趙玉紅, 李 欣, 崔建林, 周 浩, 李登文,李小菊, 張金紅, 趙立青

(南開大學(xué) a. 生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心; b. 醫(yī)學(xué)院， 天津 300071)

一種適于本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)的雙向電泳技術(shù)體系

趙玉紅a, 李 欣a, 崔建林b, 周 浩a, 李登文a,李小菊a, 張金紅a, 趙立青a

(南開大學(xué) a. 生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心; b. 醫(yī)學(xué)院， 天津 300071)

雙向電泳技術(shù)是當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的重要技術(shù)。設(shè)計(jì)“雙向電泳檢測熱休克處理對細(xì)菌蛋白表達(dá)譜的影響”的實(shí)驗(yàn)，以PGEX-4T-2大腸桿菌中可溶性總蛋白為研究對象, 采用雙向電泳技術(shù)篩選熱休克處理后有差異表達(dá)的蛋白。實(shí)驗(yàn)獲得了穩(wěn)定性較高、分辨率和重復(fù)性較好的電泳圖譜，建立了一種適于本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)的雙向電泳技術(shù)體系。通過該實(shí)驗(yàn)，學(xué)生可以掌握雙向電泳技術(shù)的基本原理、實(shí)驗(yàn)方法以及蛋白提取的一般思路與方法。

雙向電泳； 實(shí)驗(yàn)教學(xué)； 熱休克； 細(xì)菌蛋白表達(dá)譜

0 引 言

20世紀(jì)90年代中期，蛋白質(zhì)組學(xué)作為功能基因組學(xué)的重要支柱應(yīng)運(yùn)而生[1]，特別在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域，蛋白質(zhì)組學(xué)是尋找人類疾病新的生物標(biāo)志物和發(fā)現(xiàn)藥物治療新靶點(diǎn)的一種主要工具[2]。雙向電泳(Two-Dimensional Electrophoresis, 2-DE)作為蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)之一，是目前唯一一種可以將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時分離的方法，可用于研究樣品中總蛋白、不同樣品蛋白質(zhì)表達(dá)差異、蛋白質(zhì)間相互作用、以及蛋白修飾等[3]。在目前發(fā)表的與蛋白組學(xué)研究相關(guān)的論文中, 有80% 以上的論文中涉及雙向電泳技術(shù)[4]，因此，有必要在本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中引入該項(xiàng)技術(shù)。

常規(guī)雙向電泳存在電泳時間長、系統(tǒng)產(chǎn)熱多、微量的蛋白質(zhì)樣品極易擴(kuò)散、不利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察等弊端。因此,建立實(shí)驗(yàn)檢出的靈敏度高、電泳時間短、適合學(xué)生操作的雙向電泳條件非常必要[5]。

結(jié)合現(xiàn)代生物科學(xué)發(fā)展的需要，根據(jù)本科生實(shí)驗(yàn)教學(xué)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)“雙向電泳檢測熱休克處理對細(xì)菌蛋白表達(dá)譜的影響”的實(shí)驗(yàn)，建立了一種適于本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)的雙向電泳技術(shù)體系。以PGEX-4T-2大腸桿菌總蛋白為研究對象,以37 ℃培養(yǎng)的大腸桿菌作為對照組，42 ℃熱休克處理的大腸桿菌作為實(shí)驗(yàn)組，選擇7 cm、pH 3～10 IPG膠條，采用丙酮沉淀大腸桿菌中的總蛋白，上樣量為175 μg，進(jìn)行雙向電泳。經(jīng)電泳結(jié)果圖像掃描、PDQuest分析軟件分析，篩選差異表達(dá)蛋白。

1 主要實(shí)驗(yàn)儀器

超聲破碎儀,酶標(biāo)儀,Bio Rad雙向電泳系統(tǒng)(包括等點(diǎn)聚焦儀、GS-800光密度儀以及PDQuest分析軟件等),垂直板電泳設(shè)備(電源、電泳槽、制膠架等),高速冷凍離心機(jī),搖床等。

2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

(1) 實(shí)驗(yàn)材料：大腸桿菌(E.coli，pGEX-4T-2)。

(2) 試劑：pH 3～10兩性電解質(zhì)載體購自Bio Rad，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Solarbio，AP，TEMED，SDS，甘油，Tris，溴酚藍(lán)，甘氨酸購自sigma，尿素，CHAPS，DTT，碘乙酰胺，低熔點(diǎn)瓊脂糖等購自楠梓商貿(mào)有限公司，MilliQ水，其余試劑為國內(nèi)分析純。

(3) 耗材：7cm，pH 3～10 IPG預(yù)制膠條購自GE、96孔酶標(biāo)板。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 大腸桿菌中可溶性總蛋白的提取與定量

(1) 熱休克處理：將活化的大腸桿菌接種至2瓶250 mL LB(Amp)培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，2瓶細(xì)菌分別繼續(xù)培養(yǎng)37 ℃ 40 min、42 ℃ 40 min；

(2) 菌體蛋白提取及含量檢測：4 ℃，8 000 r/min離心5 min收集菌體，以預(yù)冷的50 mM pH 8.0 Tris-HCl重懸菌體至20 mL；低溫下超聲波裂解菌體，至懸浮液清亮(200 W，破5 s，停6 s，26個循環(huán))；4 ℃，12 000 r離心20 min，收集含可溶性蛋白的上清，分裝入2 mL離心管中，每管0.5 mL；加入3倍體積-20 ℃預(yù)冷丙酮(0.5 mL菌體+1.5 mL丙酮)，-20 ℃沉淀蛋白2 h(沉淀等體積的兩管蛋白，其中一管用于測定蛋白質(zhì)濃度)；12 000 r/min，4℃，30 min收集蛋白，棄上清。冷丙酮洗沉淀2次，-20 ℃保存?zhèn)溆谩０凑赵噭┖惺褂谜f明書，測定樣品蛋白含量。

3.2 雙向電泳

(1) 第一向等電聚焦電泳(IEF)。蛋白沉淀溶于水化上樣緩沖液(8 M尿素、4 % CHAPS、65 mM DTT、0.2 % Bio-Lyte、0.001 %溴酚藍(lán))，終濃度為1.4 mg/ml，上樣量175 μg。膠條加1.5 mL礦物油覆蓋。設(shè)置等電聚焦程序：18 ℃被動水化12 h；250 V(線性)30 min；500 V(快速)30 min；4 000 V(線性)3 h；4 000 V(快速)20 000 h；500 V(快速)，任意時間。

(2) 膠條平衡。聚焦好的膠條先后加入2.5 mL平衡緩沖液I(6 M尿素、0.2 % SDS、0.375 M pH 8.8 Tris-HCl、20 %甘油、2 % DTT)和2.5 mL平衡緩沖液II(6 M尿素、0.2 % SDS、0.375 M pH 8.8 Tris-HCl、20 %甘油、2.5 % DTT)，分別平衡15 min。平衡后的膠條浸沒在1×TAE電泳緩沖液中。

(3) 第二向SDS-PAGE電泳。配制12 %的分離膠，膠厚1 mm。將平衡好的膠條轉(zhuǎn)移至SDS—PAGE膠，用0.5 %低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液(0.5 %低熔點(diǎn)瓊脂糖、25 mM Tris、 192 mM甘氨酸、0.1% SDS、 0.001 %溴酚藍(lán))封閉。將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中，加入電泳緩沖液(25 mM Tris，200 mM Gly，0.1 % SDS)，接通電源，初始設(shè)置低電流(5mA/gel/17cm)或低電壓，待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，加大電流(或電壓)(20～30 mA/gel/17cm)，待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時停止電泳。電泳結(jié)束后，取出凝膠，切角以標(biāo)記正負(fù)極；0.25%考馬斯亮蘭R250染液(考馬斯亮藍(lán)R250 2.5 g，無水乙醇250 mL，冰乙酸80 mL，水670 mL)室溫染色20 min；用水漂洗凝膠，微波爐水煮15 min，2～3次。加入脫色液(7.5 %冰乙酸，5%甲醇)脫色過夜，至獲得清晰蛋白點(diǎn)。

3.3 電泳結(jié)果掃描、PDQuest8.0 軟件分析電泳結(jié)果

電泳結(jié)束后，用GS-800圖像掃描儀對凝膠進(jìn)行掃描，掃描方式為透射。PDQuest8.0分析軟件進(jìn)行圖譜分析。

4 結(jié)果與討論

4.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用超聲破碎法進(jìn)行細(xì)胞破壁，利用丙酮沉淀大腸桿菌中總蛋白，選擇7 cm、 pH 3-10 IPG預(yù)制膠條，上樣量為175 μg，進(jìn)行雙向電泳，結(jié)果如圖1、2所示。從圖1、2中可以看出，通過該雙向電泳體系能夠獲得穩(wěn)定性較高、分辨率和重復(fù)性較好的電泳圖譜。經(jīng)PDQuest8.0分析軟件初步分析，37℃培養(yǎng)的大腸桿菌對照組和42℃熱休克處理的大腸桿菌實(shí)驗(yàn)組分別檢測到500多個清晰的蛋白點(diǎn)，未篩選出有明顯表達(dá)差異的蛋白點(diǎn)。

4.2 注意事項(xiàng)

(1) 超聲破碎過程中會產(chǎn)生大量的熱，因此整個過程必須冰上操作且間歇處理；

(2) 本實(shí)驗(yàn)采用BCA法對蛋白進(jìn)行定量。蛋白用丙酮沉淀吹干后，往往難以完全溶解在PBS中，定量前離心處理會有效降低實(shí)驗(yàn)誤差；

圖1 對照組(37℃培養(yǎng)的大腸桿菌)總蛋白雙向電泳圖譜

圖2 實(shí)驗(yàn)組(42℃熱休克處理的大腸桿菌)總蛋白雙向電泳圖譜

(3)蛋白樣品易溶于水化上樣緩沖液，但為防止少量未溶蛋白對等點(diǎn)聚焦及SDS-PAGE電泳的影響，離心后再上樣；加樣時注意不要產(chǎn)生氣泡，否則影響到膠條中蛋白質(zhì)的分布。

(4) 兩性電解質(zhì)載體所形成的pH梯度的穩(wěn)定性對電泳結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復(fù)性有非常重要的影響[6]，本實(shí)驗(yàn)所使用的兩性電解質(zhì)載體購自Bio Rad，效果優(yōu)于國產(chǎn)試劑；

(5) 灌制SDS-PAGE膠時，膠面一定要平，否則第一向的膠條不能很好的和膠面接觸，影響電泳效果[7]。經(jīng)驗(yàn)做法：TEMED量不要太多，以30min左右能凝最好；灌膠以水封膠面后，稍微水平搖晃一下，置于水平桌面待其自然凝固。

4.3 討論

(1) 課程組織。本實(shí)驗(yàn)適于以綜合實(shí)驗(yàn)的形式開設(shè)，進(jìn)度宜安排24學(xué)時，小班授課。第一天進(jìn)行蛋白樣品的制備與定量以及第一向等點(diǎn)聚焦電泳；第二天配制分離膠，進(jìn)行第二向電泳，染色、脫色；第三天電泳結(jié)果掃描及圖像分析。實(shí)驗(yàn)以單人操作的形式為主，每人一根膠條。按照人數(shù)，將學(xué)生劃分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，組間的結(jié)果作為平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果參考。

(2) 染色。不同的凝膠染色方法對雙向電泳成像效果以及蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測有很大影響[8]。實(shí)驗(yàn)室常用的染色方法主要有考馬斯亮藍(lán)染色和銀染?？捡R斯亮藍(lán)染色靈敏度雖然遠(yuǎn)低于銀染，但考馬斯亮藍(lán)染色過程簡單, 操作簡便，染色后的背景及對比度好[9-11]。故本實(shí)驗(yàn)采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，結(jié)果表明獲得的可辨別的蛋白點(diǎn)也很多，可以滿足一般的實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

(3) 圖像分析。圖像分析是2-DE中十分重要的一步，其作用是評價(jià)和量化電泳結(jié)果。只有較為精確地對蛋白點(diǎn)進(jìn)行識別、對比、定量,才可能有效地分析各組凝膠上的蛋白數(shù)據(jù),從而得到有意義的生物學(xué)信息[12]。為了使學(xué)生更好地掌握分析軟件的使用，通常以Bio Rad廠家提供的2-DE圖譜作為范例講解，包括圖像優(yōu)化、點(diǎn)檢測、點(diǎn)匹配、手動校正、結(jié)果報(bào)告等，然后由學(xué)生對自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果做出分析。通常選取對照組和實(shí)驗(yàn)組中蛋白點(diǎn)最清晰、橫豎紋及拖尾相對少的圖譜進(jìn)行分析和比較。

5 結(jié) 語

本文建立了一種適于本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)的雙向電泳技術(shù)體系，優(yōu)點(diǎn)如下：① 蛋白樣品取材方便。本實(shí)驗(yàn)選取的材料是大腸桿菌，很容易獲得且生長速度快，易于根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臄U(kuò)大培養(yǎng)。② 制備方法簡單有效。在雙向電泳技術(shù)中,樣品制備是整個分離過程中的關(guān)鍵一步,對實(shí)驗(yàn)結(jié)果將起到?jīng)Q定性作用，如果樣品制備過程出現(xiàn)問題將直接影響2-DE的結(jié)果與分析[13-16]。對于不同的實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)室條件以及實(shí)驗(yàn)?zāi)康模捎貌煌臉悠诽幚矸椒?。本?shí)驗(yàn)的研究對象是大腸桿菌中的全部水溶性蛋白，菌體超聲破碎離心后，上清直接用丙酮沉淀，實(shí)驗(yàn)方法簡單，蛋白丟失相對較少。③ 可獲得穩(wěn)定性較高、分辨率和重復(fù)性較好的2-DE圖譜。雙向電泳實(shí)驗(yàn)中很多因素都可能影響到最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)一方面對學(xué)生的動手操作提出了很高的要求，另一方面需要學(xué)生綜合運(yùn)用所學(xué)知識來分析解釋復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，有助于提高學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技能和綜合素質(zhì)。④ 利用簡單的熱休克處理手段，加深學(xué)生理解雙向電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用。

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Establishment of a Convenient Two-Dimensional Electrophoresis Technique in Undergraduate Experimental Teaching

ZHAOYu-honga,LIXina,CUIJian-linb,ZHOUHaoa,LIDeng-wena,LIXiao-jua,ZHANGJin-honga，ZHAOLi-qinga

(a. Biological Experimental Center; b. College of Medicine， Nankai University， Tianjin 300071， China)

Two-dimensional electrophoresis (2-DE) is an important technology in proteomics research. The experiment of the effect of heat shock treatment on the expression profile of bacterial protein was designed to provide undergraduate an experiment for 2-DE technique. The soluble proteins from Escherichia coli was studied by 2-DE. The higher stability and resolution repeatability 2-DE maps were obtained. Through this experiment, students can master the basic principle, experiment method of 2-DE and the general idea of protein extraction.

two-dimensional electrophoresis； experimental teaching； heat shock； expression profile of bacterial protein

2016-01-28

國家基礎(chǔ)學(xué)科人才培養(yǎng)基金“條件建設(shè)項(xiàng)目”(J1310003)；南開大學(xué)2014年教學(xué)改革項(xiàng)目

趙玉紅(1981-)，女，山東青島人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，從事生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作。

Tel.：13920242524; E-mail:zyh@mail.nankai.edu.cn

趙立青(1962-)，女，云南洱源人，博士，教授，從事蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究以及基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的工程應(yīng)用。

E-mail：lqzhao@nankai.edu.cn

G 642.0； Q 503

A

1006-7167(2017)01-0177-03