楊祎程，張國權(quán)，張元來，劉立軍，張 亮，田啟會，張進(jìn)隆

（1.甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，武威 733006；2.甘肅省武威市畜牧獸醫(yī)局，武威 733000）

曲子宮絳蟲染色標(biāo)本的制作和生殖器官觀察

楊祎程1，張國權(quán)1，張元來2，劉立軍1，張 亮1，田啟會1，張進(jìn)隆1

（1.甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，武威 733006；2.甘肅省武威市畜牧獸醫(yī)局，武威 733000）

為了研究曲子宮絳蟲的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生殖器官的變化規(guī)律，用H.E染色法制作曲子宮絳蟲的染色標(biāo)本，對傳統(tǒng)的染色方法進(jìn)行了改進(jìn)，制作出結(jié)構(gòu)清晰、顏色鮮艷的曲子宮絳蟲標(biāo)本，在光學(xué)顯微鏡下觀察到該絳蟲成節(jié)中雌雄生殖系統(tǒng)、排泄系統(tǒng)以及孕節(jié)中的子宮和蟲卵結(jié)構(gòu)。該研究可為該曲子宮絳蟲形態(tài)學(xué)蟲種鑒定和生殖器官變化規(guī)律增添新資料，為本病的確診提供參考依據(jù)。

曲子宮絳蟲；生殖器官；蘇木素染色

曲子宮絳蟲隸屬于扁形動物門絳蟲綱，多節(jié)絳蟲亞綱，圓葉目，裸頭科，該屬絳蟲為大型絳蟲，體長可達(dá)4.3m，常寄生于綿羊、山羊、黃牛、牦牛等反芻動物的小腸中。一條完整的絳蟲由頭節(jié)、頸節(jié)和體節(jié)3部分組成，生殖系統(tǒng)和排泄系統(tǒng)是曲子宮絳蟲比較重要的結(jié)構(gòu)［1］。關(guān)于莫尼茨絳蟲的形態(tài)學(xué)研究和染色方法報道很多，但對曲子宮絳蟲形態(tài)學(xué)的研究和染色方法的研究報道很少。本實驗以甘肅省天祝地區(qū)高山細(xì)毛羊小腸中采集到的曲子宮絳蟲為材料，采用H.E染色法制作曲子宮絳蟲的染色標(biāo)本，對傳統(tǒng)的染色方法做了改進(jìn)，制作了結(jié)構(gòu)清晰、顏色鮮亮、不易褪色的曲子宮絳蟲的染色標(biāo)本。在光學(xué)顯微鏡下觀察到該絳蟲幼節(jié)中可見排泄系統(tǒng)和萌芽狀態(tài)的生殖系統(tǒng)；成節(jié)中發(fā)育完成的雌雄生殖系統(tǒng)和排泄系統(tǒng)；孕節(jié)中子宮和蟲卵的結(jié)構(gòu)。該研究可為該蟲體在形態(tài)學(xué)蟲種鑒定和生殖器官變化規(guī)律增添新資料，為本病的確診提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲種

實驗用曲子宮絳蟲采自甘肅省天?？h牛羊定點屠宰場1歲齡高山細(xì)毛羊的小腸中。

1.2 試劑和儀器

蘇木素精，酒精，銨明礬，甘油，甲醇，二甲苯，加拿大樹膠，載玻片，蓋玻片，Olympus光學(xué)顯微鏡照相系統(tǒng)，等等。

1.3 方法

1.3.1 蟲體的處理 將采集的綿羊絳蟲先用自來水沖洗3次，再用生理鹽水漂洗浸泡，后將完整的蟲體從頭節(jié)開始剪成2 cm左右的小段，依次按1-1、1-2、1-3…的編號方法編號，將樣品分別用70%乙醇固定，用于制片。

1.3.2 絳蟲染色標(biāo)本制作 將選取的絳蟲節(jié)段壓入兩潔凈的載玻片中間，為了不使蟲體壓得過薄，可在載玻片兩端墊以適當(dāng)厚度的紙片，用線繩扎緊載玻片兩端，投入70%酒精中固定24～48 h，然后用蘇木素-伊紅（H.E染色法）染色法染色。具體步驟：①酒精洗脫：將壓片固定好的蟲體投入梯度酒精中，50%酒精，10 min→30%酒精，10 min→蒸餾水，10 min；②染色：蘇木素染色液30 min→用蒸餾水漂洗10min；③分色：用1%鹽酸溶液分化10～20 s；④染色：水伊紅染液10 min；⑤脫水：80%酒精，5 min→90%酒精，10min→95%酒精，10min，100%酒精Ⅰ，10min→100%酒精Ⅱ，10 min；⑥透明：苯酒精（1∶1），10 min→二甲苯，10 min；⑦封固：加拿大樹膠封固。

1.3.3 實驗用絳蟲染色標(biāo)本的制作 將1.3.2中得到的染色標(biāo)本在光學(xué)顯微鏡下觀察，根據(jù)其形態(tài)特征，確定所采得的絳蟲的種類，確定曲子宮絳蟲對應(yīng)的編號，將所有曲子宮絳蟲從頭節(jié)至孕節(jié)的樣品用H.E染色法制作染色標(biāo)本。

2 結(jié)果

2.1 曲子宮絳蟲寄生部位

曲子宮絳蟲寄生于高山細(xì)毛羊空腸前段的小腸黏膜上（見圖1-1）。

2.2 外部形態(tài)的觀察

曲子宮絳蟲成蟲蟲體呈背腹扁平的帶狀，乳白色，蟲體長2.7 m，幼節(jié)寬0.3～0.8 mm，成節(jié)寬4.0～10.0 mm，孕節(jié)寬8.0～15.0 mm。頭節(jié)小，呈圓球形；頸節(jié)在頭節(jié)之后，比頭節(jié)細(xì)而薄，幼節(jié)細(xì)而薄，成節(jié)比幼節(jié)寬，也較厚，孕節(jié)寬而厚，每個節(jié)片呈上窄下寬的梯形。

2.3 染色標(biāo)本形態(tài)觀察

用H.E染色法染制的標(biāo)本在光學(xué)顯微鏡下觀察，曲子宮絳蟲成蟲頭節(jié)呈紫紅色，4個近圓形吸盤位于頭節(jié)前端的側(cè)面，均勻排列；頸節(jié)呈紫紅色，分節(jié)很細(xì)，排泄管清晰可見，看不到生殖系統(tǒng)器官（圖1-2）；幼節(jié)呈紫紅色，排泄管清晰可見，生殖系統(tǒng)可見萌芽狀態(tài)卵巢、卵模、卵黃腺、睪丸等生殖器官均未發(fā)育成熟（圖1-3，圖1-4）；成節(jié)內(nèi)有一組生殖器官，無規(guī)律地分布于節(jié)片一側(cè)，生殖孔開口于生殖器官分布的一側(cè)，卵巢和卵黃腺在節(jié)片一側(cè)構(gòu)成菜花狀結(jié)構(gòu)，將卵模圍在中間，子宮出現(xiàn)開始發(fā)育，呈彎曲狀，位于兩縱排泄管的內(nèi)側(cè)，分布于節(jié)片前緣，睪丸數(shù)百個，分布于節(jié)片兩側(cè)縱排泄管之外（圖1-5）；孕節(jié)有排泄管，生殖系統(tǒng)中卵巢、卵模、卵黃腺、睪丸等生殖器官已逐漸退化，子宮中充滿蟲卵占據(jù)了整個節(jié)片（圖1-6），子宮中的蟲卵逐漸發(fā)育成熟。

圖1 曲子宮絳蟲染色標(biāo)本形態(tài)觀察

2.4 生殖器官變化規(guī)律觀察

曲子宮絳蟲生殖系統(tǒng)從幼節(jié)開始分化，最初每個節(jié)片中央有一深色橢圓形的陰影，是生殖器官的萌芽，尚未出現(xiàn)雌、雄的性別特征（圖2-1），隨著發(fā)育節(jié)片位置向后生殖器官萌芽無規(guī)律的向節(jié)片的一側(cè)逐漸移動（圖2-2），生殖系統(tǒng)橢圓形的萌芽逐漸變大，顏色變深。接著雌、雄生殖系統(tǒng)繼續(xù)發(fā)育，在同一節(jié)片中，有生殖孔側(cè)睪丸出現(xiàn)比無生殖孔側(cè)要遲（見圖2-3）。雌性生殖系統(tǒng)中，首先出現(xiàn)生殖腔、卵模和卵黃腺，卵巢從小逐漸變大，與卵黃腺構(gòu)成菜花狀結(jié)構(gòu)（圖2-4），隨著節(jié)片位置向后，這個結(jié)構(gòu)逐漸變大，至此絳蟲成節(jié)發(fā)育完全（圖2-5）。在孕節(jié)發(fā)育過程中，隨著節(jié)片向后延伸，彎曲的子宮開始出現(xiàn)，睪丸最先退化，爾后是卵巢，再是卵黃腺退化，卵模最后退化，節(jié)片內(nèi)僅能看到發(fā)達(dá)的子宮中充滿蟲卵，至此絳蟲孕節(jié)發(fā)育完 全（圖2-6）。

圖2 曲子宮絳蟲發(fā)育變化規(guī)律

3 討論

本研究以天祝高山細(xì)毛羊小腸內(nèi)寄生的曲子宮絳蟲為實驗材料，用H.E染色法制作了結(jié)構(gòu)清晰、顏色鮮亮、不易褪色的曲子宮絳蟲的染色標(biāo)本，并在光學(xué)顯微鏡下觀察了該絳蟲的縱排泄管、雌雄生殖器官等結(jié)構(gòu)，為該絳蟲形態(tài)學(xué)研究和蟲體鑒定添加了新的參考資料。

絳蟲的染色方法有很多種。裘學(xué)麗等［2］采用齊爾石碳酸復(fù)紅染液對人體內(nèi)的帶絳蟲成蟲進(jìn)行染色制片效果很好。奚琳琳等［3］和紀(jì)偉華等［4］采用孔雀綠染色法對人體內(nèi)帶絳蟲成蟲的孕節(jié)片進(jìn)行染色制片，得到的染色標(biāo)本子宮側(cè)枝為亮綠色，其他部位無色，易于觀察。王宏運［5］采用蘇木素染色法制作貝氏莫尼茨絳蟲的染色標(biāo)本，觀察到結(jié)構(gòu)清晰的成節(jié)中雌雄生殖系統(tǒng)、排泄系統(tǒng)，孕節(jié)中子宮和蟲卵的結(jié)構(gòu)。任成林［6］曾用哈里斯氏蘇木精染色液對羊曲子宮絳蟲成蟲進(jìn)行染色制片也得到了比較滿意的效果。本實驗采用H.E染色法制作絳蟲的染色標(biāo)本，對傳統(tǒng)的染色方法做了改進(jìn)。在浸染過程中應(yīng)勤檢查、頻翻動，使染液浸透蟲體，寧可深染，不宜淺染，以免經(jīng)分色后色淡影響鑒定。分色是關(guān)鍵，嚴(yán)格拿握時間，蟲體呈紫紅色為宜。透明時間應(yīng)以最理想的結(jié)果為宜，因此在透明過程中也應(yīng)經(jīng)常觀察，在顯微鏡下能清晰分辨蟲體內(nèi)部各器官，即可取出封片，一般壓制較薄的節(jié)片透明時間短，反之則較長。用此改進(jìn)的方法制作的曲子宮絳蟲標(biāo)本，成節(jié)中雌雄生殖系統(tǒng)和排泄系統(tǒng)結(jié)構(gòu)清晰，孕節(jié)中子宮和蟲卵的結(jié)構(gòu)也很好辨認(rèn)。

湯麗敏［7］對蓋氏曲子宮絳蟲形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀測，測量出了該絳蟲的各種數(shù)據(jù)。本研究就曲子宮絳蟲成蟲從頭節(jié)、頸節(jié)至體節(jié)，總結(jié)了其生殖器官的變化規(guī)律。隨著節(jié)片的生長延伸，節(jié)片變寬變厚，形態(tài)呈現(xiàn)一系列變化，表現(xiàn)為內(nèi)部器官的逐漸發(fā)育完全，一些器官逐漸成熟又逐漸退化的過程。比較曲子宮絳蟲的幼節(jié)和成節(jié)的形態(tài)結(jié)構(gòu)，生殖器官具有逐漸變化的規(guī)律。幼節(jié)中，每個節(jié)片中央有一深色橢圓形的陰影，是生殖器官的萌芽，尚未出現(xiàn)雌、雄的性別特征，隨著節(jié)片位置向后，生殖器官萌芽無規(guī)律地向節(jié)片的一側(cè)逐漸移動，生殖系統(tǒng)橢圓形的萌芽逐漸變大，顏色變深。在同一節(jié)片中，雌性生殖系統(tǒng)有生殖孔側(cè)睪丸出現(xiàn)比無生殖孔側(cè)要遲，雌性生殖系統(tǒng)中，首先出現(xiàn)生殖腔、卵模和卵黃腺，卵巢從小逐漸變大，與卵黃腺構(gòu)成菜花狀結(jié)構(gòu)，至此絳蟲成節(jié)發(fā)育完全。在孕節(jié)發(fā)育過程中，隨著節(jié)片向后延伸，彎曲的子宮開始出現(xiàn)，睪丸最先退化，爾后是卵巢，再是卵黃腺退化，卵模最后退化，節(jié)片內(nèi)僅能看到發(fā)達(dá)的子宮中充滿蟲卵，至此絳蟲孕節(jié)發(fā)育完全。

［1］汪明.獸醫(yī)寄生蟲學(xué)［M］.3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003：104-113.

［2］裘學(xué)麗，陳艷，牟榮.帶絳蟲成蟲節(jié)片染色方法的探討［J］.貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，30（4）：376.

［3］奚琳琳，楊毅梅.帶絳蟲妊娠節(jié)片孔雀綠染色標(biāo)本制作［J］.中國熱帶醫(yī)學(xué)，2008，8（3）：474.

［4］紀(jì)偉華，郭冀玲.帶絳蟲妊娠節(jié)片標(biāo)本制作方法的研究［J］.中國人獸共患病雜志，2001，17（4）：73-74.

［5］王宏運.貝氏莫尼茨絳蟲幼節(jié)和成節(jié)間差異基因的EST研究［D］.石河子：石河子大學(xué)，2007：11-16.

［6］任成林.絳蟲成蟲染制方法的改進(jìn)［J］.動物學(xué)雜志，1993，28（6）：28-29.

［7］湯麗敏.蓋氏曲子宮絳蟲形態(tài)學(xué)觀測［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息, 2007，25（10）：26.

S852.7

A

2095-3887（2017）02-0040-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.02.014

2016-12-25

2016年院列科研項目（2016GMGY002）

楊祎程（1985-），男，碩士，主要從事動物解剖生理教學(xué)與研究工作。

張進(jìn)隆（1966-），男，博士。