高維維，陳思平，王麗平，陳立凱，郭濤，王慧，陳志強(qiáng)

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家植物航天育種工程技術(shù)研究中心，廣州 510642）

稻米蒸煮品質(zhì)性狀與分子標(biāo)記關(guān)聯(lián)研究

高維維，陳思平，王麗平，陳立凱，郭濤，王慧，陳志強(qiáng)

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家植物航天育種工程技術(shù)研究中心，廣州 510642）

【目的】調(diào)查分析代表性水稻種質(zhì)重要的品質(zhì)性狀和淀粉RVA譜變異，篩選與性狀顯著關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，為稻米品質(zhì)改良提供依據(jù)?！痉椒ā恳?8份國(guó)內(nèi)外水稻多樣性種質(zhì)為材料，進(jìn)行稻米品質(zhì)性狀變異調(diào)查分析；利用快速淀粉粘滯測(cè)定儀（rapid visco analyzer）鑒定材料淀粉RVA譜。利用已報(bào)道的稻米淀粉合成相關(guān)基因等位標(biāo)記及稻米籽粒相關(guān)QTL連鎖分子標(biāo)記對(duì)種質(zhì)材料進(jìn)行基因分型。利用GLM模型進(jìn)行分子標(biāo)記與品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)檢測(cè)，并對(duì)顯著關(guān)聯(lián)標(biāo)記進(jìn)行逐步回歸分析；評(píng)估等位基因及其組合對(duì)目標(biāo)性狀的表型影響效應(yīng)，同時(shí)鑒別對(duì)應(yīng)優(yōu)異等位基因型及載體品種?！窘Y(jié)果】供試材料在直鏈淀粉含量（AC）、膠稠度（GC）和堿消值（ASV）等表現(xiàn)出廣泛的表型變異和多樣性，變異系數(shù)為26.5%—36.3%。RVA譜檢測(cè)表明崩解值、消減值和回復(fù)值等在材料間具有明顯差異，能較好地反映不同種質(zhì)的淀粉糊化特性。相關(guān)分析表明，AC與冷膠黏度、消減值和回復(fù)值呈顯著正相關(guān)，與最高黏度和崩解值呈顯著負(fù)相關(guān)；GC同時(shí)與消減值和回復(fù)值呈顯著負(fù)相關(guān)。利用154個(gè)多態(tài)性標(biāo)記共檢測(cè)到491個(gè)等位變異，基因多樣性平均為0.447，多態(tài)信息含量（PIC）平均為0.390。性狀-標(biāo)記關(guān)聯(lián)檢測(cè)共獲得22個(gè)與稻米品質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，單個(gè)關(guān)聯(lián)標(biāo)記位點(diǎn)解釋的表型變異（R2）范圍為14.11%—75.62%。GBSSI是影響AC和GC的主效基因，分子標(biāo)記Wx-G/T對(duì)AC和GC的表型變異解釋率分別為61.44%和41.87%。SSIIa是影響ASV的主效基因，alk-GC/TT和SSIIa-F對(duì)ASV的表型變異解釋率分別為75.62%和74.46%。利用顯著關(guān)聯(lián)標(biāo)記構(gòu)建AC、GC和ASV的回歸模型方程，決定系數(shù)分別為85.30%、40.62%和80.38%?！窘Y(jié)論】水稻淀粉RVA譜與AC、GC和ASV密切相關(guān)，利用RVA譜可更全面地評(píng)價(jià)稻米品質(zhì)性狀。利用稻米品質(zhì)表型-分子標(biāo)記關(guān)聯(lián)，共鑒定出22個(gè)與品質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，其中5個(gè)位點(diǎn)同時(shí)與AC和GC關(guān)聯(lián)?；貧w模型表明標(biāo)記的組合可產(chǎn)生不同的表型效應(yīng)。

水稻；稻米品質(zhì)；性狀-標(biāo)記關(guān)聯(lián)；等位變異

0 引言

【研究意義】稻米品質(zhì)的優(yōu)劣對(duì)其商品價(jià)值具有重要影響。蒸煮品質(zhì)是影響稻米口感的關(guān)鍵，成為是否滿(mǎn)足優(yōu)質(zhì)稻米消費(fèi)需求和影響國(guó)內(nèi)外稻米市場(chǎng)的重要因素。其中，直鏈淀粉含量（amylose content，AC）、糊化溫度（gelatinization temperature，GT）和膠稠度（gel consistency，GC）是稻米蒸煮品質(zhì)的主要指標(biāo)。近年來(lái)，利用黏度速測(cè)儀RVA進(jìn)行淀粉糊化特性評(píng)價(jià)，已在中國(guó)育種實(shí)踐中得到較好應(yīng)用[1-2]。進(jìn)一步解析RVA譜特征值與稻米蒸煮品質(zhì)的相關(guān)性，對(duì)于全面評(píng)價(jià)水稻品質(zhì)特性具有實(shí)踐價(jià)值。此外，尋找與稻米蒸煮品質(zhì)性狀相關(guān)的優(yōu)異等位基因及典型載體材料，探討不同分子標(biāo)記的組合對(duì)于品質(zhì)性狀的表型效應(yīng)，對(duì)提高分子標(biāo)記輔助選擇（maker assisted selection，MAS）在品質(zhì)育種中的應(yīng)用效率具有重要意義。實(shí)現(xiàn)對(duì)個(gè)體基因型鑒定，高效預(yù)測(cè)表型值，有利提高稻米品質(zhì)性狀選擇效率?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】稻米品質(zhì)性狀被認(rèn)為是典型的質(zhì)量-數(shù)量遺傳性狀，受多基因控制。顯然，多位點(diǎn)的標(biāo)記關(guān)聯(lián)和效應(yīng)分析是實(shí)現(xiàn)精確分子標(biāo)記選擇的前提。ZHAO等[3]通過(guò)標(biāo)記與性狀的關(guān)聯(lián)分析，驗(yàn)證了粒形、堊白、淀粉合成相關(guān)QTL/基因的分子標(biāo)記的可行性；KHARABINA-MASOULEH等[4]通過(guò)關(guān)聯(lián)分析獲得了31個(gè)與稻米蒸煮品質(zhì)相關(guān)的淀粉合成基因SNP位點(diǎn)；邱先進(jìn)等[5]利用全基因組關(guān)聯(lián)分析解析秈稻堊白的遺傳基礎(chǔ)和挖掘影響堊白粒率和堊白度的優(yōu)異等位基因。整體而言，雖然許多稻米品質(zhì)相關(guān)QTL和功能基因，包括影響粒形、堊白性狀的QTL[6-8]和淀粉合成相關(guān)基因[9-11]得到鑒定，但涉及等位基因組合以及優(yōu)異等位變異的解析仍是有限?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】稻米品質(zhì)性狀的QTL定位和基因鑒定研究已有較多報(bào)道，水稻淀粉合成相關(guān)基因與稻米品質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析[12-15]也獲得重要進(jìn)展，但對(duì)等位基因組合、優(yōu)異等位變異及典型載體材料挖掘的研究尚不多。大量已報(bào)道的相關(guān)分子標(biāo)記的可用性、變異效應(yīng)以及貢獻(xiàn)力并未明確。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究利用淀粉合成相關(guān)基因及稻米籽粒相關(guān)位點(diǎn)連鎖的分子標(biāo)記對(duì)代表性種質(zhì)進(jìn)行分型檢測(cè)，并對(duì)多個(gè)稻米品質(zhì)性狀進(jìn)行基于線性模型的等位基因貢獻(xiàn)性檢測(cè)，挖掘與稻米品質(zhì)性狀顯著相關(guān)的標(biāo)記和重要等位基因組合，為水稻品質(zhì)改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家植物航天育種工程技術(shù)研究中心種質(zhì)資源庫(kù)所收集的國(guó)內(nèi)外種質(zhì)材料48份，其中，秈稻38份、粳稻9份和爪哇稻1份（表1）。

表1 本研究用到的水稻種質(zhì)材料Table 1 Rice germplasm materials used in this study

1.2 稻米品質(zhì)性狀鑒定

供試材料于2015年晚季種植于國(guó)家植物航天育種工程技術(shù)研究中心試驗(yàn)基地（廣州）。田間管理（水、肥、病蟲(chóng)害防治等）按當(dāng)?shù)卮筇锍Ｒ?guī)栽培要求實(shí)施。按農(nóng)業(yè)部部頒標(biāo)準(zhǔn)NY147-88[16]測(cè)定直鏈淀粉含量（AC）、膠稠度（GC）和堿消值（ASV）。淀粉RVA譜測(cè)定采用波通瑞華科學(xué)儀器（北京）有限公司生產(chǎn)的RVA（Rapid Visco Analyzer, Model 3D）快速測(cè)定淀粉粘滯特性，并用TCW（Thermal Cycle for Windows）配套軟件分析。測(cè)定按AACC規(guī)程（1995 61-02）要求，即含水量為14.0%時(shí)，樣品量3.00 g，蒸餾水25.00 mL。測(cè)定過(guò)程中罐內(nèi)溫度變化為50℃保持1 min，以12℃/min上升到95℃（3.75 min），95℃保持2.5 min，以12℃/min下降到50℃（3.75 min），50℃保持1.4 min。攪拌器在起始10 s內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)速度為960 r/min，以后保持在160 r/min。RVA譜特征用最高黏度（peak viscosity，PKV）、熱漿黏度（hot paste viscosity，HPV）和冷膠黏度（cool paste viscosity，CPV）描述。在TCW程序中選用水稻的分析方法（ rice method），其中，程序參數(shù)設(shè)置為：Temp At Visc Rate（2，7，1，36），成糊溫度（pasting temperature，PTm）按包勁松[17]的方法手工計(jì)算獲得。黏度單位用“Rapid Visco Units（RVU）”或厘泊（centipoise，cp）表示。

1.3 分子標(biāo)記檢測(cè)

采用CTAB法提取水稻材料葉片基因組DNA。試驗(yàn)篩選所涉及的分子標(biāo)記包含一部分報(bào)道的淀粉合成相關(guān)基因的等位分子標(biāo)記；以及稻米籽粒有關(guān)性狀連鎖的標(biāo)記，涉及SNP、SSR和STS等標(biāo)記類(lèi)型。經(jīng)初步篩選獲得用于關(guān)聯(lián)分析的多態(tài)性標(biāo)記共154個(gè)（見(jiàn)電子附表）。所有引物均由金唯智生物技術(shù)有限公司合成。不同引物的PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序參照Z(yǔ)HAO等[3]方法。利用自動(dòng)熒光毛細(xì)管電泳（Fragment Analyzer?）檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并用PROSize 2.0軟件對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析，確定產(chǎn)物DNA片段長(zhǎng)度，記錄基因型信息。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel和SAS 9.3進(jìn)行性狀的統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于多元線性回歸分析，將各位點(diǎn)的等位變異轉(zhuǎn)化為虛擬變量，具體參照LEE等[18]的方法。利用Power Marker 3.25軟件計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)（number of alleles per locus）、基因多樣性（gene diversity）和多態(tài)信息含量（polymorphism information content， PIC）。以Structure 2.3.1軟件進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析，估計(jì)最佳群體組群數(shù)K，其取值范圍為1—10，將MCMC（markov chain monte carlo）開(kāi)始時(shí)的不作數(shù)迭代（length of burn-in period）設(shè)為10 000次，再將不作數(shù)迭代后的MCMC設(shè)為10 000次，迭代次數(shù)（number of iterations）設(shè)置為5，計(jì)算Q參數(shù)。采用Tassel 3.0軟件一般線性模型（general linear model，GLM），以Q作為協(xié)變量，利用表型變異數(shù)據(jù)對(duì)標(biāo)記逐一進(jìn)行回歸分析，并計(jì)算標(biāo)記對(duì)表型變異的解釋率。參考BRESEGHELLO[19]和文自翔等[20]方法計(jì)算標(biāo)記位點(diǎn)等位變異的表型效應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 稻米品質(zhì)相關(guān)性狀的變異分析和RVA譜分析

通過(guò)稻米品質(zhì)性狀的調(diào)查，48份種質(zhì)材料中檢測(cè)到廣泛的遺傳變異。其中，AC為5.9%—27.5%、GC為24.5—142.5 mm、ASV為1.0—7.0；AC、GC和ASV的變異系數(shù)為26.5%—36.3%（表2）。說(shuō)明所選材料表現(xiàn)出較高的表型多樣性。

基于黏度速測(cè)儀測(cè)定的RVA譜主要反映水稻淀粉譜粘滯特性。根據(jù)與淀粉特性密切相關(guān)的蒸煮品質(zhì)性狀，即AC、GC和ASV，選取18份具有代表性的品種（表3）進(jìn)行RVA譜特征值分析。結(jié)果表明，不同品種RVA譜及其特征值存在明顯的差異。其中，消減值（setback，SBV）的變異系數(shù)最大，其次是回復(fù)值（consistence，CSV）和崩解值（breakdown，BDV），其余RVA譜特征值的變異系數(shù)均較小。不同水稻品種間RVA譜特征值在PKV、HPV、CPV、PTm和峰值時(shí)間（peak time，PaT）上的差異不大，但BDV、SBV和CSV等指標(biāo)表現(xiàn)明顯差異，具有品種特異性。2份糯稻品種的峰值時(shí)間最短，為3.6和3.7 min；并且具有最小的SBV和CSV，明顯區(qū)分于其他非糯種質(zhì)。

稻米品質(zhì)性狀與RVA譜特征值相關(guān)性分析（表4）發(fā)現(xiàn)，AC分別與CPV、SBV和CSV呈顯著或極顯著正相關(guān)，與PKV和BDV呈負(fù)相關(guān)。其中，AC與SBV相關(guān)系數(shù)達(dá)0.794。高直鏈淀粉的2份材料，Kasalath（AC 27.2%）和泰豐B（AC 27.0%）的SBV均為正值，遠(yuǎn)高于其他非糯材料。從表3和表4可以看出，不同品種因本身AC和GC的不同，RVA譜顯著不同。糯稻品種（萬(wàn)里糯、荊香糯）RVA譜特征值表現(xiàn)為BDV較大，CPV小，SBV為負(fù)值且絕對(duì)值較大，達(dá)到PKV時(shí)間短；高直鏈淀粉

含量和膠稠度較小的品種（Kasalath、泰豐B）RVA譜特征值表現(xiàn)為BDV較小，SBV較大。由此可見(jiàn)，稻米品質(zhì)中的AC和GC是影響RVA譜特征值的2個(gè)重要理化指標(biāo)。此外，GC分別與SBV和CSV呈顯著負(fù)相關(guān)；ASV與PTm呈極顯著負(fù)相關(guān)。RVA特征值中，SBV與CSV同時(shí)與AC和GC顯著相關(guān)，是反映稻米品質(zhì)最為重要的2個(gè)指標(biāo)。而利用經(jīng)驗(yàn)公式換算的PTm與ASV相關(guān)系數(shù)達(dá)0.910，表明該方法測(cè)定的PTm可精確地反映稻米淀粉糊化溫度。

表2 48份水稻材料的稻米品質(zhì)性狀值Table 2 Grain-quality traits of the 48 rice materials

表3 18個(gè)品種RVA譜特征值Table 3 RVA profile characteristics of 18 rice varieties

表4 稻米品質(zhì)性狀與RVA譜特征值的相關(guān)性Table 4 Correlation between rice quality characteristics and RVA profile characteristics

2.2 標(biāo)記-等位基因關(guān)聯(lián)性檢測(cè)

154個(gè)多態(tài)性標(biāo)記中共檢測(cè)到491個(gè)等位變異，平均每個(gè)位點(diǎn)3.19個(gè)，不同位點(diǎn)等位基因數(shù)變幅范圍為2—8。各位點(diǎn)的基因多樣性平均為0.447，變幅為0.041—0.829。對(duì)于多態(tài)性信息含量（PIC），標(biāo)記間差異較大，幅度為0.040—0.806，平均值為0.390，其中，27對(duì)引物為低度多態(tài)位點(diǎn)，82對(duì)引物為中度多態(tài)位點(diǎn)，45對(duì)引物為高度多態(tài)位點(diǎn)。

采用EVONNO等[21]介紹的方法進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析表明，△K值于亞群數(shù)為2時(shí)有明顯的峰。因而該群體的適宜亞群數(shù)確定為2。第一個(gè)亞群包括02428、沈農(nóng)9816、沈農(nóng)016、云粳22、龍粳21、武運(yùn)粳23、南粳46、W030、甬優(yōu)8號(hào)和大粒種等粳稻亞群；其他材料分布在第二個(gè)亞群，為秈稻亞群。利用Tassel 3.0 軟件中的GLM模型，以各材料對(duì)應(yīng)的Q值作為協(xié)變量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示，在0.01水平下，對(duì)于不同性狀共檢測(cè)到22個(gè)關(guān)聯(lián)標(biāo)記位點(diǎn)，其中同時(shí)與AC和GC關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有5個(gè)。單個(gè)關(guān)聯(lián)標(biāo)記位點(diǎn)的貢獻(xiàn)率（R2）范圍是14.11%—75.62%。

標(biāo)記-性狀關(guān)聯(lián)結(jié)果表明，與AC關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有15個(gè)，表型變異解釋率范圍為14.34%—61.44%，其中在3個(gè)淀粉合酶基因（GBSSI、BeIIb和SSI）中有9個(gè)位點(diǎn)，貢獻(xiàn)率最高的是Wx-G/T；與GC關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有8個(gè)，表型變異解釋率范圍為14.11%—41.87%，在3個(gè)淀粉合酶基因（GBSSI、SSI和SSIIIb）中有5個(gè)位點(diǎn)，貢獻(xiàn)率最高的是Wx-G/T；與ASV關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有4個(gè)，表型變異解釋率范圍為19.01%—75.62%，其中，SSIIa的2個(gè)位點(diǎn)（alk-GC/TT和SSIIa-F）的貢獻(xiàn)率是所有關(guān)聯(lián)位點(diǎn)中最高的，分別為75.62%和74.46%（表5）。4個(gè)GBSSI的位點(diǎn)、4個(gè)BEIIb的位點(diǎn)以及1個(gè)SSI的位點(diǎn)都與AC顯著關(guān)聯(lián)，GBSSI和SSI上都有2個(gè)位點(diǎn)與GC顯著關(guān)聯(lián)，2個(gè)SSIIa的位點(diǎn)都與ASV顯著關(guān)聯(lián)，表明GBSSI、BEIIb和SSI對(duì)AC和GC具有一定的決定作用，SSIIa對(duì)ASV具有一定的決定作用。其中，標(biāo)記Wx-G/T、GBSSI-4-IF、SSI-2-F、INV1和RM15206同時(shí)與AC和GC關(guān)聯(lián)。

表5 稻米品質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點(diǎn)Table 5 Marker loci significantly associated with grain-quality traits

2.3 關(guān)鍵稻米品質(zhì)性狀等位基因及組合的效應(yīng)分析

與AC、GC和ASV顯著關(guān)聯(lián)且貢獻(xiàn)率位于前4位的位點(diǎn)上等位基因效應(yīng)差值及對(duì)應(yīng)等位基因的載體材料如表6所示。與AC顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)中，Wx-G/T具有最大的表型效應(yīng)差異，Wx-G/T-G與Wx-G/T-T的表型效應(yīng)差值達(dá)到了10.6%。AC減效最大的等位變異是Wx-G/T-T，典型載體材料是W030和云粳22。

表6 重要品質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)位點(diǎn)及表型效應(yīng)Table 6 Marker loci significantly associated with important grain quality traits and their phenotypic variation

SSI-1-F對(duì)GC具有最大的表型效應(yīng)差異（72.7 mm），其次是貢獻(xiàn)率最大的Wx-G/T（+50.9 mm）。增效最大的等位變異是Wx-G/T-T（+6.4 mm），典型載體材料是華寬占和沈農(nóng)016，其次是GBSSI-4-IF-C（+5.1 mm），典型載體材料是開(kāi)平小優(yōu)粒。

與ASV顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)等位基因間表型效應(yīng)差異最大的是SSIIa-F（4.4），其次是貢獻(xiàn)率最大的alk-GC/TT（4.1），其中，alk-GC/TT-TT具有最大的增效表型效應(yīng)（+0.9），典型載體材料是桂禾豐和軟占。

其中，典型載體材料W030、開(kāi)平小優(yōu)粒和軟占等的AC、GC和ASV值達(dá)國(guó)標(biāo)優(yōu)質(zhì)（表2），GBSSI的Wx-G/T、GBSSI-4-IF和SSIIa的alk-GC/TT位點(diǎn)的基因型分別為T(mén)/T、C/C、TT/TT，均為優(yōu)異等位變異。因此，W030、開(kāi)平小優(yōu)粒和軟占等攜帶了控制AC、GC及ASV的多個(gè)優(yōu)異等位基因，可作為優(yōu)質(zhì)品種選育的骨干親本。

利用逐步回歸的方法對(duì)各性狀顯著性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)進(jìn)行分析的結(jié)果表明，AC、GC和ASV逐步回歸模型中分別包含5、2和2個(gè)關(guān)聯(lián)標(biāo)記（表7、圖1）。不同的等位基因組合形成了廣泛的表型差異。Wx-G/T、GBSSI-F、RM16、GBSSI-3-IF和RM15206 5個(gè)位點(diǎn)的組合對(duì)AC的決定系數(shù)為85.30%，其中，Wx-G/T和GBSSI-F為前人驗(yàn)證過(guò)的控制AC的主效基因GBSSI的位點(diǎn)，具有最高的決定系數(shù)（68.60%和12.08%）其他3個(gè)為本研究獲得的新位點(diǎn)。不同的等位基因組合具有不同的AC值，其中，G/I/II/A/I、G/I/ II/A/II和G/I/II/C/I等位基因組合具有較高的AC，T/II/I/A/II等位基因組合為糯稻品種，AC值極低；Wx-G/T和RMG2762.HAU2762可以用來(lái)預(yù)測(cè)GC，決定系數(shù)為40.62%，表明所選標(biāo)記對(duì)GC進(jìn)行預(yù)測(cè)尚有一定的困難；alk-GC/TT和SSIIa-F 2個(gè)位點(diǎn)的組合可以用來(lái)預(yù)測(cè)ASV，決定系數(shù)為80.38%，alk-GC/TT具有主要的決定作用（76.71%），GC/I和GC/II等位基因組合具有較低的ASV，TT/II等位基因組合具有較高的ASV。

表7 逐步回歸模型中標(biāo)記的等位基因組合Table 7 Allelic combinations based on the stepwise regression models

圖1 等位基因組合箱形圖Fig. 1 Box plots of the allelic combinations

3 討論

本試驗(yàn)代表性品種的稻米淀粉RVA譜檢測(cè)結(jié)果表明，不同品種的RVA譜及其特征值存在明顯的差異，消減值的變異系數(shù)最大，其次是回復(fù)值和崩解值，這與何秀英等[22]的結(jié)果類(lèi)似，但變異系數(shù)均更大，主要是由于所選材料在AC和GC上差異顯著。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，RVA特征值與AC和GC存在顯著或極顯著的相關(guān)性，稻米品質(zhì)中的AC和GC是影響RVA譜特征值的2個(gè)重要理化指標(biāo)，這與前人研究結(jié)果相似[23]，但其相關(guān)系數(shù)略小于賈良等[24]的研究結(jié)果，這可能是由于所用材料數(shù)較少。

本研究所用154個(gè)多態(tài)性標(biāo)記，共檢測(cè)到491個(gè)等位變異，平均每個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)具有3.19個(gè)等位變異，變幅為2—8，平均每對(duì)引物的多態(tài)信息含量（PIC）為0.390，變幅為0.040—0.806，遺傳多樣性平均為0.447，略低于前人研究結(jié)果[25]，這是因?yàn)楸狙芯克玫臉?biāo)記部分為SNP標(biāo)記，為雙等位形式，每個(gè)位點(diǎn)所攜帶的多態(tài)信息較少。

通過(guò)對(duì)48份不同水稻品種與稻米品質(zhì)相關(guān)分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)于20個(gè)與淀粉合成酶相關(guān)的基因，稻米AC主要由GBSSI控制，GC也可能主要由GBSSI或與其緊密連鎖的基因位點(diǎn)控制[26]。本研究中Wx-G/T對(duì)AC和GC的貢獻(xiàn)率最大，分別為61.44%和41.87%，同時(shí)GBSSI的其他4個(gè)位點(diǎn)對(duì)AC和GC的貢獻(xiàn)率均較大（＞25%），說(shuō)明GBSSI是控制直鏈淀粉含量和膠稠度的主效基因，這與TIAN等[27]的研究結(jié)果相符。GBSSI-4-IF與GC顯著關(guān)聯(lián)，這與第10個(gè)外顯子的C/T SNP對(duì)決定高直鏈淀粉米飯的軟硬具有重要作用是一致的[28]。多數(shù)研究表明，SSIIa（尤其是第8外顯子的GC/TT SNP位點(diǎn)）對(duì)糊化溫度具有重要影響[29-30]。本研究中SSIIa的2個(gè)位點(diǎn)與ASV均顯著相關(guān)。除了SSIIa外，未檢測(cè)到其他淀粉合成相關(guān)基因的位點(diǎn)與堿消值相關(guān)，這可能與多數(shù)參試材料的ASV較大有關(guān)。

以往研究表明，影響GC的主效基因是Wx基因（GBSSI），但本研究中，在Wx基因型一樣的情況下，出現(xiàn)GC表型差異較大的現(xiàn)象，如南粳46和五山絲苗、廣源占15號(hào)和洪晚秈924等的Wx基因型均為T(mén)/T，但GC值差異很大。究其原因，可能有以下幾點(diǎn)：（1）基因存在本研究未涉及的其他變異位點(diǎn)；存在某些控制GC的微效基因與Wx基因互作，但微效基因與Wx基因互作關(guān)系研究仍未明確；（2）GC受基因型與環(huán)境互作影響較大，遺傳力較低[31-32]。影響糊化溫度的主效基因是alk（SSIIa）[33]，本研究中，云粳22的alk基因型為GC/GC，但其堿消值較大（糊化溫度低），這與前人研究結(jié)論未吻合[33]。NAKAMURA等[34]研究表明，不同SNP位點(diǎn)的相互作用會(huì)影響SSIIa酶的活性，在4 198 bp處出現(xiàn)G/A SNP的A位點(diǎn)時(shí)，不論SSIIa基因型為GC/GC或TT/TT，均表現(xiàn)出低糊化溫度，這可能是導(dǎo)致云粳22表現(xiàn)出低糊化溫度的原因。

單個(gè)標(biāo)記用于區(qū)分群體的不同種質(zhì)具有一定的局限性，對(duì)顯著關(guān)聯(lián)標(biāo)記構(gòu)建的回歸模型可以用來(lái)預(yù)測(cè)表型，LESTARI等[35]建立了多個(gè)用來(lái)估計(jì)稻米食味品質(zhì)的回歸模型。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)與AC、GC和ASV顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)進(jìn)行逐步回歸分析發(fā)現(xiàn)，Wx-G/T、GBSSI-F、RM16、GBSSI-3-IF和RM15206 5個(gè)位點(diǎn)的組合可以用來(lái)預(yù)測(cè)AC；Wx-G/T和RMG2762.HAU2762可以用來(lái)預(yù)測(cè)GC，但決定系數(shù)較低；alk-GC/TT和SSIIa-F 2個(gè)位點(diǎn)的組合可以用來(lái)預(yù)測(cè)ASV。其中，Wx-G/T在AC和GC回歸方程模型中均具有較大的決定系數(shù)，alk-GC/TT在ASV回歸方程模型中的決定系數(shù)高達(dá)76.71%，表明對(duì)于AC和GC，Wx-G/T是主效位點(diǎn)，對(duì)于ASV，alk-GC/TT是主效位點(diǎn)，這與前人研究結(jié)果一致[26,29]?？芍鶚?gòu)建的回歸方程模型對(duì)分子標(biāo)記輔助選擇育種具有一定的指導(dǎo)意義，尤其是決定系數(shù)較大的AC和ASV的回歸模型。

挖掘稻米品質(zhì)性狀的優(yōu)異等位基因及對(duì)應(yīng)的典型載體材料，可為水稻分子設(shè)計(jì)育種的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本研究通過(guò)對(duì)與AC、GC、ASV顯著相關(guān)且貢獻(xiàn)率位于前4位的位點(diǎn)的等位變異分析發(fā)現(xiàn)，同一位點(diǎn)等位變異間表型效應(yīng)有差異。對(duì)于AC，Wx-G/T位點(diǎn)對(duì)其貢獻(xiàn)率最大，且Wx-G/T-T具有最大的減效表型效應(yīng)，典型載體材料為W030和云粳22；對(duì)于GC，貢獻(xiàn)率最大的是Wx-G/T，最優(yōu)等位變異是Wx-G/T-T，典型載體材料是華寬占和沈農(nóng)016，其次是GBSSI-4-IF-C，典型載體材料是開(kāi)平小優(yōu)粒；對(duì)于ASV，貢獻(xiàn)率最大的是alk-GC/TT，最優(yōu)等位變異是alk-GC/TT-TT，典型載體材料是桂禾豐和軟占。在水稻品質(zhì)改良中，利用這些淀粉合成相關(guān)基因的優(yōu)異等位基因及載體材料信息進(jìn)行育種設(shè)計(jì)、雜交組合配置，從而將不同位點(diǎn)的優(yōu)異等位基因進(jìn)行聚合，以達(dá)到改良品質(zhì)性狀的目的。例如可利用攜帶控制AC、GC、ASV的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)優(yōu)異等位變異的材料W030、開(kāi)平小優(yōu)粒、軟占等作為骨干親本或者供體親本。這些材料具有對(duì)AC減效效應(yīng)的等位變異位點(diǎn)Wx-G/T-T、對(duì)GC增效效應(yīng)的等位變異位點(diǎn)GBSSI-4-IF-C和對(duì)ASV增效效應(yīng)的等位變異位點(diǎn)alk-GC/TT-TT。針對(duì)現(xiàn)有育種材料開(kāi)展分子改良或者多基因聚合，實(shí)現(xiàn)不同遺傳背景的有利等位基因利用。

4 結(jié)論

共檢測(cè)到22個(gè)與稻米品質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，其中同時(shí)與AC和GC關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有5個(gè)。單個(gè)關(guān)聯(lián)標(biāo)記位點(diǎn)解釋的表型變異比例（R2）范圍是14.11%—75.62%。對(duì)表型變異解釋率最大的是SSIIa的alk-GC/TT和SSIIa-F位點(diǎn)以及GBSSI的Wx-G/T和GBSSI-4-IF位點(diǎn)，表明GBSSI和SSIIa是影響AC、GC和ASV的2個(gè)主效基因。利用逐步回歸分析獲得了可以預(yù)測(cè)AC、GC和ASV的回歸方程模型以及等位基因組合，同時(shí)發(fā)掘了AC、GC和ASV的優(yōu)異等位變異及載體材料。

[1] CHENG F, ZHONG L, SHU Q. Studies on the cooking and eating quality properties in chalky milled grains of earlyindicarice.Acta Agronomica Sinica, 2002, 28(3): 363-368.

[2] 胡培松, 翟虎渠, 唐紹清, 萬(wàn)建民. 利用RVA快速鑒定稻米蒸煮及食味品質(zhì)的研究. 作物學(xué)報(bào), 2004, 30(6): 519-524.

HU P S, ZHAI H Q, TANG S Q, WAN J M. Rapid evaluation of rice cooking and palatability quality by RVA profile.Acta Agronomica Sinica, 2004, 30(6): 519-524. (in Chinese)

[3] ZHAO X, ZHOU L, PONCE K, YE G. The usefulness of known genes/QTLs for grain quality traits in anIndicapopulation of diverse breeding lines tested using association analysis.Rice, 2015, 8(1): 1-13.

[4] KHARABIAN-MASOULEH A, WATERS D L E, REINKE R F, WARD R, HENRY R J. SNP in starch biosynthesis genes associated with nutritional and functional properties of rice.Scientific Reports, 2012, 2(8): 1-9.

[5] 邱先進(jìn), 袁志華, 陳凱, 杜斌, 何文靜, 楊隆維, 徐建龍, 邢丹英,呂文愷. 用全基因組關(guān)聯(lián)分析解析秈稻堊白的遺傳基礎(chǔ). 作物學(xué)報(bào), 2015, 41(7): 1007-1016.

QIU X J, YUAN Z H, CHEN K, DU B, HE W J, YANG L W, XU J L, XING D Y, Lü W K. Genetic dissection of grain chalkiness inIndicamini-core germplasm using genome-wide association method.Acta Agronomica Sinica, 2015, 41(7): 1007-1016. (in Chinese)

[6] XU C, LIU Y, LI Y, XU X, XU C, LI X, XIAO J, ZHANG Q. Differential expression of GS5 regulates grain size in rice.Journal of Experimental Botany, 2015, 66(9): 2611-2623.

[7] WANG S, LI S, LIU Q, WU K, ZHANG J, WANG S, WANG Y, CHEN X, ZHANG Y, GAO C. The OsSPL16-GW7 regulatory module determines grain shape and simultaneously improves rice yield and grain quality.Nature Genetics, 2015, 47(8): 949-954.

[8] LI Y, FAN C, XING Y, YUN P, LUO L, YAN B, PENG B, XIE W, WANG G, LI X. Chalk5 encodes a vacuolar H+-translocating pyrophosphatase influencing grain chalkiness in rice.Nature Genetics, 2014, 46(4): 398-404.

[9] CHEN M, BERGMAN C, PINSON S, FJELLSTROM R. Waxy genehaplotypes: Associations with apparent amylose content and the effect by the environment in an international rice germplasm collection.Journal of Cereal Science, 2008, 47(3): 536-545.

[10] SU Y, RAO Y, HU S, YANG Y, GAO Z, ZHANG G, LIU J, HU J, YAN M, DONG G. Map-based cloning proves qGC-6, a major QTL for gel consistency ofjaponica/indicacross, responds by Waxy in rice (Oryza sativaL.).Theoretical and Applied Genetics, 2011, 123(5): 859-867.

[11] GAO Z, ZENG D, CUI X, ZHOU Y, YAN M, HUANG D, LI J, QIAN Q. Map-based cloning of the ALK gene, which controls the gelatinization temperature of rice.Science in China Series C: Life Sciences, 2003, 46(6): 661-668.

[12] 池彥衡. 稻種資源稻米品質(zhì)評(píng)價(jià)及可溶性淀粉合酶基因序列多態(tài)性和關(guān)聯(lián)分析[D]. 南昌: 江西農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

CHI Y H. The quality evaluation of rice resources and sequence polymorphism and association analysis of rice soluble starch synthase gene[D]. Nanchang: Jiangxi Agricultural University, 2011. (in Chinese)

[13] 林華. 水稻可溶性淀粉合酶基因SSIIa、SSIIIa等位變異及其與稻米品質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析[D]. 南昌: 江西農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

LIN H. The research of allelic diversification of soluble starch synthase geneSSIIaandSSIIIaand its association with rice quality[D]. Nanchang: Jiangxi Agricultural University, 2011. (in Chinese)

[14] 徐衛(wèi). 水稻可溶性淀粉合酶基因與產(chǎn)量和稻米品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析[D]. 南昌: 江西農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

XU W. The association analysis of rice soluble starch synthase gene with yield and quality traits[D]. Nanchang: Jiangxi Agricultural University, 2013. (in Chinese)

[15] YANG F, CHEN Y, TONG C, HUANG Y, XU F, LI K, CORKE H, SUN M, BAO J. Association mapping of starch physicochemical properties with starch synthesis-related gene markers in nonwaxy rice (Oryza sativaL.).Molecular Breeding, 2014, 34(4): 1747-1763.

[16] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部部頒標(biāo)準(zhǔn). NY147-88稻米品質(zhì)評(píng)價(jià)方法.北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 1988: 4-6.

Chinese Ministry of Agriculture.NY147-88, The Method of Rice Quality Evaluation. Beijing: Chinese Criteria Press, 1988: 4-6. (in Chinese)

[17] 包勁松. 應(yīng)用RVA測(cè)定米粉淀粉成糊溫度. 中國(guó)水稻科學(xué), 2007, 21(5): 543-546.

BAO J S. Accurate measurement of pasting temperature of rice flour by a rapid Visco-Analyser.Chinese Journal of Rice Science, 2007, 21(5): 543-546. (in Chinese)

[18] LEE C, PARK J, KIM B, SEO J, LEE G, JANG S, KOH H. Influence of multi-gene allele combinations on grain size of rice and development of a regression equation model to predict grain parameters.Rice, 2015, 8(1). 1-10.

[19] BRESEGHELLO F. Association mapping of kernel size and milling quality in wheat (Triticum aestivumL.) cultivars.Genetics, 2005, 172(2): 1165-1177.

[20] 文自翔, 趙團(tuán)結(jié), 鄭永戰(zhàn), 劉順湖. 中國(guó)栽培和野生大豆農(nóng)藝及品質(zhì)性狀與SSR標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析.Ⅱ優(yōu)異等位變異的發(fā)掘. 作物學(xué)報(bào), 2008, 34(8): 1339-1349.

WEN Z X, ZHAO T J, ZHENG Y Z, LIU S H. Association analysis of agronomic and quality traits with SSR markers inGlycine maxandGlycine sojain China: II. Exploration of elite alleles.Acta Agronomica Sinica, 2008, 34(8): 1339-1349. (in Chinese)

[21] EVANNO G, REGNAUT S, GOUDET J. Detecting the number of clusters of individuals using the software structure: A simulation study.Molecular Ecology, 2005, 14(8): 2611-2620.

[22] 何秀英, 程永盛, 劉志霞. 國(guó)標(biāo)優(yōu)質(zhì)秈稻的稻米品質(zhì)與淀粉RVA譜特征研究. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 36(3): 37-44.

HE X Y, CHENG Y S, LIU Z X. Studies on the rice quality and starch RVA profile characteristics ofindicarice varieties with national high-quality.Journal of South China Agricultural University, 2015, 36(3): 37-44. (in Chinese)

[23] 隋炯明, 李欣, 嚴(yán)松, 嚴(yán)長(zhǎng)杰, 張蓉, 湯述翥, 陸駒飛, 陳宗祥, 顧銘洪. 稻米淀粉RVA譜特征與品質(zhì)性狀相關(guān)性研究. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005, 38(4): 657-663.

SUI J M, LI X, YAN S, YAN C J, ZHANG R, TANG S Z, LU J F, CHEN Z X, GU M H. Studies on the rice RVA profile characteristics and its correlation with the quality.Scientia Agricultura Sinica, 2005, 38(4): 657-663. (in Chinese)

[24] 賈良, 丁雪云, 王平榮, 鄧曉建. 稻米淀粉RVA譜特征及其與理化品質(zhì)性狀相關(guān)性的研究. 作物學(xué)報(bào), 2008, 34(5): 790-794.

JIA L, DING X Y, WANG P R, DENG X J. Rice RVA profile characteristics and correlation with the physical/chemical quality.Acta Agronomica Sinica, 2008, 34(5): 790-794. (in Chinese)

[25] JIN L, LU Y, XIAO P, SUN M, CORKE H, BAO J. Genetic diversity and population structure of a diverse set of rice germplasm for association mapping.Theoretical and Applied Genetics, 2010, 121(3): 475-487.

[26] 孫業(yè)盈, 彥呂, 董春林, 王平榮. 水稻W(wǎng)x基因與稻米AC、GC和GT的遺傳關(guān)系. 作物學(xué)報(bào), 2005, 31(5): 535-539.

SUN Y Y, YAN L, DONG C L, WANG P R. Genetic relationship among Wx gene, AC, GC and GT of rice.Acta Agronomica Sinica, 2005, 31(5): 535-539. (in Chinese)

[27] TIAN Z, QIAN Q, LIU Q, YAN M, LIU X, YAN C, LIU G, GAO Z, TANG S, ZENG D, WANG Y, YU J, GU M, LI J. Allelic diversities in rice starch biosynthesis lead to a diverse array of rice eating and cooking qualities.Proceedings of the National Academy of Science of the USA, 2009, 106(51): 21760-21765.

[28] TRAN N A, DAYGON V D, RESURRECCION A P, CUEVAS R P, CORPUZ H M, FITZGERALD M A. A single nucleotide polymorphism in the Waxy gene explains a significant component of gel consistency.Theoretical and Applied Genetics, 2011, 123(4): 519-525.

[29] BAO J S, CORKE H, SUN M. Nucleotide diversity in starch synthase IIa and validation of single nucleotide polymorphisms in relation to starch gelatinization temperature and other physicochemical properties in rice (Oryza sativaL.).Theoretical and Applied Genetics, 2006, 113(7): 1171-1183.

[30] CUEVAS R P, DAYGON V D, CORPUZ H M, NORA L, REINKE R F, WATERS D L, FITZGERALD M A. Melting the secrets of gelatinisation temperature in rice.Functional Plant Biology, 2010, 37(5): 439-447.

[31] LIN J, SHI C, WU M, WU J. Analysis of genetic effects for cooking quality traits of japonica rice across environments.Plant Science, 2005, 168(6): 1501-1506.

[32] SU Y, RAO Y, HU S, YANG Y, GAO Z, ZHANG G, LIU J, HU J, YAN M, DONG G, ZHU L, GUO L, QIAN Q, ZENG D. Map-based cloning proves qGC-6, a major QTL for gel consistency ofjaponica/indicacross, responds by Waxy in rice (Oryza sativaL.).Theoretical and Applied Genetics, 2011, 123(5): 859-867.

[33] GAO Z, ZENG D, CHENG F, TIAN Z. ALK, the key gene for gelatinization temperature, is a modifier gene for gel consistency in rice.Journal of Integrative Plant Biology, 2011, 53(9): 756-765.

[34] NAKAMURA Y, FRANCISCO P B, HOSAKA Y, SATO A, SAWADA T, KUBO A, FUJITA N. Essential amino acids of starch synthase IIa differentiate amylopectin structure and starch quality betweenjaponicaandindicarice varieties.Plant Molecular Biology, 2005, 58(2): 213-227.

[35] LESTARI P, JIANG W, CHU S, REFLINUR, SUTRISNO, KUSBIANTORO B, KIM B, PIAO R, CHO Y, LUO Z, CHIN J, KOH H. DNA markers for eating quality ofindicarice in Indonesia.Plant Breeding, 2015, 134(1): 40-48.

（責(zé)任編輯 李莉）

Association Analysis of Rice Cooking Quality Traits with Molecular Markers

GAO WeiWei, CHEN SiPing, WANG LiPing, CHEN LiKai, GUO Tao, WANG Hui, CHEN ZhiQiang
(National Engineering Research Centre of Plant Space Breeding, South China Agricultural University, Guangzhou 510642)

【Objective】 In this study, the variation of major grain-quality traits and RVA profiles of representative rice germplasm were investigated, molecular markers significantly associated with the traits were identified, aiming to provide an important foundation for improvement of grain quality of rice. 【Method】 Global grain-quality properties and their differences were surveyed with a rice panel consisted of 48 diverse germplasms collected from both China and abroad. Starch RVA profile was examined with a Rapid Visco Analyzer. The markers reported to be related to starch biosynthesizing genes and QTLs for development of rice grain were used for genotyping. Trait-marker association for grain-quality properties was detected using the general linear model with Tassel 3.0 software. Moreover, stepwise regression analysis was performed with these detected markerssignificantly associated with grain-quality traits. The phenotypic effects of the alleles and allelic combinations were estimated and both elite alleles and typical carrier genotypes were identified. 【Result】There were wide phenotypic variance and diversity in amylose content (AC), gel consistency (GC) and alkali spreading value (ASV), and the coefficient of variation (CV.) ranged from 26.5% to 36.3%. Based on inspection of RVA profile, significant differences were found in breakdown (BDV), setback (SBV) and consistence (CSV), and these parameters have preferably reflected the diverse starch paste properties among different rice varieties. Correlation analysis showed the AC was positively correlated with cool paste viscosity (CPV), SBV and CSV, while negatively correlated with peak viscosity (PKV) and BDV. The GC was negatively correlated with SBV and CSV. A total of 491 alleles were identified with 154 polymorphic markers, with an average gene diversity of 0.447 and an average polymorphic information content of 0.390. Based on the analysis of trait-marker association, a total of 22 markers were detected to associate with grain-quality traits, which explained the phenotypic variance ranged from 14.11% to 75.62%. The GBSSI gene majorly affected the properties of AC and GC, and the SNP marker of Wx-G/T explained up to 61.44% and 41.87% of the phenotypic variation for AC and GC, respectively. While the SSIIa was the major gene affecting ASV, and the phenotypic variation of ASV explained by the markers of alk-GC/TT and SSIIa-F was up to 75.62% and 74.46%. The model equations based on stepwise regression analysis of AC, GC and ASV were developed using the significant markers, whose determination coefficients were 85.30%, 40.62%, and 80.38%, respectively.【Conclusion】The starch RVA profile wass closely related to AC, GC and ASV. The RVA profile can be used to evaluate rice quality traits more comprehensively. With trait-marker association analysis, 22 markers were detected to be associated with grain-quality traits, and five of these sites were associated with both AC and GC. Regression models showed allelic combination can produce different phenotypic effects.

rice; grain-quality traits; trait-marker association; allelic variation

10.3864/j.issn.0578-1752.2017.04.001

2016-08-22；接受日期：2016-10-17

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（2016YFD0102102）、廣東省科技計(jì)劃（2015B020231011）、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（CARS-01-12）

聯(lián)系方式：高維維，E-mail：18819266044@163.com。陳思平，E-mail：867716697@qq.com。高維維和陳思平為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者陳志強(qiáng)，E-mail：chenlin@scau.edu.cn。通信作者郭濤，E-mail：guoguot@scau.edu.cn