張澤雄 劉紅艷 邢賀 馬鈺

（桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，桂林 541004）

漆酶可降解底物種類的研究進(jìn)展

張澤雄 劉紅艷 邢賀 馬鈺

（桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，桂林 541004）

漆酶是一種含銅離子的多酚氧化酶，廣泛存在于植物及真菌中。漆酶含特有的銅離子，其功能為傳遞結(jié)構(gòu)中的電子，使漆酶具有了較強(qiáng)的氧化還原能力，能與木質(zhì)素、胺類化合物、芳香化合物等底物發(fā)生作用，且大多數(shù)反應(yīng)的唯一產(chǎn)物為水。目前，漆酶在降解多種有毒物質(zhì)和有害污染物方面表現(xiàn)出高效、成本較低的特性，如白腐真菌所產(chǎn)的高水平漆酶已廣泛成熟應(yīng)用在工業(yè)廢水處理等生物整治和修復(fù)領(lǐng)域。近年來最新研究利用載體固定化酶的技術(shù)使漆酶能夠在使用后回收反復(fù)利用且更具有穩(wěn)定性，這降低成本的同時還保持了漆酶催化氧化的特性，克服了不少漆酶在解決環(huán)境污染中出現(xiàn)的問題。利用介體的介導(dǎo)作用解決了漆酶氧化還原電勢較低的問題，大量增多了可降解底物的種類，使其在廢水處理、污染物降解、土壤修復(fù)、工業(yè)染料漂白等領(lǐng)域的應(yīng)用前景更廣闊。對現(xiàn)有漆酶應(yīng)用于各領(lǐng)域進(jìn)行研究總結(jié)，綜述了降解各領(lǐng)域中的有害污染物等底物種類，提出了利用漆酶的降解過程中的現(xiàn)有不足和改進(jìn)方向，以期為生物法降解環(huán)境污染物的研究提供參考。

漆酶；底物；環(huán)境污染物

1 漆酶的簡介

1.1 漆酶的來源

漆酶最早發(fā)現(xiàn)于漆樹，漆樹漆酶也是目前在植物源中獲取活性最高的漆酶，除此以外，在其他植物中也能提取出漆酶［6］。在昆蟲等動物中也發(fā)現(xiàn)了漆酶，但是這類漆酶可能為僅具有類似漆酶催化功能的多酚氧化酶［7］。微生物漆酶的研究主要以真菌漆酶為主，目前產(chǎn)漆酶的真菌已超過上千種，其中擔(dān)子菌（Basidiomycetes）和子囊菌（Ascomycetes）就 有近百 種［8］。在 1993年，Givaudanet等［9］首先報道了從根際細(xì)菌生脂固氮螺菌（Azospirillum lipoferun）中發(fā)現(xiàn)了漆酶，對比真菌漆酶，細(xì)菌漆酶的分子組成較為單一，沒有糖基化的修飾，目前對細(xì)菌漆酶的研究和應(yīng)用較少。漆酶同工酶［10］作為漆酶的另一種補(bǔ)充來源，成為研究的又一熱點(diǎn)，目前已經(jīng)提出了白漆酶和黃漆酶兩種同工酶［11］。

1.2 漆酶的結(jié)構(gòu)及催化機(jī)理

漆酶是一種糖蛋白，大多數(shù)為單體酶，單體的相對分子質(zhì)量達(dá)5×104-5×105，該糖蛋白由銅離子、肽鏈和糖配基3部分組成。漆酶分子結(jié)構(gòu)中一般含有4個銅離子3個結(jié)合位點(diǎn)，銅離子是構(gòu)成漆酶活性中心的關(guān)鍵，在催化底物反應(yīng)中起著電子轉(zhuǎn)移的作用［12］，根據(jù)磁學(xué)與光譜學(xué)性質(zhì)可分為3類：一個Ⅰ型 Cu2+（T1Cu）和一個Ⅱ型 Cu2+（T2Cu），這兩種為單電子受體，呈順磁性；兩個Ⅲ型Cu2+（T3Cu），為耦合離子對，雙電子受體，呈反磁性［13］。糖配基含有氨基己糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等，糖配基中的這幾種成分含量的不同造成了漆酶分子量的巨大差異。共價連接的碳水化合物部分的含量占10%-40%，是提高酶穩(wěn)定性的原因［14］。

漆酶的催化機(jī)理較復(fù)雜，其作用于不同底物時的反應(yīng)機(jī)理不全相同，但可以總結(jié)歸納出一點(diǎn)：漆酶通過電子轉(zhuǎn)移氧化底物，使底物生成不穩(wěn)定的中間體后再反應(yīng)，且在催化大多數(shù)富含電子底物的單電子氧化過程中可同時將氧分子還原成水［15］。

2 漆酶降解底物的種類

漆酶作為一種氧化酶，具有特殊的催化性能，可氧化木質(zhì)素、酚類化合物、非酚類化合物等底物，且隨著漆酶的氧化還原電勢越高，可降解的底物范圍越廣［16］，應(yīng)用領(lǐng)域也就越大。利用介體以及將漆酶固定到載體上使用是目前研究熱點(diǎn)，保持其活性和專一性的同時還克服了游離漆酶的不足，使固定化后的酶穩(wěn)定性好，還可分離回收利用，操作可控。

2.1 木質(zhì)素

木質(zhì)素是由醇單體及其衍生物結(jié)構(gòu)單元形成的芳香性高聚物。韓美玲等［17］發(fā)現(xiàn)在白腐真菌產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基中加入棉籽殼作為木質(zhì)纖維素誘導(dǎo)物后，有效地提高了其分泌的漆酶活性。但同時木質(zhì)素結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜并難以降解，是現(xiàn)在生物工業(yè)上一大挑戰(zhàn)。目前漆酶在木質(zhì)素降解中起重要作用，早期有研究表明漆酶能夠直接催化使低分子量的木質(zhì)素模型中的化合鍵斷裂［18］，但也有研究認(rèn)為漆酶需要介體系統(tǒng)才能催化木質(zhì)素底物中鍵的斷裂［16］，近年Majumdar等［19］發(fā)現(xiàn)漆酶能夠在沒有介質(zhì)的情況下降解酚類木質(zhì)素模型化合物，但是對非酚類的木質(zhì)素則必須利用介質(zhì)才能降解。黃麻纖維是加工麻袋等產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)原料，但其中高達(dá)16%的木質(zhì)素導(dǎo)致黃麻纖維粗硬，可紡性差，經(jīng)漆酶-介體體系處理后，得到的黃麻纖維木質(zhì)素分子量和羥基含量比只用漆酶直接降解的更低［20］。

2.2 染料

紡織、紙張、皮革等工業(yè)合成染料種類繁多，這類廢水會影響水生生物及微生物的生長，還會危害人類健康。染料按結(jié)構(gòu)大致可分為4類：偶氮染料、靛藍(lán)染料、蒽醌染料和三苯甲烷類染料，這些染料都具有較大的生物毒性，大多還是“三致”物質(zhì)。

偶氮染料是目前各染料領(lǐng)域使用最廣泛的染料，由偶氮基連接芳基而成。李飛等［21］誘導(dǎo)杏鮑菇漆酶降解龍膽紫與酸性鉻蘭K的脫色率達(dá)63.8%與76.9%。而對弱酸性偶氮染料的降解效果更明顯，其中酸性黑231與酸性黑210的降解效率分別高達(dá)96.4% 和 92.2%［22］。司靜等［23］以微酸多年臥孔菌所產(chǎn)的漆酶對多種染料進(jìn)行脫色時，偶氮染料剛果紅的脫色率達(dá)91.57%，且發(fā)現(xiàn)是否加入2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽［2，2’-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS］對脫色效果無明顯差異。在利用固定化技術(shù)方面，以海藻酸鈉為載體，交聯(lián)劑使用戊二醇降解偶氮染料，由于戊二醇同時也是酶的變性劑，使酶在固定化過程中損失活力而降低固定化率，而海藻酸鈉有著較大的孔狀結(jié)構(gòu)，易漏出大分子酶，故用以包埋結(jié)合交聯(lián)的方式固定化酶能取得更好的效果［24］。經(jīng)過固定化后測得對剛果紅的脫色率還能維持在50%左右，這也使固定化酶在印染處理領(lǐng)域仍然有良好的應(yīng)用前景。

靛藍(lán)染料是牛仔褲的主要染料，其以碳碳雙鍵帶羰基的雜環(huán)共軛體系為母體，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，而漆酶氧化還原電勢較低，因此需借助電子傳遞介質(zhì)分解靛藍(lán)［25］，以 1-羥基苯并三唑（1-Hydroxybenzotriazole，HBT）為誘導(dǎo)劑，漆酶降解靛藍(lán)染料的脫色率達(dá)96.5%。高恩麗等［26］發(fā)現(xiàn)在生物治理過程中，漆酶會與酸性纖維素酶產(chǎn)生協(xié)同作用，使廢水中靛藍(lán)濃度降低83.8%。

蒽醌染料含有兩個以上的羰基，由蒽醌和稠環(huán)酮結(jié)構(gòu)組成，漆酶需利用介體物質(zhì)介導(dǎo)對其氧化完全脫色［27］，實(shí)質(zhì)上也是酶與底物的間接氧化。任大軍等［28］以漆酶結(jié)合ABTS的介體系統(tǒng)，該系統(tǒng)對蒽的降解率達(dá)到90%以上。有研究認(rèn)為漆酶能對個別蒽醌染料直接降解，馬利［29］發(fā)現(xiàn)在不加介體條件下漆酶對活性藍(lán)4與雷瑪唑亮藍(lán)仍能達(dá)到不錯的脫色效果。

三苯甲烷染料分子是由中心碳原子連接著3個芳環(huán)，其使用量在染料中僅次于偶氮類染料。司靜等［30］對栓孔菌屬篩選出了漆酶的高產(chǎn)菌株東方栓孔菌（Trametes orientails），并利用其發(fā)酵所得的粗酶液對三苯甲烷類結(jié)晶紫進(jìn)行脫色，效果明顯且脫色率高達(dá)90.36%［31］。漆酶對常用的三苯甲烷類染料溴酚藍(lán)溶液的脫色率也能達(dá)到94.5%［32］，其他三苯甲烷類染料如酸性品紅、副品紅、甲基綠等都具有毒性，但都已被證明可由云芝菌所產(chǎn)的漆酶降解［33］。還有報道測試了芽孢桿菌菌株所產(chǎn)的漆酶能脫色三苯甲烷類的染料［34］，他們發(fā)現(xiàn)相比真菌漆酶，這種細(xì)菌漆酶更耐高溫且有穩(wěn)定的pH［35］。

2.3 氯酚類化合物

氯酚類化合物具有較高的毒性，且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定不易被分解，在自然環(huán)境下降解的非常緩慢。漆酶降解氯酚類污染物的研究在國內(nèi)外都取得了不錯的效果，利用蜜環(huán)菌發(fā)酵的漆酶粗酶液就可以直接催化降解2，4-二氯酚和2-氯酚［36］，反應(yīng)10 h后降解率最高分別可達(dá)97%和93%。Gaitan 等［37］在漆酶粗酶液中分離出兩種分子量分別為60和120 kD的漆酶同工酶，對含有多種氯酚的混合物進(jìn)行降解8 h后發(fā)現(xiàn)，其中五氯酚降解率僅有40%，而其余氯酚則幾乎完全降解。固定化酶的技術(shù)在降解氯酚類取得豐富的進(jìn)展：賀芙蓉等［38］利用磁性二氧化硅表面接枝的聚丙烯酰胺絡(luò)合Cu2+離子，制備表面銅螯合磁性SiO2材料，這種金屬螯合配體與蛋白質(zhì)表面供電子氨基酸間的相互作用固定化漆酶，有效降解了2，4-二氯酚，且加入SO4-離子后可明顯促進(jìn)降解效果；李永濤等［39］發(fā)現(xiàn)堆肥固定化漆酶降解土壤中五氯酚的效果優(yōu)于殼聚糖固定化漆酶，原因在于堆肥能提高土壤中微生物的數(shù)量與活性而提高了漆酶酶活；電化學(xué)降解法通過有催化活性的電極反應(yīng)產(chǎn)生OH-從而降解大多數(shù)有機(jī)污染物，李麗芳等［40］利用電化學(xué)-固定化漆酶聯(lián)合工藝催化降解水中的五氯酚，這種電化學(xué)的聯(lián)合工藝相比單獨(dú)固定化漆酶對五氯酚的降解率提高了38.5%。

2.4 多環(huán)芳烴類

多環(huán)芳香烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs），是由兩個以上的苯環(huán)稠合而成的持久性有機(jī)污染物，煤、石油、天然氣等燃料的大量燃燒及石油的泄露導(dǎo)致環(huán)境中多環(huán)芳烴的劇增對人類的健康造成威脅。

早在1993年，Davis等［41］研究發(fā)現(xiàn)了所有的真菌都具有先天降解多環(huán)芳烴的能力。Majcherczyk等［42］以云芝菌所產(chǎn)漆酶對14種多環(huán)芳烴降解進(jìn)行測試發(fā)現(xiàn)，其中包括苊、熒蒽、芘及苯并［a］蒽等的降解率僅約10%，但在加入HBT后明顯提高了漆酶對這些多環(huán)芳烴的降解效率，芘、苯并［a］蒽的降解效率達(dá)50%，苊、苊烯、芴、蒽等幾乎完全被降解。一種基于戊二醛和氨基修飾的SBA-15載體共價固定方法已成功應(yīng)用于固定漆酶［43］，并有效降解萘、菲、蒽且活性接近于未固定化的自由漆酶，表明介孔載體的引入不會對催化過程造成明顯的抑制。

國內(nèi)學(xué)者近年來也研究了漆酶降解多環(huán)芳烴，李烜楨等［44］考察了兩種食用菌平菇（Pleurotus ostreatus）和雞腿菇（Coprinus comaus）所產(chǎn)的漆酶對15中多環(huán)芳烴的降解能力，結(jié)果表明培養(yǎng)平菇食用菌所得的粗酶液對多環(huán)芳烴的降解效果優(yōu)于雞腿菇，原因推測可能由于平菇分泌了更多的調(diào)節(jié)物質(zhì)而提高了降解率。非離子表面活性劑改性黏土是一種除去土壤中有機(jī)化合物的高效吸附材料，通過利用非離子表面活性劑改性黏土固定真菌漆酶后，能更有效地降解多環(huán)芳烴［45］。

2.5 內(nèi)分泌干擾物

內(nèi)分泌干擾物也稱環(huán)境激素，其中多種有機(jī)污染物如烷基酚、雙酚A、鄰苯二甲酸鹽、多氯聯(lián)苯等并不是直接使生物體中毒，而是類似激素影響人和動物體內(nèi)正常的激素功能，造成內(nèi)分泌失衡，嚴(yán)重的威脅人類和野生動物的物種繁衍和長期生存。

酞酸酯類作為一種人工合成的塑料增塑劑，也是現(xiàn)在難降解的有機(jī)污染物的一種。烷基酚是一類由酚烷基化后產(chǎn)生的化合物，壬基酚和辛基酚是其中典型的有害物質(zhì)，這類長鏈烷基酚廣泛應(yīng)用于活性劑、洗滌劑中，也是現(xiàn)工業(yè)原料和中間體。近年來，國內(nèi)外不斷有人研究生物技術(shù)降解酞酸酯類污染物。Macellaro等［46］研究漆酶對雙酚A、壬基酚、對烴基苯甲酸甲酯、對烴基苯甲酸丁酯及鄰苯二甲酸二甲酯的降解中發(fā)現(xiàn)，只有雙酚A可以不利用介質(zhì)直接被漆酶降解，而對其他4種直接降解幾乎無效。Catapane等［47］研究漆酶的固定化發(fā)現(xiàn)，壬基酚比辛基酚在固定化方面有更高的親和力，但對同濃度的兩種底物降解時，完全除去辛基酚的時間明顯快于除去壬基酚。李飛等［48］以海藻酸鈉為載體，用雙孢菇漆酶凝膠包埋固定化的工藝對鄰苯二甲酸二甲酯的降解率達(dá)40%。還發(fā)現(xiàn)在酶用量超過1 g后，增大酶的用量反而影響降解效果，推測是酶用量的增大導(dǎo)致體系變得擁擠，使凝膠小球無法充分與底物結(jié)合。

雙酚A是現(xiàn)在普遍使用的化工原料，廣泛用于塑料、橡膠和涂料等，過去在嬰兒奶瓶中檢測到雙酚A引起了高度重視。生物降解法是一種有效安全降解雙酚A的方法，國內(nèi)外很早就對漆酶降解雙酚A有了成熟的研究。Catherine等［49］發(fā)現(xiàn)漆酶降解雙酚A后的產(chǎn)物大多數(shù)都是2-6個重復(fù)單元無毒的低聚物。目前通過各種固定化的方法固定漆酶降解雙酚A的研究也取得了成功，這些固定化的原理都是通過物理或化學(xué)的方法處理酶使之不溶于水且能反復(fù)連續(xù)使用仍具有活性。例如，將TiO2納米粒子通過低溫溶膠-凝膠過程涂布在膜表面，然后通過化學(xué)偶合將漆酶固定在膜上［50］；采用乳液靜電紡絲技術(shù)原位固定酶，使載酶電紡纖維呈殼-核結(jié)構(gòu)保護(hù)漆酶［51］；利用氧化石墨烯巨大的比表面積，以磁性石墨烯為載體固定化漆酶［52］等。

多氯聯(lián)苯屬于致癌物，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，難以在自然界中分解。Keum［53］取白腐真菌云芝栓孔菌和平菇產(chǎn)漆酶對烴基多氯聯(lián)苯進(jìn)行降解測試，發(fā)現(xiàn)這兩種白腐菌漆酶具有降解烴基多氯聯(lián)苯的能力，且云芝栓孔菌漆酶降解速度快于平菇漆酶。高國瑞［54］試驗(yàn)青霉菌降解多氯聯(lián)苯，在降解過程中發(fā)現(xiàn)，一定范圍內(nèi)漆酶活性與降解率趨勢相同，說明在青霉菌降解多氯聯(lián)苯中漆酶起了重要作用。

3 展望

微生物法廉價、安全、不會造成二次污染，利用微生物法降解環(huán)境有害污染物是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。而漆酶底物種類的繁多更使人們聚焦于此，早期漆酶作用的底物就多達(dá)250余種，但也存在許多尚未解決的問題，如漆酶的穩(wěn)定性不足、氧化還原電勢低等，真正成熟應(yīng)用降解的底物屈指可數(shù)。得益于對介體的探究，讓我們對漆酶應(yīng)用于底物的機(jī)理有了全新的認(rèn)識，加入介體和固定化酶的方法使漆酶降解能力大大提升，擴(kuò)大了底物范圍。但許多研究發(fā)現(xiàn)固定化后漆酶的活性難以保持游離漆酶的酶活，如何保證擴(kuò)大底物的作用范圍同時還能保持酶的活性是現(xiàn)需要解決的一重大問題。此外，漆酶的來源廣泛，但現(xiàn)研究應(yīng)用都集中于真菌漆酶，來源不同其結(jié)構(gòu)功能也會有所差異，是否能在其他來源上得到成熟以及更廣泛的應(yīng)用也是值得深入研究的方向。漆酶在生物降解污染物中的潛力很大，若能解決上述問題將會有更廣闊的應(yīng)用前景。

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Research Progress on Substrate Species Degraded by Laccase

ZHANG Ze-xiong LIU Hong-yan XING He MA Yu
（College of Chemistry and Bioengineering，Guilin University of Technology，Guilin 541004）

Laccase，a polyphenol oxidase that binds multiple copper ions，is widely found in plants and fungi. Laccase contains unique copper ions which function is to transfer electrons in the structure，so that the laccase has a strong redox capacity，and the only product of the most reactions with lignin，amine compounds，aromatic compounds such as the role of the substrate is water. It has the characteristics of high efficiency and low cost in the degradation of many toxic substances and harmful pollutants，such as white rot fungi produced by the high level of laccase has been widely used in industrial wastewater treatment and other biological remediation and repair areas. In recent years，the lastest research showed that the using of vector immobilized enzyme technology allows laccase to be recycled after use and reused and more stable，which reduces costs while maintains the characteristics of laccase catalytic oxidation，it has overcome the problems of laccases in solving environmental pollution，Under the mediating effect of mediator，the problem of low potential of laccase redox has been figured out，and it greatly increased more kinds of substrate. Therefore，the application prospects in wastewater，degradation，soil remediation，industrial bleaching and other fields will be much broader. This paper summarily describes the applications of laccase in various fields and the types of harmful pollutions substrates，put forward the deficiency and the improving direction of existing degradation process of laccase aiming at providing the reference for the study of biodegradation of environmental pollutants.

laccase；substrate；environmental pollutant

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0417

早在1883年，日本科學(xué)家田彥六郎［1］發(fā)現(xiàn)紫膠漆樹樹液中的酶能使“樹漆”氧化而變的堅(jiān)固，直到1894年法國人Bertrand［2］詳細(xì)地研究了東南亞漆樹中的酶，并命名為漆酶（Laccases）。漆酶（EC1.10.3.2）是一種結(jié)合多個銅原子的藍(lán)色多酚氧化酶，分布于植物、微生物、高等真菌和少數(shù)細(xì)菌中，與哺乳動物血漿銅藍(lán)蛋白及植物抗壞血酸銅藍(lán)蛋白一樣，都屬于銅藍(lán)蛋白家族［3］。漆酶可穩(wěn)定存在于空氣中，且許多反應(yīng)的唯一產(chǎn)物為水，因而被歸為環(huán)保型酵素。擔(dān)子菌門的白腐真菌生產(chǎn)的漆酶效果最好［4］，此類高水平的漆酶也成為了研究重點(diǎn)，且固定化后使漆酶更穩(wěn)定地反復(fù)使用，利用小分子介體更是提高了漆酶反應(yīng)效率，還大量增加了可降解底物的種類［5］。近年來隨著環(huán)境污染問題愈發(fā)嚴(yán)重，國內(nèi)外對漆酶降解污染物的研究也愈加重視，本文就近年來對漆酶降解污染物底物的研究現(xiàn)狀作一綜述，以期通過生物法更高效地降解環(huán)境污染物。

2017-05-22

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21467006）

張澤雄，男，碩士研究生，研究方向：環(huán)境微生物化學(xué)；E-mail：2542979281@qq.com

劉紅艷，女，副教授，研究方向：生物化學(xué)與環(huán)境污染物化學(xué)；E-mail：lhyglite@126.com

（責(zé)任編輯 狄艷紅）