趙潔，趙立卿，鞏校東，馮勝澤，劉星晨，鄭亞男，李志勇，孫海月，王冬雪，韓建民，谷守芹，董金皋

（1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實驗室，河北保定 071000；2河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所，石家莊 050000）

玉米大斑病菌Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族全基因組鑒定及其表達(dá)規(guī)律分析

趙潔1，趙立卿1，鞏校東1，馮勝澤1，劉星晨1，鄭亞男1，李志勇2，孫海月1，王冬雪1，韓建民1，谷守芹1，董金皋1

（1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實驗室，河北保定 071000；2河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所，石家莊 050000）

【目的】從全基因組水平上鑒定玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族及其分布，闡明該家族的序列及進(jìn)化特征，分析該家族基因在病菌不同生長發(fā)育時期的表達(dá)規(guī)律?！痉椒ā坷蒙镄畔W(xué)手段搜索玉米大斑病菌全基因組數(shù)據(jù)庫，鑒定Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族；采用MEGA 5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析；利用在線工具GSDS（gene structure display server）（http://gsds1.cbi.pku.edu.cn/index.php）繪制基因結(jié)構(gòu)圖；利用Clustal X 1.83軟件分析Homeobox保守結(jié)構(gòu)域(HOX保守結(jié)構(gòu)域）的氨基酸序列特征；利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa_sopma.html）對Homeobox蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線預(yù)測；利用實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）技術(shù)分析Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族在病菌不同發(fā)育時期的表達(dá)模式?！窘Y(jié)果】在玉米大斑病菌中鑒定了8個Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族成員（StHTF1-8），根據(jù)基因結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化特征將其分為4類；亞細(xì)胞定位預(yù)測分析表明，這8個蛋白全部定位在細(xì)胞核中；該家族成員均含有HOX保守結(jié)構(gòu)域，其二級結(jié)構(gòu)具有特征性的“螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋”（helix-turn-helix）結(jié)構(gòu)；利用qRT-PCR技術(shù)對該家族成員在菌絲、分生孢子形成、芽管形成、附著胞及侵入絲形成等5個時期的表達(dá)規(guī)律分析，發(fā)現(xiàn)不同基因在病菌不同發(fā)育時期具有不同的表達(dá)水平，其中StHTF1在菌絲發(fā)育、分生孢子及附著胞形成等3個時期的表達(dá)水平相對較高，StHTF3、StHTF4在分生孢子形成時期表達(dá)水平最高，StHTF6在芽管形成時期的表達(dá)水平最高，StHTF2、StHTF5、StHTF7和StHTF8在附著胞形成時期的表達(dá)水平均較高?！窘Y(jié)論】玉米大斑病菌包括Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族包含8個成員，在進(jìn)化上分為4大類，全部成員均分布在細(xì)胞核內(nèi)，其編碼蛋白質(zhì)均含有保守的HOX結(jié)構(gòu)域及“螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋”空間結(jié)構(gòu)；該基因家族成員在病菌不同發(fā)育時期呈現(xiàn)不同的表達(dá)規(guī)律。

玉米大斑病菌；Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族；系統(tǒng)進(jìn)化；基因表達(dá)

0 引言

【研究意義】Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族是一類結(jié)構(gòu)和功能均具有保守性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，該基因家族成員編碼的同源異型結(jié)構(gòu)域蛋白（Homeobox protein）可以與靶基因的調(diào)控序列結(jié)合而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控個體的生長發(fā)育及細(xì)胞分化等方面[1-2]。研究玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）基因組中Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族的分布、基因結(jié)構(gòu)特征與表達(dá)模式，對進(jìn)一步研究其在該病菌生長發(fā)育及致病性中的功能具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Homeobox protein是廣泛存在于真核生物中的一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，同源結(jié)構(gòu)域含有3個α-螺旋，其中螺旋Ⅰ位于肽段的N末端，與螺旋Ⅱ之間有一個環(huán)（loop），且螺旋Ⅱ與螺旋Ⅲ之間形成“螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋”（helix-turn-helix）DNA結(jié)合基序[3]。研究還發(fā)現(xiàn)，螺旋Ⅲ結(jié)構(gòu)最為保守，其中的幾個氨基酸殘基（如玉米Kn1氨基酸序列中W48、F49、N51、R53）幾乎在所有同源蛋白中都是相同的[4]。研究植物及動物中的Homeobox基因時發(fā)現(xiàn)，這些不同的基因可以被劃分為不同的類型。在植物中可以分為14個類群，分別是HD-ZIPⅠ、HD-ZIPⅡ、HD-ZIPⅢ、HD-ZIPⅣ、WOX、PLINC、BEL、KNOX、DDT、PINTOX、PHD、LD、NDX及SAWADEE[5-6]；在動物中劃分為8個不同類型，依次為Antp、TALE、SIX、LIMJPOU、PRD、 CUTZF、HNF和PROS[7-8]，這些不同的進(jìn)化特征表明不同類型的Homeobox基因可能具有不同的功能。研究還發(fā)現(xiàn)，真菌中的Homeobox基因家族成員主要參與菌絲的絲狀生長、分生孢子萌發(fā)、有性生殖及致病性等生物過程。如在已經(jīng)完成全基因組測序的模式真菌釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中發(fā)現(xiàn)9個不同的Homeobox基因[1]，其中參與調(diào)控病菌生物過程的基因有7個，如Yox1和Yhp1是兩個起負(fù)調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，它們的表達(dá)影響細(xì)胞減數(shù)分裂過程中M/G1時期的生理活動[9]；另外，YHP1通過結(jié)合IME1啟動子區(qū)影響減數(shù)分裂過程[10]，轉(zhuǎn)錄抑制因子NRM1和YHP1抑制減數(shù)分裂G1時期特異基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響細(xì)胞分化過程[11]；在絲狀真菌玉米黑粉菌（Ustilago maydis）中的Homeobox基因bW和bE與病菌的菌絲生長及致病性相關(guān)[12]；在禾谷鐮孢（Fusarium graminearum）中的Homeobox 基因htf1可特異調(diào)控分生孢 子的產(chǎn)生[13]。但在玉米大斑病菌中對Homeobox家族的組成、分子結(jié)構(gòu)特征及表達(dá)規(guī)律的研究尚未見報道?！颈狙芯壳腥朦c】玉米大斑病（Northern corn leaf blight）是由玉米大斑病菌引起的一種重要的真菌性病害，該病害在世界玉米產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，流行年份可導(dǎo)致玉米產(chǎn)量減產(chǎn)達(dá)50%以上[14]。玉米大斑病菌全基因組測序的完成為從分子水平上分析病菌基因家族成員的結(jié)構(gòu)特征提供了良好的平臺?；诖?，本文在通過搜索玉米大斑病菌基因組數(shù)據(jù)庫、獲得Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族序列的基礎(chǔ)上，整體分析該家族的結(jié)構(gòu)特征及其表達(dá)規(guī)律?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用生物信息學(xué)手段從全基因組水平上鑒定玉米大斑病菌Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族的數(shù)目及其分布，闡明該基因家族的序列、結(jié)構(gòu)及進(jìn)化特征，利用real-time PCR技術(shù)分析該基因家族在病菌各個生長時期的表達(dá)特點，探索Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族在病菌不同生長發(fā)育時期的表達(dá)規(guī)律。

1 材料與方法

試驗于2015—2016年在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)完成。

1.1 供試菌株

玉米大斑病菌野生型菌株01-23，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實驗室保存。

1.2 主要試劑

總RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于上海生工生物工程有限公司。

1.3 玉米大斑病菌Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定

主要參照經(jīng)典的Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定方法進(jìn)行并略有改動[4,7]。利用PFAM數(shù)據(jù)庫進(jìn)行在線搜索獲得Homeobox基因家族的隱馬爾可夫模型（HMM）；通過hmmsearch程序搜索玉米大斑病菌中全基因組的蛋白序列，E-value值設(shè)定為10—50；利用在線工具SMART分析結(jié)構(gòu)域；選取包含Homeobox保守結(jié)構(gòu)域（HOX結(jié)構(gòu)域）、保守的基序序列為候選成員。利用在線服務(wù)器ExPAS中的生物信息學(xué)軟件ExPASy-ProtParam tool（http://web.expasy. org/protparam/）對玉米大斑病菌中所獲得的Homeobox蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，如氨基酸數(shù)目、相對分子質(zhì)量、不穩(wěn)定系數(shù)及等電點。通過在線軟件WoLF PSORT（http://www.genscript.com/psort/wolf_ psort.html）預(yù)測所有蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.4 玉米大斑病菌Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)構(gòu)特征及系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過對玉米大斑病菌全基因組數(shù)據(jù)庫（JGI，http://genome.jgi-psf.org/Settu1/Settu1.home.html）的搜索得到Homeobox基因家族基因的CDS序列和全基因組序列。利用在線工具GSDS（gene structure display server）（http://gsds1.cbi.pku.edu.cn/index.php）繪制基因結(jié)構(gòu)圖。利用在線生物信息學(xué)軟件SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）對上述蛋白進(jìn)行Homeobox結(jié)構(gòu)域分析，并利用Clustal X 1.83軟件對各個Homeobox結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列進(jìn)行比對。使用軟件MEGA 5.0中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap值設(shè)置為1 000。

1.5 玉米大斑病菌Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族表達(dá)模式分析

菌絲的收集：將野生型菌株01-23接種于PDA培養(yǎng)基中，用封口膜密封培養(yǎng)皿，25℃黑暗培養(yǎng)10 d，收集菌絲體；分生孢子的收集：將野生型菌株01-23接種于LCA培養(yǎng)基（產(chǎn)孢培養(yǎng)基）中，25℃黑暗培養(yǎng)16 d，誘使菌絲產(chǎn)生分生孢子，然后在平皿中加入10 mL滅菌的ddH2O，用槍頭輕刮培養(yǎng)基表面，將菌絲與分生孢子懸浮液經(jīng)3層紗布過濾以除去菌絲體，收集分生孢子；芽管、附著胞及侵入絲時期的病菌材料的收集：將上述過濾后的孢懸液稀釋至濃度為1×104個孢子/mL，然后在表面消毒的復(fù)印膜上滴加分生孢子懸浮液，25℃黑暗保濕條件下誘使其萌發(fā)，當(dāng)誘導(dǎo)時間分別為4、10、24 h時，分別收集孢懸液至1.5 mL EP中，3 000 r/min離心收集芽管時期、附著胞時期及侵入絲形成時期的材料。將收集的樣品保存于-80℃?zhèn)溆?。所有試驗設(shè)置3次重復(fù)。

表達(dá)模式分析：利用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取玉米大斑病菌野生型總RNA，按照張鑫等[15]的方法合成第一鏈cDNA。以18S rRNA作為內(nèi)參，擴(kuò)增Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族cDNA片段，引物設(shè)計見表1。分別以不同發(fā)育時期的第一鏈cDNA為模板，按以下條件進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，10 μL擴(kuò)增體系中含有cDNA模板1.0 μL；Mix 5.0 μL；正義引物（10 μmol·L-1）及反義引物各0.4 μL；ROX 0.2 μL；ddH2O 3 μL。上述步驟完成后，將樣品加入96孔板，放于ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)。以野生型菌株的基因轉(zhuǎn)錄水平作對照，采用比較Ct值法（2-ΔΔCt法）分析各個基因在野生型菌株中的相對表達(dá)量。該家族的各基因在不同發(fā)育時間的相對表達(dá)量以菌絲時期的基因轉(zhuǎn)錄水平為對照。

2 結(jié)果

2.1 玉米大斑病菌Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定

利用生物信息學(xué)方法從玉米大斑病菌全基因組中共鑒定得到8個Homeobox轉(zhuǎn)錄因子基因，分別命名為StHTF1—StHTF8。進(jìn)一步利用基因組序列及注釋信息分析該基因家族的基因組定位，發(fā)現(xiàn)該家族成員散布在病菌基因組中，分布在6個scaffold上，并且位于負(fù)鏈的家族成員居多。其中，StHTF1單獨定位于scaffold_2正鏈上，StHTF2單獨定位于scaffold_6（正鏈）上，StHTF3單獨定位于scaffold_7（正鏈）上，StHTF4和StHTF5定位于scaffold_11負(fù)鏈，且StHTF6定位于scaffold_11正鏈上，StHTF7和StHTF8定位于scaffold_3負(fù)鏈上（表2）。

利用在線軟件ProtParam預(yù)測病菌中所有Homeobox蛋白的理化特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這8個Homeobox蛋白在氨基酸數(shù)目、相對分子質(zhì)量及等電點方面均不同。從該家族各基因所編碼的蛋白來看，其長度在337—869 aa，且大部分長度在600 aa左右；從預(yù)測的Homeobox蛋白的等電點數(shù)據(jù)可以得知，這些蛋白大多呈酸性，其中只有2個基因編碼的蛋白（StHTF4和StHTF7）呈堿性；通過預(yù)測還發(fā)現(xiàn)這些蛋白都屬于不穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)＞40考慮為不穩(wěn)定）；通過亞細(xì)胞定位預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，這8個蛋白均定位在細(xì)胞核中（表2）。

表1 實時熒光定量PCR擴(kuò)增所用引物Table 1 Primers used in qRT-PCR

表2 玉米大斑病菌中的Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族信息Table 2 The information of Homeobox transcription factor family in S. turcica

2.2 玉米大斑病菌Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族基因結(jié)構(gòu)特征及系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過對Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族的基因結(jié)構(gòu)分析顯示，所有家族成員基因均有內(nèi)含子，其中StHTF1、StHTF3及StHTF5均含有1個內(nèi)含子，StHTF4有3個內(nèi)含子，其余基因含有2個內(nèi)含子（圖1）。

為了深入分析玉米大斑病菌Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族與其他物種同源基因的進(jìn)化關(guān)系，對該家族進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。通過與釀酒酵母、禾谷鐮孢、粗糙脈胞菌（Neurospora crassa）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）等其他真菌物種的氨基酸序列對比，并利用MEGA 5.0中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)真菌Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族可以進(jìn)一步分為4類：其中在玉米大斑病菌中StHTF1、StHTF2為第Ⅰ類；StHTF3、StHTF4為第Ⅱ類；StHTF5、StHTF6、StHTF7和StHTF8為第Ⅲ類，第Ⅲ類還分為2個亞類，StHTF7屬于一個亞類，其他3個蛋白都具有2—4個串聯(lián)的ZnF-C2H2鋅指結(jié)構(gòu)聚為第Ⅳ類。進(jìn)一步根據(jù)與其他物種中Homeobox轉(zhuǎn)錄因子同源基因的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，分別將玉米大斑病菌Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族成員命名為StHTF1—StHTF8。

2.3 玉米大斑病菌Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族保守基序分析及序列比對

圖1 玉米大斑病菌Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族基因結(jié)構(gòu)特征Fig. 1 The structure characteristics of Homeobox transcription factor family in S. turcica

利用在線軟件SMART和InterProScan對這8個蛋白序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8個基因所編碼的蛋白均含有同源異型盒結(jié)構(gòu)域HOX，但該結(jié)構(gòu)域在各個蛋白中的位置有所不同，在StHTF1、StHTF3、StHTF4、StHTF6和StHTF8中HOX靠近N末端；在StHTF2和StHTF5中位于中部，而在StHTF7中則靠近C末端。進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)，部分基因除了含有HOX結(jié)構(gòu)域外，還有其他結(jié)構(gòu)域，如StHTF5、StHTF6和StHTF8還含有2—4個串聯(lián)的ZnF-C2H2鋅指結(jié)構(gòu)（圖3-A）。

利用SMART在線軟件分析病菌中HOX蛋白的氨基酸序列，并從稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、禾谷鐮孢、釀酒酵母、粗糙脈胞菌和黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）的數(shù)據(jù)庫中分別找到已經(jīng)注釋為Homeobox蛋白的HOX結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，用ClustalX軟件對這些氨基酸序列進(jìn)行比對分析，再利用在線軟件BoxShade Server進(jìn)行多重比對序列著色標(biāo)記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所比較的這些蛋白中同源域的氨基酸序列相似，且在L16、P29、W52和R57位置上均具有相同的氨基酸殘基（圖3-B）。

通過對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，這些Homeobox蛋白在空間結(jié)構(gòu)上都具有典型的螺旋結(jié)構(gòu)（圖3-B黑色橫線）。這4個相同的保守氨基酸殘基分別位于螺旋Ⅰ、loop環(huán)和螺旋Ⅲ，且這種螺旋結(jié)構(gòu)與Homeobox蛋白的空間結(jié)構(gòu)“螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋”（helix-turn-helix）相符。通過比對還發(fā)現(xiàn)，不同物種間HOX蛋白的氨基酸殘基在螺旋Ⅲ位置上具有相對多的著色區(qū)域，說明螺旋Ⅲ具有更高的保守性（圖3-B）。利用SOPMA在線服務(wù)器預(yù)測Homeobox家族蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這8個蛋白的二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲含量都比較高，如StHTF7蛋白中自由卷曲度高達(dá)64.99%，StHTF3蛋白中含量為63.99%，其次為α-螺旋，最后是β-折疊，且β-轉(zhuǎn)角含量最少。

2.4 玉米大斑病菌Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族表達(dá)模式分析

圖2 玉米大斑病菌Homeobox基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig. 2 The rooted phylogenetic tree of Homeobox transcription factor family in S. turcica

利用實時熒光定量PCR方法對Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族在菌絲發(fā)育、分生孢子形成、芽管萌發(fā)、附著胞及侵入絲形成等5個時期基因相對表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族中的8個基因在這5個時期均有表達(dá)，但在不同階段基因表達(dá)水平存在顯著差異（P≤0.05）。其中StHTF3、StHTF4具有相似的表達(dá)模式，在分生孢子形成時期表達(dá)量均顯著高于菌絲時期，而在芽管萌發(fā)、附著胞及侵入絲形成時期表達(dá)量均顯著下降；StHTF7、StHTF8也具有相似的表達(dá)模式，在分生孢子及附著胞形成時期的表達(dá)量均顯著高于其他時期；StHTF5、StHTF6在芽管和附著胞時期顯著高于菌絲和附著胞時期，而相較于StHTF5，StHTF6在侵入絲時期的表達(dá)量均比菌絲發(fā)育及分生孢子形成時期高40多倍，甚至比附著胞時期高2倍；StHTF2在附著胞形成時期的表達(dá)量顯著高于其他時期，而在芽管形成和侵入絲時期表達(dá)量較低；StHTF1在這5個生長時期的表達(dá)量均較低，但在菌絲發(fā)育、分生孢子及附著胞形成等3個時期的表達(dá)水平相對較高（圖4）。

圖3 玉米大斑病菌Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族保守基序分析及序列比對Fig. 3 Conservative motif analysis and sequence alignments of Homeobox transcription factor family from S. turcica

圖4 Homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族在玉米大斑病菌不同發(fā)育時期的表達(dá)模式Fig. 4 Expression profiles of 8 Homeobox genes assayed by qRT-PCR in S. turcica

3 討論

隨著對動物、植物及真菌基因組研究的深入，利用比較基因組學(xué)研究策略分析基因家族及基因功能已成為目前基因功能研究的熱點之一。在動物、植物及真菌中有關(guān)基因家族的研究已有報道，例如大豆LEA基因家族[16]、線蟲bHLH家族[17]以及酵母YRF基因家族[18]、玉米大斑病菌MAPK超家族[19]及CaMK家族[20]等，這為后續(xù)基因家族的功能分析鑒定了理論基礎(chǔ)。

迄今為止，在某些動物[21]、植物[22]及真菌[23-24]中均鑒定了Homeobox基因家族，但其家族成員的種類和數(shù)目有所不同。在動物中發(fā)現(xiàn)的Homeobox基因共有16類，包括ANTP、PRD、PRD-LIKE、POU、HNF、CUT、LIM、ZF、CERS、PROS、SIX/SO、IRO、MKX、TGIF、PBC和MEIS等[25]；在植物中發(fā)現(xiàn)的Homeobox基因主要分為11類，包括HD-ZIP、WOX、NDX、PHD、PLINC、LD、DDT、SAWADEE、PINTOX、KNOX 和BEL等[25]；在模式生物釀酒酵母中鑒別出9個Homeobox基因[26]；在禾谷鐮孢中鑒定了12個可能的Homeobox基因[4]；在稻瘟病菌中鑒定出8個Homeobox基因[27]。本研究通過對玉米大斑病菌全基因組分析，鑒定出了8個Homeobox基因。對于上述在不同生物類群及物種中Homeobox基因家族種類及數(shù)目存在較大差異的原因，可能是因為物種本身在進(jìn)化中的位置不同，在越高等的物種如動物及植物中該基因家族成員數(shù)目越龐大，在較為低等的物種如酵母和絲狀真菌中該家族成員數(shù)目較少，這也從另外一個角度說明該家族在調(diào)控不同物種生長發(fā)育過程中具有重要地位。但由于家族成員較多，不同家族成員間結(jié)構(gòu)還存在一定差異，是否需要根據(jù)其他結(jié)構(gòu)特征對該家族進(jìn)行更細(xì)致的分類尚需深入探討。

研究發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母及絲狀真菌中發(fā)現(xiàn)的Homeobox基因家族成員除含有HOX保守結(jié)構(gòu)域外，還含有ZnF-C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，但其數(shù)目有所不同。其中子囊菌亞門（Ascomycete）肉座菌亞綱（Hypocreomycetidae）的真菌中包含較多數(shù)量的Homeobox-C2H2基因，比如在棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae）和尖鐮孢中均鑒定出7個Homeobox-C2H2基因[28]；在糞殼菌亞綱（Sordariomycetidae）和錘舌菌綱（Leotiomycetes）中則含有較少的Homeobox-C2H2基因，如稻瘟病菌、粗糙脈胞菌、灰葡萄孢、核盤菌（Sclerotiniasclerotiorum）等都是只包含1個Homeobox-C2H2基因，而酵母中不含Homeobox-C2H2基因[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，在玉米大斑病菌中存在8個Homeobox基因，其中3個基因StHTF5、StHTF6、StHTF8具有ZnF-C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域。另外，在稻瘟病菌中的研究發(fā)現(xiàn)，含有ZnF-C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域的Homeobox-C2H2基因（MGG_01730）對病菌的生長發(fā)育和致病性都沒有作用[27]，而本研究發(fā)現(xiàn)玉米大斑病菌中具有類似結(jié)構(gòu)的基因具有不同的作用，其中StHTF5、StHTF8參與附著胞的形成，StHTF6對芽管形成具有重要的調(diào)控作用。由此可見，不同真菌中含有Homeobox-C2H2基因數(shù)目的不同與物種的進(jìn)化水平密切相關(guān)，造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于基因復(fù)制事件。從其功能分析來看，其保守的Homeobox-C2H2結(jié)構(gòu)可能通過調(diào)控不同的靶基因來調(diào)控不同的代謝過程，其具體的機(jī)制尚需要深入研究。

Homeobox基因編碼的Homeobox蛋白作為一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在真核生物的個體發(fā)育及細(xì)胞分化的調(diào)控中起著重要作用。在動物中Homeobox基因在胚胎發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化等方面發(fā)揮重要作用[21]；在植物中Homeobox基因主要是影響胚胎發(fā)育、葉的發(fā)育、細(xì)胞間的物質(zhì)運輸及花的演化等方面[15-22]；在真菌中，釀酒酵母、柄孢霉菌（Podospora anserina）、玉米黑粉菌等中均發(fā)現(xiàn)Homeobox基因，但其功能存在差異，如在釀酒酵母中Homeobox基因CUP9在乳酸為唯一碳源時，能使酵母細(xì)胞在銅離子高度富集的環(huán)境中生長[23]；在玉米黑粉菌中Homeobox基因參與調(diào)控菌絲的極性生長、致病性及有性世代[23-24]；在柄孢霉菌中Homeobox基因抑制分生孢子的產(chǎn)生并影響菌絲的形態(tài)[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，玉米大斑病菌中的8個Homeobox基因可能分別參與病菌的不同生長發(fā)育過程，如StHTF2、StHTF5、StHTF6、StHTF7和StHTF8均在附著胞形成時期具有較高水平的表達(dá)量，而StHTF5、StHTF6、StHTF7和StHTF8除了在附著胞形成時期具有較高的表達(dá)量外，StHTF5在芽管時期，StHTF6在芽管和侵入絲時期，StHTF3、StHTF4、StHTF7、StHTF8在分生孢子均具有較高的表達(dá)量。由此可見，在不同的絲狀真菌中Homeobox基因具有不同的生物學(xué)功能，其每個成員的具體調(diào)控機(jī)制尚需要深入探討。下一步將利用靶基因敲除、ChIP等技術(shù)分析每個基因的功能及其調(diào)控機(jī)制，以期為明確真菌中Homeobox基因家族的功能提供更多可以借鑒的數(shù)據(jù)支持。

4 結(jié)論

玉米大斑病菌包括8個Homeobox轉(zhuǎn)錄因子基因，共分為4類，全部成員均分布在細(xì)胞核內(nèi)，所有基因的編碼蛋白質(zhì)均含有HOX保守結(jié)構(gòu)域及“螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋”空間結(jié)構(gòu)；該基因家族成員在病菌不同發(fā)育時期呈現(xiàn)不同的表達(dá)規(guī)律。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Identification of Homeobox Transcription Factor Family in Genome-Wide and Expression Pattern Analysis of the Members in Setosphaeria turcica

ZHAO Jie1, ZHAO LiQing1, GONG XiaoDong1, FENG ShengZe1, LIU XingChen1, ZHENG YaNan1, LI ZhiYong2, SUN HaiYue1, WANG DongXue1, HAN JianMin1, GU ShouQin1, DONG JinGao1
(1Mycotoxin and Molecular Plant Pathology Laboratory, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, Hebei;2Millet Research Institute, Hebei Academy of Agriculture and Forestry, Shijiazhuang 050000)

【Objective】 The objectives of this study are to identify Homeobox transcription factor family fromSetosphaeria turcicagenome, and to predict the locations of their corresponding coding proteins in the cells, gene structure and evolutionarycharacteristics, as well as to explore their expression patterns at different growth and development stages inS. turcica. 【Method】Homeobox transcription factor family was identified based onS. turcicagenome database and bioinformatics methods. Phylogenetic tree were created using the MEGA5.0 program. Gene structure characteristics were analyzed by GSDS software, which was a gene structure display server online (http://gsds1.cbi.pku.edu.cn/index.php). Amino acid sequence characteristics of the genes in Homeobox transcription factor family were compared using software Clustal X 1.83. The secondary structures of homeodomain proteins were predicted by employing software SOMPA. Three-dimensional structures of Homeobox transcription factor family were doped out using Software I-TASSER. Homeobox genes expression patterns were detected at different developmental stages based on quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analysis. 【Result】 A total of 8 Homeobox genes were systematically identified fromS. turcicagenome and classified into 4 groups according to the gene structure and phylogenetic tree. Subcellular localization showed that all of the predicted proteins located in the cell nuclei. The family members contained conserved Homeobox domains and typical“helix-turn-helix” secondary structures. Different gene family members took on different expression levels at different development stages inS. turcica. The expression level ofStHTF1was significantly higher at mycelium, spore and appressorium formation stages than other stages.StHTF3,StHTF4had the highest expression level at spore formation stage than other stages inS.turcica, whileStHTF6was the highest at germ tube formation stage. Moreover,StHTF2,StHTF5,StHTF7andStHTF8appeared higher expression level at appressorium formation stage than other genes. 【Conclusion】 Homeobox transcription factor family inS. turcicacontains 8 genes which are classed into 4 categories and located in the nuclei. The proteins encoded by the genes contain conserved Homeobox domain and “helix-turn-helix” spatial structure. Homeobox gene family members inS. turcicaappeared diverse expression profiles which will lay the foundation for identifying the functions of the gene family.

Setosphaeria turcica; Homeobox transcription factor family; system evolution; gene expression

10.3864/j.issn.0578-1752.2017.04.007

2016-10-24；接受日期：2016-11-16

國家自然科學(xué)基金（31271997，31371897）、大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃（201610086052，20161805）

聯(lián)系方式：趙潔，E-mail：295277949@qq.com。趙立卿，E-mail：370172469@qq.com。趙潔和趙立卿為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者谷守芹，E-mail：gushouqin@126.com。通信作者董金皋，E-mail：dongjingao@126.com