摘 要：從中溫乳化香腸中篩選出一株凝結芽孢桿菌芽孢，以20 種氨基酸、D-果糖、D-葡萄糖、氯化鉀為萌發(fā)劑，通過相差顯微鏡及生長曲線測定儀測定600 nm波長下光密度值，研究該芽孢萌發(fā)規(guī)律，同時研究7 種防腐劑對芽孢萌發(fā)效果影響及不同溫度熱脅迫處理后的芽孢致死率。結果表明：葡萄糖可以促進凝結芽孢桿菌芽孢萌發(fā)，增大其濃度對芽孢萌發(fā)率無影響；繪制了芽孢萌發(fā)率標準曲線，相關系數(shù)為0.977 8；亞硝酸鈉、山梨酸鉀、乳酸鏈球菌素（nisin）和脫氫乙酸鈉對芽孢萌發(fā)無影響，乳酸鈉、葡萄糖酸-δ-內酯和雙乙酸鈉可以抑制芽孢萌發(fā)；采用90 ℃及95 ℃對芽孢熱脅迫致死效果較差，100 ℃熱處理最高致死率可達92.09%，105～120 ℃熱脅迫處理對該芽孢致死率在15 min內可以接近100%。

關鍵詞：凝結芽孢桿菌芽孢；芽孢萌發(fā)；生長規(guī)律；熱脅迫；致死率；防腐劑

Abstract： The spore germination of a Bacillus coagulans stain isolated from medium-temperature sterilized emulsified sausage was investigated using 20 amino acids， D-fructose， D-glucose and potassium chloride as germination inducers by phase contrast microscopic morphology observation and measurement of optical density （OD） values at 600 nm with a Bioscreen growth analyzer. Also， we examined the effect of seven preservatives on spore germination and we evaluated spore inactivation after heat treatment at different temperatures. Results showed that glucose could promote the germination of Bacillus coagulans spore， and the spore germination percentage did not changed with increasing glucose concentration. A standard curve with a correlation coefficient of 0.977 8 was established to determine the spore germination percentage. Sodium nitrite， potassium sorbate， nisin and dehydrogenation sodium acetate had no effects on spore germination， whereas sodium lactate， glucose acid-δ-lactone and sodium acetate could inhibit spore germination. When treated at 100 ℃， the inactivation percentage was up to 92.09%， and at 105–120 ℃， the value was almost 100% within 15 min； however， the spores were not effectively inactivated at 90 and 95 ℃.

Key words： Bacillus coagulans spore； spore germination； growth pattern； heat stress； inactivation percentage； preservative

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201704003

中圖分類號：TS251.1 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2017）04-0010-07

引文格式：

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凝結芽孢桿菌是一種可以產生乳酸的芽孢桿菌，它同時具有芽孢桿菌及乳酸菌的特性，還具有調節(jié)動物腸道健康、提高免疫力等特點，因此凝結芽孢桿菌在飼料中的應用研究逐漸增加[1]。但是，在肉制品加工與保藏過程中凝結芽孢桿菌的大量繁殖則會導致產品腐敗變質。隨著人們對肉制品食用品質需求的提高，中溫肉制品逐漸成為肉制品市場的焦點，中溫肉制品是指在一定壓力下，經(jīng)過90～110 ℃殺菌，結合綜合抑菌和品質控制技術生產的肉制品[2]。中溫殺菌過程中大部分微生物會被殺死，但細菌的芽孢及部分耐熱菌等仍能存活下來，逐漸生長為中溫肉制品的腐敗菌[3]。系列研究發(fā)現(xiàn)，眾多真空包裝低溫肉制品中主要腐敗菌為乳酸菌，包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）等[4-8]。

芽孢桿菌的芽孢可以長時間保持休眠狀態(tài)，一旦遇到適宜的環(huán)境，芽孢即可迅速萌發(fā)成為具有代謝功能的營養(yǎng)細胞，從而降低對外界刺激的耐受力[9-10]。芽孢可以通過多種刺激因素誘導萌發(fā)，包括糖、氨基酸等營養(yǎng)刺激萌發(fā)，也可以通過物理刺激如加熱、高壓等刺激誘導部分芽孢萌發(fā)等[11-12]。防腐劑常用于肉制品加工中，具有顯著的抑菌保鮮作用，防腐劑對細菌營養(yǎng)體抑制作用研究較多，但其對芽孢萌發(fā)及生長特性的研究較少，國外也僅有少數(shù)關于耐熱芽孢桿菌及梭狀芽胞桿菌等有限菌株的芽孢的報道[13-16]，而國內相關研究更是空白，僅有少數(shù)學者研究抑菌劑對芽孢的耐熱性影響[17]。目前認為，微生物會呈現(xiàn)死亡、受損和未受損3 種狀態(tài)，受損細胞通常又被稱為亞致死細胞，細胞受損后在適宜的環(huán)境下又可以恢復其活力，從而影響食品保藏品質[18]。對于細菌亞致死損傷的研究多集中于大腸埃希氏菌、沙門氏菌、單增李斯特菌等食源性病菌[19-20]，對于芽孢桿菌的亞致死損傷鮮有報道。

凝結芽孢桿菌是一種特殊的乳酸菌，多數(shù)研究將其作為有益菌進行研究[21-22]，而在中溫乳化香腸貯藏中則是主要腐敗菌，它形成的芽孢具有良好耐熱性，對于凝結芽孢桿菌芽孢營養(yǎng)萌發(fā)特性還未見報道，國外也僅有少數(shù)關于溫度及高壓處理對凝結芽孢桿菌芽孢滅活動力學的研

究[23-26]。本實驗以前期從中溫乳化香腸中篩選的凝結芽孢桿菌芽孢為研究對象，分析營養(yǎng)劑和抑菌劑對其萌發(fā)特性的影響及熱脅迫下的致死率，結合促芽孢萌發(fā)技術及其熱脅迫下的生長規(guī)律，研究該腐敗菌的快速萌發(fā)殺滅技術，以期為中溫肉制品生產提供有效的腐敗微生物控制技術，為中溫肉制品加工條件的控制和保鮮技術提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凝結芽孢桿菌CMRC BC-1 由本實驗室人員從中溫乳化香腸篩分后鑒定保藏[27]；D-葡萄糖（D-glucose）（記為G）、D-果糖（D-fructose）（記為F）、氯化鉀（KCl）（記為K）、MnSO4·H2O、氨基酸 北京化學試劑廠；營養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、平板計數(shù)培養(yǎng)基 北京陸橋技術有限責任

公司；乳酸鏈球菌素（nisin）、亞硝酸鈉、乳酸鈉

北京迪朗生化科技有限公司；山梨酸鉀、脫氫乙

酸鈉 南通奧凱生物技術開發(fā)有限公司；葡萄糖酸-δ-內酯

安徽省興宙醫(yī)藥食品有限公司；雙乙酸鈉 連云港信仁食品添加劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Bioscreen全自動生長曲線分析儀 上海謂載商貿發(fā)展有限公司；生物安全柜 新加坡Esco公司；Primo Star生物顯微鏡配備DDC數(shù)顯通道 德國蔡司公司；G154DWS濕熱滅菌鍋 日本三洋公司；KB720培養(yǎng)箱 德國Binder公司；DF-101S磁力攪拌恒溫油浴鍋 上海力辰科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芽孢培養(yǎng)與制備收集

參考文獻[28]中方法并進行適當調整。將保藏的凝結芽孢桿菌經(jīng)液體培養(yǎng)基活化后接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入0.05 mol/L的MnSO4·H2O以促進芽孢生成。將接菌的平板于40 ℃條件下培養(yǎng)至有90%以上芽孢釋放后收集，一般為4～6 d。用無菌水將形成的芽孢菌體收集后在80 ℃條件下加熱30 min以殺滅營養(yǎng)體，將收集的菌懸液用無菌水在6 000×g、4 ℃條件下離心4～8 次，每次15 min，以洗去大部分營養(yǎng)體細胞，離心完成后用少量無菌水重新制成芽孢懸液，使用相差顯微鏡觀察細菌芽孢、營養(yǎng)體及其碎片。調整芽孢懸液濃度至1010 CFU/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 芽孢營養(yǎng)萌發(fā)處理及萌發(fā)率測定

取制備好的芽孢懸液適當稀釋，充分振蕩后等量分裝于離心管中，6 000×g離心3 min，去掉上清液，然后分別加入等體積的50 mmol/L的G、F、K及20 種氨基酸的營養(yǎng)液，營養(yǎng)液采用無菌水配制，使用前經(jīng)0.45 μm無菌濾膜過濾，對照組加入滅菌水，充分振蕩。將新制的芽孢懸液分為2 份，1份在40 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并在相差顯微鏡下觀察其萌發(fā)情況，每20 min鏡檢1 次，確定其萌發(fā)情況，鏡檢時每個條件制取3 個玻片進行觀測，每個玻片上取四角及中心5 個點；另1份同時采用生長曲線測定儀在40 ℃條件下監(jiān)測其在600 nm波長處的光密度（optical delnsity，OD）值變化，OD值每5 min測定1 次，每個點取5 個平行，各數(shù)值取平均值，根據(jù)鏡檢結果計數(shù)萌發(fā)率并通過與OD值的降低比率的關系繪制芽孢萌發(fā)標準曲線。芽孢鏡檢萌發(fā)率計算見式（1），OD值降低比率計算見式（2）。

1.3.3 防腐劑對芽孢抑制作用的處理方法

根據(jù)國標GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》[30]中防腐劑的使用限量規(guī)定，實驗采用肉制品中使用的最高添加質量濃度，測定不同防腐劑對芽孢萌發(fā)情況的影響，將稀釋到適宜濃度的芽孢懸液等體積分裝于不同管中，實驗組分別加入相同量的萌發(fā)劑與1 種防腐劑混合液，對照組只添加萌發(fā)劑，每管溶劑總添加量相同，通過在40 ℃條件下培養(yǎng)觀察OD值變化確定其對芽孢萌發(fā)效果影響。防腐劑配制：稱取相應質量的7 種防腐劑（精確到0.001），使用無菌水溶解配制，使用前經(jīng)0.45 μm無菌濾膜過濾。防腐劑使用質量濃度見表1。

1.3.4 芽孢生長曲線的繪制

采用MRS肉湯培養(yǎng)基為基質，使用全自動生長曲線分析儀通過測定600 nm波長下OD值的變化，繪制芽孢生長曲線，研究其生長規(guī)律。

1.3.5 不同溫度熱脅迫處理芽孢

取適當稀釋的芽孢懸液，充分振蕩后等體積分裝于含10 mL液體培養(yǎng)基的試管中，研究已萌發(fā)芽孢耐熱性規(guī)律，分別于90、95、100、105、110、115、120 ℃油浴下加熱0、10、15、20、25、30、35、40 min，之后放入冰水浴迅速冷卻，對照組在相同加熱條件冷卻后接入相同量芽孢，通過平板計數(shù)法測定芽孢菌落總數(shù)[29]，計算芽孢熱致死率，并采用全自動生長曲線分析儀測定其生長曲線，研究不同溫度及不同熱脅迫時間對芽孢致死規(guī)律影響，重復3 次取平均值。芽孢致死率計算如式（3）所示。

由表2可知，該凝結芽孢桿菌芽孢僅有葡萄糖可以促進其萌發(fā)。芽孢萌發(fā)過程需要芽孢內膜上的受體蛋白作用，一般稱之為萌發(fā)受體（germinant receptor，GR）。通過受體蛋白與萌發(fā)劑的特異性結合從而誘發(fā)芽孢萌發(fā)過程。有學者對枯草芽孢桿菌等菌株的芽孢萌發(fā)特性研究中發(fā)現(xiàn)，L-丙氨酸是促進芽孢萌發(fā)的必要營養(yǎng)劑，主要由于其內膜含有GerA、GerB和GerK三類萌發(fā)受體，其中GerA可以與L-丙氨酸結合誘導芽孢萌發(fā)，可見，不同菌種間芽孢萌發(fā)特性不同[31]。

2.2 葡萄糖誘導芽孢萌發(fā)特性及標準曲線

圖2為芽孢懸液中加入萌發(fā)劑后在40 ℃條件下測定其萌發(fā)期間OD值變化，未萌發(fā)的芽孢不具透光性，隨著芽孢萌發(fā)為營養(yǎng)體其折光性消失從而透光性增強，吸光度也逐漸降低。未加萌發(fā)劑的芽孢懸液其OD值基本保持不變，加入萌發(fā)劑后在20 min開始出現(xiàn)OD值降低，結合鏡檢發(fā)現(xiàn)此時有少數(shù)芽孢開始萌發(fā)，當培養(yǎng)時間達180 min時OD值基本穩(wěn)定不變，說明芽孢基本萌發(fā)完全，通過鏡檢驗證發(fā)現(xiàn)芽孢萌發(fā)率在95%以上，最高達到98.86%。萌發(fā)率未達到100%可能是由于極少數(shù)芽孢具有較強抗性，很難萌發(fā)，通常稱其為“超級芽孢”。超級芽孢形成的確切原因還未確定，但部分研究表明，可能是由于部分芽孢個體缺少特定數(shù)量萌發(fā)受體，或受體蛋白表達過程中出現(xiàn)個別變異情況導致萌發(fā)受體種類及數(shù)量缺失，從而使得超級芽孢萌發(fā)過程會長時間滯后甚至永久不萌發(fā)[32]。

以50 mmol/L的葡萄糖溶液作為芽孢促萌發(fā)營養(yǎng)劑，將稀釋到適宜濃度的芽孢懸液分別在40 ℃條件下培養(yǎng)測定OD值并鏡檢觀察其萌發(fā)率，以鏡檢萌發(fā)率為橫坐標，以OD值降低率為縱坐標繪制標準曲線，獲得的標準曲線為y=0.633x-14.454，相關系數(shù)為0.977 8，說明可以使用芽孢液OD值的降低率來代替鏡檢測定芽孢萌發(fā)率，從而降低通過鏡檢計數(shù)萌發(fā)率的繁瑣度。研究中發(fā)現(xiàn)，當OD值降低45%時芽孢萌發(fā)率可達到95%，當OD值降低50%時可以認為芽孢萌發(fā)率接近100%。

由圖3可知，對照組OD值基本不變，說明芽孢沒有萌發(fā)，而添加葡萄糖后芽孢在180 min左右OD值基本不變說明芽孢基本萌發(fā)完全。使用較低濃度葡萄糖時OD值到終點時降低率略低于中、高濃度葡萄糖溶液，可能是由于其含量過低，致使少量芽孢未能萌發(fā)。從萌發(fā)時間上看，使用高濃度的葡萄糖溶液誘導芽孢萌發(fā)時間僅略微提前幾分鐘，說明芽孢萌發(fā)過程需要特定時間，增加萌發(fā)劑的濃度并不能明顯加速萌發(fā)過程，可能與芽孢萌發(fā)需要膜中蛋白受體作用，而作用時間是固定的相關。

2.3 防腐劑對芽孢萌發(fā)效果影響

由圖4可知，使用乳酸鈉、葡萄糖酸-δ-內酯和雙乙酸鈉分別單獨加入到芽孢萌發(fā)體系中時，初始OD值明顯低于其他組，這是由于這3 種防腐劑的加入致使芽孢出現(xiàn)抱團現(xiàn)象，從而不能均勻地分散到液體中導致OD值偏低，在培養(yǎng)過程中OD值也沒有明顯降低現(xiàn)象，說明芽孢沒有萌發(fā)，通過鏡檢驗證發(fā)現(xiàn)芽孢確實沒有萌發(fā)；含雙乙酸鈉的萌發(fā)體系中在50 min時OD值有小幅降低，說明部分芽孢萌發(fā)；分別含亞硝酸鈉、山梨酸鉀、乳酸鏈球菌素和脫氫乙酸鈉的萌發(fā)體系中芽孢正常萌發(fā)，加入山梨酸鉀在培養(yǎng)50 min時可以一定程度上加速芽孢的萌發(fā)，其機理還有待驗證。國外一些學者研究中發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌素[33-35]不能抑制芽孢的萌發(fā)，但可以抑制已萌發(fā)芽孢的生長，而山梨酸鉀[14]對芽孢萌發(fā)及生長均有抑制作用，這與本研究結果有一定差異，可能是由于不同菌種芽孢差異性所致。

2.4 凝結芽孢桿菌芽孢生長規(guī)律

圖5為采用MRS肉湯培養(yǎng)基為基質測定的芽孢生長曲線圖，在40 ℃培養(yǎng)條件下芽孢在0～5 h內為生長延滯期，5～14 h內為生長對數(shù)期，OD值從0.245升至0.996，14 h之后進入穩(wěn)定期。前期研究[27]表明，篩選出的該凝結芽孢桿菌營養(yǎng)菌體在培養(yǎng)2 h后進入生長對數(shù)期，并持續(xù)到12 h，而本研究中對其芽孢生長曲線研究發(fā)現(xiàn)進入生長對數(shù)期的時間延后約3 h，因為芽孢在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)期間需要先完成萌發(fā)過程變?yōu)闋I養(yǎng)體細胞，然后才開始正常的細菌生長過程。

2.5 不同熱脅迫溫度對芽孢致死規(guī)律影響

細菌的營養(yǎng)細胞在70～80 ℃時10 min就死亡，而芽孢形成后由于有致密的芽孢壁，內部含有豐富的2，6-吡啶二羧酸及耐熱小分子酶類，因此具有較高的耐熱性，芽孢萌發(fā)形成營養(yǎng)細胞時2，6-吡啶二羧酸釋放到體外，孢子壁也變?yōu)榧毎趶亩鴨适蜔嵝浴?/p>

由圖6可知，采用90 ℃和95 ℃處理的芽孢隨加熱時間延長對芽孢致死效果緩慢提高，加熱到40 min時致死率分別為47.55%、54.18%，說明即便是已經(jīng)萌發(fā)的芽孢液在其成長為完全的營養(yǎng)體前也具有較高耐熱性，在90 ℃和95 ℃熱脅迫下短時間內殺滅效果不理想。當熱脅迫溫度為100℃時，處理時間低于15 min對其芽孢致死率也比較低，當時間繼續(xù)延長到25 min時致死率達83.48%，繼續(xù)加熱最終芽孢致死率在92.09%。當熱脅迫溫度升高到105 ℃的時候，20 min內芽孢致死率迅速上升接近100%，而采用110 ℃處理則在15 min內致死率接近100%。115 ℃條件下熱處理10 min對芽孢致死率高達89.66%，15 min后接近100%；采用120 ℃高溫脅迫處理時10 min就幾乎殺滅全部芽孢菌體。

圖7～10為凝結芽孢桿菌分別在95、100、105、110 ℃條件下熱處理不同時間后生長曲線。

正常芽孢培養(yǎng)5 h即進入生長對數(shù)期，當熱脅迫溫度為90 ℃時加熱不同時間后芽孢生長曲線幾乎重合且與對照組并無明顯差異。采用115 ℃及120 ℃處理的芽孢在45 h內除10 min熱處理的芽孢外幾乎不生長，故圖未列出。95 ℃處理的芽孢即使經(jīng)歷40 min處理其達到生長對數(shù)期的時間也僅延長3 h，說明活體菌數(shù)依舊很高；采用100 ℃處理的芽孢熱脅迫時間每延長5 min其達到對數(shù)期的時間也延長約3 h，當加熱時間到35 min及40 min時生長對數(shù)期延長約15 h，且兩者間差異較小，與致死率結果一致；當熱處理溫度為105 ℃時加熱10 min后芽孢進入對數(shù)期的時間明顯推遲5 h，隨著加熱時間延長進入對數(shù)期的時間也逐漸推遲；采用110 ℃加熱10 min芽孢進入對數(shù)期的時間已推遲10 h，加熱40 min的芽孢進入對數(shù)期時間推遲達20 h。

綜上可以看出，90～100 ℃的熱脅迫處理對芽孢致死效果及存活芽孢生長抑制效果一般，且較長時間的加熱若應用于產品加工制作不利于產品品質及能源節(jié)約，采用105 ℃及110 ℃的中溫刺激條件雖然不能達到115～120 ℃的高溫滅菌效果，但也可以大幅提高對芽孢桿菌的滅菌效果。

3 結 論

凝結芽孢桿菌的芽孢在培養(yǎng)基中40 ℃培養(yǎng)條件下經(jīng)歷約5 h進入生長對數(shù)期，14 h后進入平穩(wěn)期，進入對數(shù)期的時間較菌體直接培養(yǎng)遲滯3 h，呈典型S形生長曲線。該菌株對葡萄糖有良好的萌發(fā)效應，在20 min內即開始萌發(fā)。亞硝酸鈉、山梨酸鉀、乳酸鏈球菌素和脫氫乙酸鈉4 種防腐劑不能阻礙葡萄糖對芽孢的萌發(fā)促進效果，結合前期研究，使用少量的乳酸鏈球菌素即可對該凝結芽孢桿菌抑制率達99%，綜合研究來看，說明乳酸鏈球菌素對該菌株的芽孢萌發(fā)沒有抑制作用，即在有乳酸鏈球菌素的存在下該菌的芽孢可以通過葡萄糖誘導萌發(fā)成長為營養(yǎng)細胞，然后乳酸鏈球菌素可以抑制營養(yǎng)細胞繼續(xù)增殖，從而發(fā)揮其抑菌作用；山梨酸鉀可以一定程度上加快芽孢萌發(fā)過程，這為中溫肉制品生產中防腐劑復合使用提供參考。從熱脅迫處理對凝結芽孢桿菌芽孢研究中發(fā)現(xiàn)，對于剛萌發(fā)的凝結芽孢桿菌仍有較高耐熱性，可耐受105 ℃短時高溫，但在110 ℃條件下可以有效殺滅已萌發(fā)芽孢。

從本研究可以發(fā)現(xiàn)，通過特定營養(yǎng)劑誘導芽孢萌發(fā)，但肉制品中微生物體系較為復雜，其實際應用效果及其他種類芽孢桿菌芽孢誘導萌發(fā)研究仍需進一步探究。

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