提取方法得到的多酚經(jīng)純化、凍干后，與抗壞血酸、蘆丁配成相同質量濃度梯度樣液，取樣液2 mL，加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液，混合均勻，室溫放置30 min后，于517 nm波長處測吸光度。DPPH自由基清除率按公式（2）計算：

式中：A0為用蒸餾水代替樣品的吸光度；At為樣品的吸光度；Ab為乙醇溶液代替DPPH溶液的吸光度。

1.3.6.2 亞鐵還原能力法測定總還原能力

參照Bebzie等[30]建立的方法，原理：TPTZ可被樣品中還原物質還原為二價鐵形式，呈現(xiàn)出明顯的藍色，并于波長593 nm處具有最大光吸收，根據(jù)吸光度的大小計算樣品抗氧化活性的強弱。

TPTZ工作液的配制參見文獻[31]。

亞鐵還原能力標準曲線的建立：1.8 mL TPTZ工作液加入0.2 mL不同濃度FeSO4溶液，于波長593 nm處測定吸光度。FeSO4濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L，以濃度對吸光度繪制標準曲線。

樣品還原能力的測定：取樣液0.2 mL加入1.8 mL TPTZ工作液，37 ℃反應10 min，于波長593 nm處測定吸光度。每個樣品重復3 次實驗。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

如圖2A所示，多酚提取得率隨超聲功率的增大先增大，在490 W時達到最大值，繼續(xù)增大超聲功率時，多酚的提取得率略有下降?？紤]到420 W后，提取得率增加幅度減小，且功率較大耗能多，所以選定超聲提取功率為420 W。

如圖2B所示，多酚的提取得率隨乙醇溶液體積分數(shù)的增加而增大，當乙醇溶液體積分數(shù)達到60%時，提取得率達到最大，之后隨乙醇溶液體積分數(shù)的增加，提取得率呈下降趨勢。由于乙醇溶液體積分數(shù)過大時，可能存在醇溶性雜質的溶出，與多酚類物質競爭和溶劑的結合，從而使多酚提取得率下降。所以，選擇體積分數(shù)50%、60%、70%乙醇溶液進行響應面試驗。

如圖2C所示，隨著料液比的增加，多酚的提取得率逐漸增加，這是因為蘋果組織中多酚與蛋白質、多糖、生物堿等物質以氫鍵等形式結合在一起，而有機溶劑和水的混合液能有效的抑制這種結合，因此提取液增多有利于蘋果多酚的提??；當料液比達到1∶25以后提取得率略有下降，這是因為當提取液量過多時，在真空條件下較易損失，所以，選擇料液比1∶20、1∶25、1∶30進行響應面試驗。

如圖2D所示，未到達提取溫度對應的沸騰真空度（50 ℃對應0.08 MPa）前，隨體系真空度的增大，提取得率也隨之上升，在體系沸騰時提取得率達到最大值，但真空度繼續(xù)增大，體系便劇烈沸騰，上升的蒸汽無法及時回流入體系內，造成了一定的損失，使得多酚提取得率下降。因此，本實驗選定體系保持輕微沸騰狀態(tài)時的真空度。

如圖2E所示，由于在不同提取溫度，體系達到微沸時所對應的真空度不同，所以在研究提取溫度對多酚提取得率的影響之前，分別測了各溫度所對應的體系微沸真空度，各提取溫度及其所對應微沸真空度分別為30 ℃（0.092 MPa），40 ℃（0.086 MPa），50 ℃（0.08 MPa），60 ℃（0.075 MPa），70 ℃（0.071 MPa），80 ℃（0.066 MPa）。多酚提取得率隨提取溫度的升高而增加，在提取溫度達到60 ℃時，提取得率達到最大，繼續(xù)升高溫度多酚提取得率略有下降，由于提取溫度過高會引起酚類化合物的降解，同時容易造成溶劑揮發(fā)損失，所以，選擇50、55、60 ℃進行響應面試驗。

如圖2F所示，傳統(tǒng)的超聲波輔助提取，隨著提取時間的延長，提取得率逐漸增大，在25 min時最大提取得率為5.51 mg/g；而真空耦合超聲波提取方法中，10 min時提取得率達到最大為5.57 mg/g，隨著提取時間的延長，提取得率逐漸下降，提取得率下降是因為提取時形成負壓，分子活動更快，10 min時可將大部分多酚類物質提出，但隨著提取時間延長所提出的多酚可能會分解，由此可知，真空耦合超聲波能明顯縮短提取時間，從而提高提取效率。選定提取時間5、10、15 min進行響應面試驗。

2.2 響應面試驗結果

由表2、3可知，該模型極顯著，失擬項不顯著，各因素影響大小依次是料液比＞乙醇溶液體積分數(shù)＞提取溫度＞提取時間；一次項C、D極顯著；二次項B2極顯著，A2和C2顯著；交互項AB、BC顯著。

經(jīng)回歸擬合后，得到以蘋果多酚提取得率（Y）為響應值的回歸方程為：Y=5.96－0.26C＋0.32D－0.34AB－0.33BC－0.23A2－0.58B2－0.24C2。

回歸方程的決定系數(shù)R2為0.864 1，調整決定系數(shù)R2Adj為0.728 3，說明該模型能夠解釋72.83%的響應值變化，因而模型的擬合度良好，可對不同提取條件下蘋果多酚提取得率進行預測。

根據(jù)回歸模型預測蘋果多酚提取的最佳工藝條件為提取溫度50.00 ℃、提取時間12.72 min、體積分數(shù)50.00%乙醇溶液、料液比1∶30.00。在此條件下，蘋果多酚的理論提取得率達6.604 5 mg/g。

如圖3a、d所示，響應面顯示坡度較陡，表明提取溫度和提取時間及提取時間和乙醇溶液體積分數(shù)之間交互作用顯著。如圖3b、c、e、f所示，等高線為圓形可知交互作用不顯著。

2.3 模型的驗證

考慮到實際操作的可行性，將提取條件在回歸方程得到的理論值基礎上修正為：提取溫度50 ℃，提取時間13 min，體積分數(shù)50%乙醇溶液，料液比1∶30（g/mL）。在以上優(yōu)化條件下進行驗證實驗，共進行5 次，所得到的提取得率平均值為6.46 mg/g。理論值與實驗值的相對偏差為2.2%，說明采用響應面法優(yōu)化提取條件是可行的，所得提取條件具有實際應用價值。

2.4 高效液相色譜分析蘋果渣多酚的組分

如圖4所示，對比樣品的色譜圖，結果顯示蘋果渣多酚中兒茶素、綠原酸、表兒茶素、蘆丁（360 nm檢測波長）及根皮苷含量較高，占所檢測得到多酚含量80%以上。如表4所示，真空耦合超聲波提取的多酚中蘆丁含量是超聲波提取的5.9 倍，而沒食子酸、綠原酸及槲皮素相對較少，具體原因還待進一步探究。因此，通過體外抗氧化實驗進一步研究真空耦合超聲波提取對蘋果渣多酚抗氧化生物活性的影響。

2.5 蘋果渣多酚的抗氧化性

2.5.1 DPPH自由基的清除作用

由圖5可知，質量濃度在2～25 μg/mL范圍內，2 種提取方法提取的蘋果渣多酚、抗壞血酸及蘆丁對DPPH自由基清除率均隨著質量濃度的增加而增強；當質量濃度為25 μg/mL時，清除率均達90%以上，都具有較強的DPPH自由基清除能力。經(jīng)分析得，抗壞血酸、蘆丁、真空耦合超聲波多酚提取液、超聲波多酚提取液對DPPH自由基清除率IC50值依次為4.350 8、3.661 2、4.310 0、4.775 3 μg/mL，則DPPH自由基清除能力大小依次是：蘆?。菊婵振詈铣暡ǘ喾犹崛∫海究箟难幔境暡ǘ喾犹崛∫?；由于蘆丁具有較強的清除DPPH自由基的能力，所以真空耦合超聲波提取的多酚比超聲波提取的多酚具有較高清除DPPH自由基的能力，可能是因為含有較多蘆丁。

2.5.2 亞鐵還原能力法測定還原能力

采用1.3.6.2節(jié)方法進行實驗，得到還原力測定標準曲線，硫酸亞鐵在0.2～1.0 mmol/L濃度范圍內，于波長593 nm處測定吸光度在0.281 7～1.111 2范圍成良好線性關系。方程為y=1.040 9x+0.074 9，決定系數(shù)R2為0.999 5。因此，以波長593 nm處的吸光度換算成多酚的FeSO4當量濃度的方法是可行的。

由圖6可知，質量濃度在5～50 mg/L范圍內，還原能力隨各物質質量濃度的增大而增加，2 種方法提取的蘋果渣多酚還原力多介于蘆丁和抗壞血酸之間；當質量濃度為50 mg/L時，抗壞血酸、蘆丁、真空耦合超聲波多酚提取液、超聲波多酚提取液吸光度分別為1.177、0.743、1.227、0.864，即還原能力大小依次是：真空耦合超聲波多酚提取液＞抗壞血酸＞超聲波多酚提取液＞蘆丁。研究表明，表兒茶素相比于酚類物質顯出更高的抗氧化能力[5]，真空耦合超聲波提取的蘋果渣多酚含有較高表兒茶素，因此具有更高的還原力。

3 結 論

通過單因素試驗和響應面試驗確定了真空耦合超聲波提取蘋果渣多酚的最佳工藝條件為超聲功率420 W、提取溫度50 ℃（真空度0.08 MPa）、提取時間13 min、乙醇溶液體積分數(shù)50%、料液比1∶30（g/mL），此條件下蘋果渣多酚粗提物中多酚物質的提取得率為6.46 mg/g（相對于1 g干果渣）。

對真空耦合超聲波提取的蘋果渣多酚及超聲波提取的果渣多酚經(jīng)高效液相色譜分析，結果顯示，真空耦合超聲波提取的蘋果渣多酚中表兒茶素和蘆丁含量較高，兒茶素及綠原酸含量略低，而沒食子酸未檢出。

通過清除DPPH自由基和FRAP法對不同提取方法提取蘋果渣多酚的抗氧化活性研究，結果顯示，真空耦合超聲波法比超聲波法提取的蘋果渣多酚具有更高的抗氧化能力。

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Optimization of Ultrasound-Vacuum Assisted Extraction of Polyphenols from Apple Pomace

TIAN Li1, LI Haiping2, YUAN Yahong1,*, YUE Tianli1, WEI Jianping1
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Urban Greening Management Office of Xianyang City, Xianyang 712000, China)

One-factor-at-a-time method and response surface methodology were used in combination to optimize the ultrasound-vacuum assisted extraction of polyphenols from apple pomace. At the same time, antioxidant assays in vitro were also carried out on the polyphenols and the polyphenol composition was analyzed by HPLC. The optimal extraction parameters that provided the maximum yield of polyphenols of 6.46 mg/g were determined as follows: 50% ethanol as extraction solvent, a solid-to-solvent ratio of 1:30 (g/mL), an extraction time of 13 min, an extraction temperature of 50 ℃, an ultrasound power of 420 W, and a vacuum degree of 0.08 MPa. Compared with traditional ultrasonic assisted extraction, the extraction time was considerably shortened by using ultrasound-vacuum assisted extraction while yielding polyphenol extracts containing more epicatechin and rutin and having stronger antioxidant activities.

apple pomace; polyphenol; ultrasound combined with vacuum treatment; response surface methodology; HPLC; antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201714036

TS209

A

1002-6630（2017）14-0233-07

田莉, 李海萍, 袁亞宏, 等. 真空耦合超聲波提取蘋果渣多酚的工藝優(yōu)化[J]. 食品科學, 2017, 38(14): 233-239.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714036. http://www.spkx.net.cn

TIAN Li, LI Haiping, YUAN Yahong, et al. Optimization of ultrasound-vacuum assisted extraction of polyphenols from apple pomace[J]. Food Science, 2017, 38(14): 233-239. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714036. http://www.spkx.net.cn

2016-10-18

農(nóng)業(yè)部“948計劃”項目（310715501）；國家自然科學基金面上項目（31171721）

田莉（1991—），女，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物、功能食品和安全。E-mail：lilytian77@sina.com

*通信作者：袁亞宏（1971—），女，教授，博士，研究方向為食品高新技術及食品發(fā)酵工程。E-mail：yuan324@msn.com