單斌斌，宋 娜，劉淑德，涂 忠，王曉梅，高天翔，韓志強(qiáng)，張秀梅??

(1.中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島 266003； 2.山東省水生生物資源養(yǎng)護(hù)管理中心，山東 煙臺(tái) 264003；3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院資源與環(huán)境研究中心，北京 100141； 4.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院農(nóng)業(yè)部漁業(yè)遙感科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，北京 100141；5.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江 舟山 316022)

基于線粒體COI基因序列的金烏賊群體遺傳學(xué)研究?

單斌斌1，宋 娜1，劉淑德2，涂 忠2，王曉梅3, 4，高天翔5，韓志強(qiáng)5，張秀梅1??

(1.中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島 266003； 2.山東省水生生物資源養(yǎng)護(hù)管理中心，山東 煙臺(tái) 264003；3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院資源與環(huán)境研究中心，北京 100141； 4.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院農(nóng)業(yè)部漁業(yè)遙感科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，北京 100141；5.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江 舟山 316022)

利用線粒體COI基因片段序列比較分析了金烏賊(Sepiaesculenta)4個(gè)地理群體(乳山、青島、日照和舟山)的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)。在4個(gè)群體117個(gè)樣本的線粒體COI基因部分序列中，檢測(cè)到27個(gè)單倍型。群體遺傳多樣性分析顯示，4個(gè)群體的單倍型多樣度為0.478～0.956，核苷酸多樣性為0.001～0.006，舟山群體的遺傳多樣性遠(yuǎn)高于乳山、青島和日照群體。群體間遺傳分化指數(shù)顯示，舟山群體與其他3個(gè)群體之間存在較大的遺傳分化(0.186～0.292)，而乳山、青島和日照群體之間遺傳分化較小(-0.007～0.039)。本研究結(jié)果暗示，增殖放流活動(dòng)可能對(duì)山東省近海的金烏賊群體的遺傳多樣性產(chǎn)生了一定的影響。

金烏賊；COI基因；遺傳多樣性；遺傳結(jié)構(gòu)；增殖放流

金烏賊(Sepiaesculenta)隸屬于烏賊目(Sepioidea)烏賊科(Sepiidae)烏賊屬(Sepia)，曾經(jīng)廣泛分布于俄羅斯遠(yuǎn)東海海域、中國(guó)沿海海域、日本的本州、四國(guó)、九州海域、朝鮮的西海岸、南海岸海域及菲律賓群島海域[1]。金烏賊為一年生中下層洄游性頭足類，游泳速度較慢，生長(zhǎng)迅速，肉質(zhì)鮮美且蛋白質(zhì)含量豐富，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，曾為我國(guó)漁業(yè)捕撈的重要對(duì)象之一[2-4]。1980年代以來(lái)，隨著捕撈壓力的增大和產(chǎn)卵場(chǎng)環(huán)境惡化等因素，金烏賊資源量衰退明顯[5]。為了修復(fù)和保護(hù)金烏賊資源，自1991年起，金烏賊作為一種珍貴的地方品種被列入山東省地方資源增殖計(jì)劃，此后金烏賊漁業(yè)逐漸從捕撈開(kāi)發(fā)型向資源增殖型轉(zhuǎn)變。自2010年金烏賊苗種實(shí)現(xiàn)全人工繁育[6]，山東省大力開(kāi)展金烏賊增殖放流工作，放流量逐步提升。2016年，山東省投放胴長(zhǎng)1.2 cm以上金烏賊苗種達(dá)125.2萬(wàn)頭，同比2015年增加48.6%[7]。由于增殖放流的顯著效果，山東省金烏賊年產(chǎn)量已由2007年的432 t逐步回升[8]，增長(zhǎng)到2012年1 864 t[9]，近幾年金烏賊年產(chǎn)量維持在1 000 t以上，資源增殖效果明顯。

隨著增殖放流在越來(lái)越多的海洋經(jīng)濟(jì)種類中得到應(yīng)用，其對(duì)野生資源的遺傳學(xué)影響也越來(lái)越引起研究者們的注意[10-11]。通常用于增殖放流的苗種的遺傳多樣性遠(yuǎn)小于該物種的野生群體的遺傳多樣性，這可能是由于參與繁殖的親本數(shù)量較少、繁殖過(guò)程中發(fā)生近親交配以及瓶頸效應(yīng)等原因[12-13]。大量的放流苗種被投入自然海域，勢(shì)必對(duì)野生群體造成遺傳學(xué)影響。因此，為了弄清增殖放流對(duì)投放海域野生群體的影響，尤其當(dāng)放流苗種與野生群體的遺傳背景不同時(shí)，應(yīng)對(duì)野生群體開(kāi)展遺傳學(xué)研究[14]。

迄今為止對(duì)金烏賊的研究主要集中在資源時(shí)空分布及胚胎發(fā)育、繁殖習(xí)性、生長(zhǎng)發(fā)育、攝食行為等生物學(xué)方面[15-18]。金烏賊群體遺傳多樣性及遺傳分化等方面的研究?jī)H見(jiàn)Zheng對(duì)日本海域的4個(gè)群體以及中國(guó)海域的1個(gè)群體進(jìn)行了微衛(wèi)星分析[19]。

線粒體DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、母系遺傳、進(jìn)化速率快、幾乎不發(fā)生重組等特點(diǎn)，作為一種重要的分子遺傳標(biāo)記而被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)生物的系統(tǒng)發(fā)育、生物地理學(xué)和保護(hù)生物學(xué)研究，是分子生物學(xué)研究中的一個(gè)熱門領(lǐng)域[20]。其中，細(xì)胞色素氧化還原酶I(COI)基因具有進(jìn)化速率適中的特點(diǎn)，在頭足類群體遺傳學(xué)研究中得到廣泛的應(yīng)用[21-23]。本研究利用線粒體COI基因序列作為分子標(biāo)記，對(duì)采自中國(guó)沿岸的4個(gè)金烏賊地理群體進(jìn)行研究，以期闡明其群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性現(xiàn)狀，為金烏賊的資源保護(hù)及合理開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)資料和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實(shí)驗(yàn)所用金烏賊樣品于2014-2015年分別采自青島、乳山、日照、舟山，共計(jì)4個(gè)群體117只金烏賊(見(jiàn)圖1，表1)。所有樣品經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后均取肌肉保存于95%酒精溶液中待用。

1.2 提取DNA

取金烏賊肌肉組織約100 mg，經(jīng)蛋白酶K消化后，使用酚-氯仿抽提法提取DNA[24]。

圖1 金烏賊采樣地點(diǎn)圖

表1 金烏賊群體樣品信息及遺傳多樣性指數(shù)

Note:①Sampling sites；②Dates of collection；③Sample sizes；④Number of haplotypes；⑤Haplotype diversity(h)；⑥Nucleotide diversity(π)；⑦M(jìn)ean number of pairwise differences(k)

1.3 PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank上金烏賊序列(No. AB699283.1)設(shè)計(jì)引物SEF: 5’-ACGAAGAGAGTTAGGTAAG-3’; SER: 5’- TGTGAGACAATATGTGAAA-3’。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括1.25 UTaqDNA聚合酶，各種反應(yīng)組分的終濃度為200 nmol/L的正反向引物；200 μmol/L的dNTP，10 mmol/L Tris (pH=8.3)，50 mmol/L KCL和1.5 mmol/L MgCl2；反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3 min；94°C變性45 s，50°C退火45 s，72°C延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min。以上反應(yīng)均設(shè)陰性對(duì)照以排除DNA污染的情況。取2μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(U=5V/cm)，使用回收試劑盒對(duì)目的條帶進(jìn)行回收純化，對(duì)回收純化后的產(chǎn)物送至上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序均采用正反鏈雙向測(cè)序，為保證序列的準(zhǔn)確性，使用Clustal X[25]將測(cè)得的COI基因片段序列進(jìn)行比對(duì)、編輯和分析，并對(duì)結(jié)果輔以人工校正；使用ARLEQUIN v.3.5[26]計(jì)算單倍型數(shù)目、多態(tài)位點(diǎn)、插入/缺失、轉(zhuǎn)換、顛換等遺傳多樣性指數(shù)；同時(shí)通過(guò)軟件ARLEQUIN v.3.5[26]根據(jù)Nei的公式[27]計(jì)算核苷酸多樣度(π)、單倍型多樣度(h)、兩兩序列比對(duì)差異數(shù)(k)以及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 群體遺傳多樣性

所分析的4個(gè)群體共117只金烏賊的線粒體COI基因序列長(zhǎng)度為562 bp，共檢測(cè)到29個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，包括17個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，5處顛換、25處轉(zhuǎn)換。變異多發(fā)生在密碼子第一位點(diǎn)，第二位點(diǎn)僅存在2個(gè)變異位點(diǎn)，第三位點(diǎn)未檢測(cè)到變異位點(diǎn)。核苷酸組成分析結(jié)果顯示，金烏賊COI序列A+T較為豐富，遠(yuǎn)高于C+G的含量(A: 27.57%; T: 36.98%; C: 19.06%; G: 16.38%)。

在117只金烏賊樣品中共檢測(cè)到27個(gè)單倍型。4個(gè)群體中單倍型數(shù)量最少的為RZ群體，單倍型最豐富的為ZS群體，RS和QD群體的單倍型數(shù)均為8個(gè)。其中群體間共享單倍型為7個(gè)，占單倍型總數(shù)的25.9%。僅單倍型3與單倍型5為4個(gè)群體共享。共享單倍型3的金烏賊個(gè)體數(shù)最多，共67個(gè)個(gè)體擁有此單倍型。在20個(gè)獨(dú)享單倍型中，QD群體4個(gè)；RS和RZ群體各3個(gè)；ZS群體10個(gè)。

4個(gè)群體中，青島、乳山、日照群體單倍型多樣度、核苷酸多樣度及兩兩序列比較的平均堿基差異數(shù)較低，其中，舟山群體單倍型多樣度(h=0.956)、核苷酸多樣度(π=0.006)以及兩兩序列比較的平均堿基差異數(shù)(k=3.453)均高于其它3個(gè)群體(見(jiàn)表1)。

2.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)

以虎斑烏賊(Sepiapharaonis)為外群，使用軟件MEGA 5.0[23]基于TrN+G[24]進(jìn)化模型構(gòu)建單倍型鄰接關(guān)系樹(shù)。結(jié)果顯示，虎斑烏賊與金烏賊明顯分開(kāi)，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，譜系結(jié)構(gòu)不明顯，沒(méi)有檢測(cè)到與采樣地點(diǎn)相吻合的分支，即單倍型分支并不與地理分支相對(duì)應(yīng)(見(jiàn)圖2)。單倍型最小跨度樹(shù)也未檢測(cè)到明顯的譜系結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖3)。

圖2 金烏賊單倍型分布及以虎斑烏賊為外群構(gòu)建的金烏賊單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

兩兩群體遺傳分化指數(shù)(FST)經(jīng)過(guò)Bonferroni校正后除RS與QD、RS與RZ群體外，其余均顯著或極顯著。結(jié)果顯示，ZS群體與其他群體之間的FST值(0.186～0.292)遠(yuǎn)高于QD、RS和RZ群體之間的FST值(-0.007～0.039)。此外，確切P檢驗(yàn)的結(jié)果顯示，QD、RS和RZ群體間均存在隨機(jī)交配，而ZS群體與其他群體不存在隨機(jī)交配(見(jiàn)表2)。

(圓圈面積與單倍型頻率成正比，短劃線代表單倍型間的核苷酸替換數(shù)。Sizes of circles were proportional to haplotype frequency. Perpendicular tick marks on the lines joining haplotypes represent the number of nucleotide substitutions.)

表2 金烏賊兩兩群體間遺傳分化指數(shù)(FST)及確切P檢驗(yàn)值結(jié)果Table 2 Pairwise FST (below diagonal) and non-differentiation exact test significance values (above diagonal) among S. esculenta populations

注：*Bonferroni校正后顯著(P<0.05)，**Bonferroni校正后極顯著(P<0.01)。

Note:*P<0.05 after Bonferroni correction ，**P<0.01 after Bonferroni correction.

在進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)時(shí)，先將QD、RS、RZ和ZS四個(gè)群體作為一個(gè)組群進(jìn)行分析，結(jié)果顯示85.15%的遺傳變異來(lái)源于群體內(nèi)個(gè)體間，14.85%的遺傳變異來(lái)源于群體間；將4個(gè)群體按照地理分支進(jìn)行分組，即將地理距離較近的3個(gè)群體QD、RS、RZ組成一組，將ZS群體單獨(dú)分組，結(jié)果顯示大多數(shù)變異來(lái)自群體內(nèi)(71.55%)，組群間的分化較大但不顯著(ΦST=0.285，P>0.05)。

表3 金烏賊群體的AMOVA分析

Note:①Source of variation；②Variance components；③Percentage variation；④One gene pool；⑤Among populations；⑥Within populations；⑦Two gene pools；⑧Among groups；⑨Among populations within groups；⑩Within populations

3 討論

遺傳多樣性是物種分化和生命進(jìn)化的基礎(chǔ)，是物種多樣性的重要組成部分，通常情況下物種的遺傳多樣性水平代表著其對(duì)變化環(huán)境的適應(yīng)能力，它不僅是生物多樣性的內(nèi)在表現(xiàn)形式，還是物種保持進(jìn)化潛能的基本條件，決定著生物多樣性的形成、發(fā)展或多樣性的降低[33]。

群體中單倍型多樣度(h)是評(píng)價(jià)該群體遺傳分化和多態(tài)程度的重要指標(biāo)之一，h值越大，群體遺傳多樣性越高。本研究4個(gè)群體中僅舟山群體單倍型多樣度較高(0.960)，青島、乳山及日照群體單倍型多樣度均較低(0.478～0.536)。Zheng[19]使用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)2004年采自日照的金烏賊群體進(jìn)行遺傳學(xué)研究，結(jié)果顯示日照群體處于較高的遺傳多樣性，與我們的研究結(jié)果相悖，這可能與大規(guī)模的金烏賊增殖放流相關(guān)。通常，用于繁育增殖放流苗種的親體數(shù)量有限，人工繁育苗種的遺傳多樣性較野生群體低，被投入自然海域的放流苗種通過(guò)與野生群體之間的基因交流從而降低野生群體的遺傳多樣性。近年來(lái)，大量人工繁育的金烏賊苗種被投入山東沿岸海域，自然海域的野生金烏賊群體因此受到影響。相反，至今尚未有關(guān)于浙江省沿岸海域金烏賊增殖放流的相關(guān)報(bào)道，金烏賊資源的補(bǔ)充依靠自然群體，種群相對(duì)穩(wěn)定，其單倍型多樣度和核苷酸多樣度處于較高水平。因此，在以后的金烏賊增殖放流工作中，應(yīng)當(dāng)注意繁育過(guò)程中親本數(shù)量。

通過(guò)構(gòu)建以虎斑烏賊為外群的單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出，金烏賊各群體間互相混雜，沒(méi)有顯示出明顯的譜系結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)并未出現(xiàn)與采樣地點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的分支。同樣，單倍型最小跨度樹(shù)中也未檢測(cè)到明顯的譜系結(jié)構(gòu)。

生物種群遺傳分化主要決定于種群內(nèi)的遺傳漂變與種群間的基因流的動(dòng)態(tài)平衡。Wright[34]提出的遺傳分化理論認(rèn)為：當(dāng)遺傳分化指數(shù)(FST)的值介于0～0.05之間表示種群間遺傳分化程度低；0.05～0.15為分化程度中等；0.15～0.25為分化程度高；大于0.25表明種群遺傳分化程度極大。本研究各群體間遺傳分化指數(shù)FST值顯示，舟山群體與山東沿岸的3個(gè)群體之間遺傳分化較大，而山東沿岸的3個(gè)群體之間遺傳分化較小。同時(shí)，確切P檢驗(yàn)的結(jié)果也顯示，舟山群體與其它3個(gè)群體間不存在隨機(jī)交配現(xiàn)象，說(shuō)明舟山群體與山東沿岸金烏賊群體之間基因流動(dòng)較弱。這可能與金烏賊的生活習(xí)性有關(guān)，金烏賊為一年生頭足類，喜集群，卵為沉性，游泳能力較弱，僅每年8—11月幼體自沿岸產(chǎn)卵場(chǎng)向越冬場(chǎng)進(jìn)行越冬洄游，次年4—5月達(dá)到性成熟的成體自越冬場(chǎng)向產(chǎn)卵場(chǎng)做生殖洄游。有學(xué)者報(bào)道東海、黃海金烏賊的越冬場(chǎng)大致可分為：對(duì)馬島西南海域、黃海中部海域和臺(tái)灣北部海域[8]。舟山群體與其他群體的在地理位置上相距較遠(yuǎn)，同時(shí)舟山群體的越冬場(chǎng)可能不用于其他3個(gè)群體，以至于舟山群體無(wú)論在產(chǎn)卵期還是越冬期都與其他3個(gè)群體沒(méi)有交流，導(dǎo)致舟山群體與其他群體遺傳分化較大。而青島、乳山和日照地理位置較近，群體間交流頻繁，此外，由于近年來(lái)山東省大規(guī)模開(kāi)展金烏賊增殖放流活動(dòng)，各地之間金烏賊苗種的交易導(dǎo)致山東沿岸海域的金烏賊群體相互混雜，山東沿岸的3個(gè)群體遺傳分化較小。

4 結(jié)語(yǔ)

山東沿岸的金烏賊資源經(jīng)過(guò)增殖放流的養(yǎng)護(hù)與補(bǔ)充，資源量得到一定程度的恢復(fù)，但種群的遺傳多樣性顯著降低，這將會(huì)降低野生金烏賊的環(huán)境適應(yīng)能力以及抵御病害的能力。因此，在金烏賊資源養(yǎng)護(hù)工作中，應(yīng)當(dāng)注意資源增殖對(duì)野生種群的遺傳學(xué)影響，通過(guò)增加繁殖親本數(shù)量以提高放流苗種的遺傳多樣性。

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責(zé)任編輯 朱寶象

Genetic Variation of DifferentSepiaesculentaPopulations in China Coastal Waters Based on Mitochondrial COI Gene Analysis

SHAN Bin-Bin1, SONG Na1, LIU Shu-De2, TU Zhong2, WANG Xiao-Mei3, 4, GAO Tian-Xiang5, HAN Zhi-Qiang5, ZHANG Xiu-Mei1

(1. College of Fisheries, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Shandong Hydrobios Resources Conservation and Management Center, Yantai 264003, China; 3. Resources and Eco-environmental Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Beijing 100141, China; 4. Scientific Observing and Experimental Station of Fishery Remote Sensing of Ministry of Agriculture, Chinese Academy of Fishery Sciences, Beijing 100141, China; 5. College of Fisheries, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China)

Mitochondrial COI gene fragment ofSepiaesculentafrom Rushan, Qingdao, Rizhao and Zhoushan were sequenced. A total of 27 haplotypes were detected in 117 individuals. The haplotype diversity and nucleotide polymorphism indexesranged from 0.478 to 0.956 and from 0.001 to 0.006, respectively. The results indicated thatS.esculentafrom Zhoushan had a higher genetic diversity than other populations. The genetic differentiation index (Fst) showed that genetic differentiation among Rushan, Qingdao and Zhoushan populations ranged from -0.007 to 0.039 while the genetic differentiation between Zhoushan population and others were relatively larger, ranging from 0.186 to 0.292. The results of AMOVA also revealed that there were two groups, populations along the coast of Shandong Province (Rushan, Qingdao and Rizhao) and Zhoushan. The results clarified the loss of genetic diversity of wildS.esculentapopulations along the coast of Shandong Province. The long-term extensive hatchery releasing program might have affected the genetic diversity of wildS.esculentapopulations.

Sepiaesculenta; COI gene; genetic diversity; genetic structure; stock enhancement

農(nóng)業(yè)部漁業(yè)遙感科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站開(kāi)放課題項(xiàng)目(OFSOESFRS201506);國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41676153)資助 Supported by Scientific observing and experimental Station of fishery remote sensing, Ministry of Agriculture (OFSOESFRS201506);National Natural Science Foundation of China (41676153)

2016-08-01；

2016-11-10

單斌斌(1993-)，男，博士生，研究方向：漁業(yè)資源增殖學(xué)。E-mail:shanbinbin@yeah.net

?? 通訊作者：E-mail：xiumei1227@163.com

S931.5

A

1672-5174(2017)05-050-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20160277

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