魏儒平 閆誠 楊欣妍 何曉云 王鑫 楊柳燕

（1. 南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院 南京大學(xué)污染控制與資源化研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210046；2. 浙江省環(huán)境監(jiān)測中心，杭州 310012）

特約綜述

強(qiáng)化生物除磷系統(tǒng)的功能微生物研究進(jìn)展

魏儒平1閆誠1楊欣妍1何曉云2王鑫1楊柳燕1

（1. 南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院 南京大學(xué)污染控制與資源化研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210046；2. 浙江省環(huán)境監(jiān)測中心，杭州 310012）

人類活動過程中排放的磷是導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化的重要原因之一，因此，采取強(qiáng)化生物除磷（Enhanced biological phosphorus removal，EBPR）技術(shù)去除污水中磷，減輕對環(huán)境不利影響。由于具有經(jīng)濟(jì)、可持續(xù)的優(yōu)點(diǎn)，EBPR系統(tǒng)在污水除磷中得到廣泛應(yīng)用，而體系中微生物群落組成合理、功能完整是EBPR系統(tǒng)高效穩(wěn)定運(yùn)行的關(guān)鍵所在。為了深入了解EBPR系統(tǒng)除磷機(jī)理和實(shí)現(xiàn)高效穩(wěn)定運(yùn)行，對系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)和主要功能微生物進(jìn)行了大量研究。EBPR系統(tǒng)中除了具有聚磷能力的聚磷菌（Polyphosphate-accumulating organisms，PAOs）外，還包括沒有聚磷能力的非聚磷菌（non-PAOs），主要為聚糖菌（Glycogen-accumulating organisms，GAOs）和一些輔助細(xì)菌等。目前，發(fā)現(xiàn)與聚磷相關(guān)的功能微生物種類越來越多，研究最多的PAOs和GAOs分別為Accumulibacter和Defluviicoccus。PAOs和GAOs在不同的環(huán)境條件下存在競爭或合作關(guān)系，但是PAOs在特定條件下是否能夠表現(xiàn)出GAOs的代謝特性這一問題還存在爭論。除傳統(tǒng)碳源、pH和溫度等因素影響生物除磷外，外源污染物（如抗生素和重金屬）對EBPR系統(tǒng)中功能微生物也產(chǎn)生影響。為了獲得高效PAOs，傳統(tǒng)分離方法、藍(lán)白斑篩選法和人工構(gòu)建工程菌的方法先后得到應(yīng)用。現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為EBPR系統(tǒng)中功能微生物研究提供了先進(jìn)可靠的技術(shù)手段，通過高效聚磷菌的構(gòu)建實(shí)現(xiàn)高效除磷是未來提高實(shí)際污水中生物除磷效率的一個重要發(fā)展方向。

強(qiáng)化生物除磷；聚磷菌；聚糖菌；藍(lán)白斑篩選；高效聚磷工程菌

水體富營養(yǎng)化已經(jīng)是全球面臨的重大水環(huán)境問題，人類活動中氮磷等營養(yǎng)元素進(jìn)入水體是導(dǎo)致富營養(yǎng)化的主要原因，由于磷是水體藻類生長的限制因子［1］，因此，控制磷的排放比控制氮的排放更具有實(shí)際意義。強(qiáng)化生物除磷（Enhanced biological phosphorus removal，EBPR）工藝作為經(jīng)濟(jì)、可持續(xù)的除磷方法在污水處理廠中得到廣泛應(yīng)用［2］。EBPR工藝通過活性污泥處理污水過程中厭氧階段和好氧階段的交替運(yùn)行，為系統(tǒng)中某些能夠“超量吸磷”的微生物營造合適的生長條件，磷隨著好氧階段末端的排泥得到去除。

EBPR系統(tǒng)高效穩(wěn)定運(yùn)行的關(guān)鍵是體系中微生物群落組成合理、功能完整。近30年來很多研究者對該系統(tǒng)主要功能微生物進(jìn)行了大量的研究，但仍未能全面深入了解系統(tǒng)中微生物的群落結(jié)構(gòu)組成、功能和影響因素。此外，很多學(xué)者也嘗試從該體系中獲得純培養(yǎng)的功能菌株，在人工控制條件下將其重新添加到體系中，以恢復(fù)或增強(qiáng)EBPR的除磷效果。

因此，本文從微生物學(xué)的角度對EBPR系統(tǒng)進(jìn)行綜述，重點(diǎn)關(guān)注功能微生物的組成、影響因素和高效聚磷菌的獲取方法。在厘清功能微生物種群、尋找獲取高效聚磷菌新方法的基礎(chǔ)上，旨為EBPR系統(tǒng)的高效穩(wěn)定運(yùn)行提供技術(shù)參考。

1 EBPR系統(tǒng)中功能微生物及影響因素

1.1 主要功能微生物

EBPR系統(tǒng)中存在大量微生物，包括非細(xì)胞型的病毒和細(xì)胞型的古生菌、細(xì)菌、真菌和微型藻類等［3］，其中功能微生物是研究者們關(guān)注的重點(diǎn)。這類微生物除了具有聚磷能力的聚磷菌（Polyphosphateaccumulating organisms，PAOs）外，還包括沒有聚磷能力的非聚磷菌（non-PAOs），主要包括聚糖菌（Glycogen-accumulating organisms，GAOs）和一些輔助細(xì)菌等［4］。

1.1.1 聚磷菌 聚磷菌是指具有厭氧釋磷、好氧吸磷特性的一類微生物。它們可以在厭氧條件下分解多聚磷酸鹽（Polyphosphates，poly-P），以正磷酸鹽的形式釋放到細(xì)胞外，同時利用釋放的能量合成聚羥基鏈烷酸（Polyhydroxylkanoates，PHAs）；在好氧階段，PAOs可以過量攝取水中溶解態(tài)正磷酸鹽合成多聚磷酸鹽儲存在細(xì)胞體內(nèi)，隨著剩余污泥排出污水處理系統(tǒng)，從而達(dá)到生物除磷的目的。

γ-變 形 菌 綱（γ-protebacteria） 的 不 動 桿 菌（Acinetobacter）是最早發(fā)現(xiàn)能夠去除EBPR系統(tǒng)中磷的微生物。40多年前，研究者們開始嘗試用純培養(yǎng)的方法從EBPR系統(tǒng)中分離出具有聚磷能力的單菌株。1975年，F(xiàn)uhs 等［3］首次運(yùn)用該方法獲得一株能夠聚磷的不動桿菌。在后來很長一段時間內(nèi)不動桿菌都被認(rèn)為是EBPR系統(tǒng)中唯一的PAOs，大量的研究也集中在不動桿菌上［5-7］。然而，研究發(fā)現(xiàn)不動桿菌不符合PAOs的代謝模型［8］，因此不是主要的聚磷菌。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，研究者們發(fā)現(xiàn)在污水處理廠規(guī)模運(yùn)行的EBPR系統(tǒng)中，不動桿菌的豐度要遠(yuǎn)小于β-變形菌（β-proteobacteria）和放線菌（Actinobacteria）等其他微生物［9］。Che等［10］運(yùn)用電子顯微鏡和16S rRNA基因測序等方法分析了SBR活性污泥的微生物群落，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-變形菌是最豐富的微生物，負(fù)責(zé)系統(tǒng)中磷和COD的去除。

四球蟲屬（Tetrasphaera）被認(rèn)為是EBPR系統(tǒng)中具有聚磷能力的微生物。Kristiansen等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在丹麥污水處理廠的活性污泥中，四球蟲屬豐度很高，占據(jù)重要生態(tài)位，而且四球蟲屬的微生物不僅可以聚磷，在反硝化與發(fā)酵過程中也起著重要作用。

目前公認(rèn)的聚磷能力最強(qiáng)、研究最多的PAOs是一類屬于β-變形菌綱紅環(huán)菌屬（Rho-docyclacae）的菌株［12］，Hesselmann等［13］最早將它命名為“Candidatus Accumulibacter phosphatis”，通常縮寫為“Accumulibacter”。

最新研究［14］顯示，在側(cè)流EBPR系統(tǒng)中，PAOs具有很高的豐度，微生物群落結(jié)構(gòu)分析表明，反應(yīng)器中主要存在的微生物是變形菌門（特別是β-變形菌綱和γ-變形菌綱）；對細(xì)菌進(jìn)一步分析表明，多種微生物屬于PAOs，包括Accumulibacter、四球蟲屬、紅環(huán)菌屬以及反硝化聚磷菌（Denitrifying phosphate-accumulating organisms，DPAOs）。

目前，從實(shí)驗(yàn)室到污水處理廠規(guī)模的EBPR系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的PAOs種類很多，除上述的不動桿菌、放線菌、四球蟲屬、紅環(huán)菌屬及Accumulibacter外，希瓦氏菌（Shewanella）［15］、假單胞菌（Pseudomonas）、氣單胞菌（Aeromonas）、聚磷小月菌（Microlunatus phosphovorus）、俊片菌（Lampropedia）等［16］都是PAOs，具有聚磷能力。

1.1.2 聚糖菌 GAOs的代謝機(jī)制與PAOs類似，它們可以在厭氧條件下分解糖原，同時合成聚羥基鏈烷酸（PHAs）以儲存釋放的能量；在好氧階段，GAOs消耗PHAs合成糖原。與PAOs相同，20多年前開始的關(guān)于GAOs的研究也是試圖尋找符合GAOs代謝模型的微生物。Cech等［17-18］在以葡萄糖和乙酸鹽為碳源的系統(tǒng)中觀察到大量排列成四分體的球形細(xì)胞，但是在厭氧條件下沒有正磷酸鹽釋放，他們將這種生物稱為“G細(xì)菌”。隨后有研究者根據(jù)其形態(tài)將其稱為“Tetrad-forming organisms（TFOs）”［19］。GAOs這一術(shù)語是 Mino 等［20］提出，該定義是基于其好氧階段合成糖原的代謝特性而不是其形態(tài)類型。目前，研究者們關(guān)注最多的GAOs是“Candidatus Competibacter phosphatis”，通常簡稱為 Competibacter，屬于 γ-變形菌綱［21］；另一種主要GAOs的發(fā)育地位近似Defluviicoccus vanus，通常簡稱為Defluviicoccus，屬于α-變形菌綱［22］。

GAOs不能儲存多聚磷酸鹽，對于EBPR系統(tǒng)中磷酸鹽的去除沒有貢獻(xiàn)。而且，GAOs與PAOs爭奪底物，抑制PAOs生長，從而對磷酸鹽的去除產(chǎn)生負(fù)面影響［23］。Mielczarek 等［24］調(diào)查了丹麥 28 個污水處理廠規(guī)模運(yùn)行的EBPR系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除磷效率降低往往伴隨著GAOs的累積。

由于PAOs和GAOs代謝機(jī)制十分相似，有學(xué)者提出PAOs在一定條件下是否可以轉(zhuǎn)化成GAOs？早前的研究［25］表明，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Poly-P耗盡時，PAOs在厭氧條件下不能攝取乙酸。但是，也有研究得出了不同的結(jié)論。Zhou等［26］使用富含80%典型聚磷菌Accumulibacter的污泥，在厭氧和Poly-P限制條件下研究這些微生物利用乙酸的能力。他們發(fā)現(xiàn)，3個周期之后，幾乎沒有正磷酸鹽的釋放，但是PAOs仍然能夠吸收乙酸并將其儲存為PHAs，而糖原降解的顯著增加表明PAOs以糖原為主要能源，這表現(xiàn)出了GAOs的關(guān)鍵特征。

1.1.3 其他微生物 發(fā)酵細(xì)菌和水解細(xì)菌等也是EBPR系統(tǒng)中的重要微生物，它們通過發(fā)酵和水解作用將大分子有機(jī)物分解為功能微生物可直接利用的小分子，為其提供碳源和能量。這些細(xì)菌與PAOs、GAOs及相關(guān)微生物一起構(gòu)成EBPR系統(tǒng)中完整的群落結(jié)構(gòu)，保證系統(tǒng)發(fā)揮良好的除磷性能。

放線菌門和厚壁菌門（Firmicutes）是發(fā)酵細(xì)菌兩個主要門類。Jeppe 等運(yùn)用同位素標(biāo)記的RNA探針鑒定了污水處理廠規(guī)模運(yùn)行的EBPR系統(tǒng)中葡萄糖發(fā)酵細(xì)菌的種類和豐度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)四球蟲屬、丙酸桿菌（Propionicimonas）和乳球菌（Lactococcus）、鏈球菌（Streptococcus）是主要的葡萄糖發(fā)酵細(xì)菌，它們都屬于革蘭氏陽性菌［27］。在10個污水處理廠規(guī)模的EBPR系統(tǒng)中，這4種細(xì)菌平均共占總生物體積的39%，其中四球蟲屬是最豐富的葡萄糖發(fā)酵細(xì)菌，占總生物體積的33%，丙酸桿菌、鏈球菌和乳球菌分別占4%、1%和0.4%。有研究發(fā)現(xiàn)甘露糖和半乳糖可以被發(fā)酵為乙酸、丙酸、乳酸和甲酸等揮發(fā)性脂肪酸，但是何種微生物的作用尚不明確。此外，絲狀細(xì)菌、四球蟲屬和微絲菌屬（Microthrix）分別被認(rèn)為是EBPR系統(tǒng)中水解蛋白質(zhì)、多糖和脂質(zhì)的主要細(xì)菌［28］。

1.2 影響EBPR系統(tǒng)功能微生物的因素

在研究EBPR系統(tǒng)功能微生物時，聚磷菌和聚糖菌是關(guān)注的焦點(diǎn)。之前的觀點(diǎn)普遍認(rèn)為PAOs與GAOs之間存在競爭關(guān)系［29］；而最近有文獻(xiàn)報道，在以亞硝酸鹽為電子受體同時去除硝酸鹽和正磷酸鹽的過程中，PAOs與GAOs表現(xiàn)出良好的合作關(guān)系［30］。EBPR系統(tǒng)中主要功能微生物（PAOs和GAOs）的種類及其豐度受到很多因素的影響。

1.2.1 碳源 碳源是影響EBPR系統(tǒng)中功能微生物的重要因素，常見的碳源種類有葡萄糖［31］、乙酸［32］、丙酸［33］等。除了單一種類碳源外，不同比例的混合碳源也受到一些研究者的關(guān)注［34］。姜濤［35］研究表明，以乙酸鈉和丙酸鈉作為碳源時，PAOs對二者的吸收速率基本相同，而GAOs對乙酸鈉的吸收速率要遠(yuǎn)高于對丙酸鈉的吸收速率。采用葡萄糖作為碳源時，厭氧區(qū)也存在糖原的合成，導(dǎo)致PAOs繼續(xù)利用糖原進(jìn)行后續(xù)酵解，從而降低EBPR系統(tǒng)的穩(wěn)定性。張?zhí)m河等［36］在連續(xù)流的A2/O反應(yīng)器中考察不同碳源對PAOs和GAOs種類和豐度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用葡萄糖作為碳源時，GAOs富集最多，PAOs數(shù)量較少，說明葡萄糖不利于PAOs生長。采用乙酸和丙酸作為碳源時，分別獲得最多的PAOs和最少的GAOs，聚磷菌更容易成為優(yōu)勢種。

1.2.2 pH EBPR系統(tǒng)的性能受到外部pH的強(qiáng)烈影響，這是因?yàn)椴煌乃釅A條件下微生物的群落結(jié)構(gòu)及相關(guān)功能微生物的活性存在很大差異。Zhang等［37］對于EBPR相關(guān)的特定酶活性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在pH 6.4-7.6的范圍內(nèi)，較高的pH值有利于PAOs的生長和提高其活性，從而提高除磷性能。Ahn等［38］研究了實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的EBPR系統(tǒng)中，在穩(wěn)定條件下不同pH值對微生物群落組成的長期影響。他們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值從7.5降到7.0，再降到6.5的過程中，PAOs:GAOs平衡發(fā)生變化，PAOs在代謝過程中表現(xiàn)的越來越像GAOs。他們進(jìn)而認(rèn)為，EBPA性能的降低不一定是系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，而是由于原來功能微生物代謝方式的轉(zhuǎn)變。Fukushima等［39］在3個實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的反應(yīng)器中研究了pH降低對PAOs和GAOs的影響，結(jié)果表明pH降低對Accumulibacter數(shù)量下降具有即時或延遲的影響。同時，Accumulibacter數(shù)量下降與EBPR系統(tǒng)性能開始下降之間也存在時間延遲，這意味著pH降低導(dǎo)致EBPR系統(tǒng)性能降低的原理還需要進(jìn)一步探索。

1.2.3 溫度 原水和外部環(huán)境的溫度是影響EBPR系統(tǒng)微生物群落和功能微生物代謝特征的又一重要因素。微生物的活性、生化反應(yīng)的速率都受到溫度的影響，之前普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為較低的溫度可能使功能微生物活性降低，代謝速率減慢，導(dǎo)致EBPR系統(tǒng)的除磷效率下降。Erdal等［40］在實(shí)驗(yàn)室對5℃條件下失效的EBPR系統(tǒng)進(jìn)行了深入的酶學(xué)研究，結(jié)果表明系統(tǒng)除磷性能的下降可能不是GAOs增殖的結(jié)果，而是PAOs的代謝途徑存在向GAOs等non-PAOs轉(zhuǎn)換的可能，導(dǎo)致PAOs體內(nèi)儲存更多的糖原而不是poly-P。關(guān)于溫度對影響EBPR系統(tǒng)中微生物的機(jī)理還沒有完全明確，有待進(jìn)一步研究。

1.2.4 外源污染物 近幾年來，外源污染物對EBPR系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)尤其是功能微生物的影響越來越受到研究者們的關(guān)注。Hu等［41］評估了紅霉素（ERY）和土霉素（OTC）在短期（24 h）內(nèi)對EBPR系統(tǒng)的影響，分別考察了個體效應(yīng)和組合效應(yīng)。結(jié)果表明，10 mg/L 的ERY和OTC可以抑制功能微生物的活性，但24 h內(nèi)不會引起嚴(yán)重的功能微生物死亡；由于OTC對革蘭氏陰性細(xì)菌具有特殊的抗性，而PAOs大多屬于這類細(xì)菌，所以O(shè)TC比ERY對于EBPR系統(tǒng)具有更強(qiáng)烈的負(fù)面影響。該團(tuán)隊(duì)還采用高通量測序方法研究了ZnO納米顆粒（NPs）對EBPR系統(tǒng)中微生物群落的影響，結(jié)果表明，在高濃度（高于6 mg/L）的ZnO NPs條件下，EBPR體系的物種豐富度降低。暴露于2 mg/L ZnO NPs之中，Competibacter 比 Accumulibacter更容易受其影響。將EBPR系統(tǒng)恢復(fù)20 d后，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)器中微生物群落轉(zhuǎn)變是不可逆的［42］。Sun 等［43］研究了 Ni（II）在0.1-10 mg/L范圍內(nèi)對EBPR的短期和長期影響，微生物群落調(diào)查顯示，長期接觸Ni（II）后，α-變形菌綱的GAOs代替PAOs成為EBPR系統(tǒng)中主要的微生物。

2 高效聚磷菌獲取

2.1 高效聚磷菌的篩選和分離

從污水處理廠EBPR系統(tǒng)的活性污泥中篩選和分離出具有聚磷功能的微生物是目前應(yīng)用最廣泛的獲得高效聚磷菌的方法。

2.1.1 傳統(tǒng)分離方法 傳統(tǒng)篩選和分離高效聚磷菌方法：利用不同培養(yǎng)基將微生物從污泥或污水等環(huán)境樣品中分離純化，在缺磷培養(yǎng)基中饑餓放磷之后投加到富磷培養(yǎng)基中計算除磷效率，從而篩選出高效PAOs。周明璟等［44］通過厭氧/好氧交替的平板篩選方法得到15株除磷率高于60%的高效PAOs，包括13株γ-變形菌綱菌株和2株芽孢桿菌；投加菌株后可將活性污泥的除磷率由原來的52%提高到73.3%。莊志剛等［45］以排污口污泥為原始材料，采用傳統(tǒng)微生物篩選方法，分離得到一株高效PAOs，通過分子生物學(xué)鑒定為產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes）；該菌株可以耐受濃度45 g/mL 以內(nèi)的磷。朱衛(wèi)強(qiáng)等［46］利用同樣的方法從污水處理廠的活性污泥中獲得兩株假單胞菌屬的DPAOs，它們在經(jīng)過馴化后能有效去除高鹽度廢水中的氮磷。

自然條件下，環(huán)境樣品中PAOs通常不是優(yōu)勢種，為了提高篩菌的效率，有研究者采用先富集后分離的方法獲得高效聚磷菌。李慧等［47］先用SBR反應(yīng)器對活性污泥進(jìn)行富集馴化，之后從中篩選得到3株高效PAOs，通過分子生物學(xué)鑒定為氣單胞菌屬（Aeromonas）。劉彩云等［48］以污水處理廠成熟的活性污泥為菌種來源，在富集培養(yǎng)基中循環(huán)7個周期之后，結(jié)合經(jīng)典微生物篩選方法，獲得一株脫氮除磷效率超過90%的假單胞菌。

2.1.2 藍(lán)白斑篩選 2003年，Morohoshi等［49］發(fā)現(xiàn)phoU基因突變可導(dǎo)致大腸桿菌中多聚磷酸鹽的積累，在N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍（NTG）誘變后，在含有5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸酯（X-P-i）的瓊脂平板上，phoU突變體可以很容易地被篩選出來，由此開發(fā)了“藍(lán)白斑”篩選法。他們運(yùn)用這種方法獲得兩株高效PAOs，惡臭假單胞菌MY11和不動桿菌K3，在磷含量9 mg/L的合成培養(yǎng)基中除磷效率接近90%。

隨后，在高效PAOs的篩選中藍(lán)白斑篩選法得到越來越多的應(yīng)用。蔡天明等［50］采用藍(lán)白斑篩選，結(jié)合傳統(tǒng)方法，從土壤中獲得一株弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）GM1；在MOPS 培養(yǎng)基中好氧培養(yǎng)24 h 后，GM1 可將初始濃度為43.8 mg/L的磷去除69%。該團(tuán)隊(duì)采用相同的方法分離獲得另一株高效PAOs惡臭假單胞菌GM6；采用SBR工藝處理磷含量約9 mg/L的醫(yī)院廢水，加入該菌株20 d后出水磷濃度約0.3 mg/L，去除率達(dá)96.8%［51］。張丹丹等［52］采用藍(lán)白斑篩選法從污水處理廠活性污泥中分離出兩株高效PAOs，其中一株與植生拉烏爾菌（Raoultella planticola）的同源性為98%，一株與克雷伯氏桿菌（Klebsiella pneumoniae）的同源性為98%。

2.2 高效聚磷菌的構(gòu)建

除了直接通過篩選和分離得到的野生型高效PAOs外，還可以在深入了解poly-P代謝相關(guān)基因和酶的基礎(chǔ)上，使用基因工程手段人工構(gòu)建高效聚磷工程菌。近年來，越來越多的研究集中在聚磷工程菌的聚磷機(jī)制［53］。多聚磷酸鹽激酶（Polyphosphate kinase，PPK）是在PAOs聚磷過程中合成poly-P的關(guān)鍵酶，在宿主細(xì)胞中過表達(dá)PPK基因是構(gòu)建高效聚磷工程菌的途徑。

王勤等［54］克隆大腸桿菌聚磷激酶，定向轉(zhuǎn)入到受體菌株大腸桿菌BL21（DE3）中，得到可過表達(dá)PPK 的基因工程菌BL-PPK；在IPTG的誘導(dǎo)下，BL-PPK 菌能大量合成poly-P，其細(xì)胞內(nèi)含量比對照菌高20倍，培養(yǎng)液中磷酸鹽濃度約為對照菌培養(yǎng)液中磷酸鹽濃度的1/9。杜宏偉等［55］將攜帶大腸桿菌PPK基因的重組質(zhì)粒pUTmini-Tn5-PPK整合進(jìn)入惡臭假單胞菌KT2440中，獲得基因工程菌KT2440-PPK，人工模擬污水實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，KT2440-PPK可以去除該模擬污水中90%以上的磷酸鹽。

3 結(jié)語

綜上所述，對EBPR系統(tǒng)中的微生物學(xué)研究已經(jīng)取得一定的進(jìn)展，研究發(fā)現(xiàn)的PAOs和GAOs以及其他輔助細(xì)菌的種類越來越多。除傳統(tǒng)碳源、pH、溫度等因素外，外源污染物（如抗生素和重金屬）對于EBPR系統(tǒng)中微生物組成的影響逐漸受到關(guān)注。為了獲得高效PAOs，傳統(tǒng)分離方法、藍(lán)白斑篩選法、人工構(gòu)建工程菌的方法先后得到應(yīng)用。但是，PAOs在特定條件下是否能夠表現(xiàn)出GAOs的代謝特性這一問題還存在爭論?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展將為EBPR系統(tǒng)中功能微生物的研究提供先進(jìn)可靠的技術(shù)手段［56-57］。筆者認(rèn)為，未來的研究將圍繞以下幾個方面展開。

3.1 深入研究代謝機(jī)理

了解EBPR系統(tǒng)中主要功能微生物的代謝機(jī)理是研究EBPR系統(tǒng)中PAOs和GAOs種群數(shù)量動態(tài)變化的基礎(chǔ)。未來的研究將應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、16s rRNA測序、熒光標(biāo)記原位雜交（FISH）等一系列現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，從底物吸收機(jī)制、糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)等幾個方面深入研究EBPR系統(tǒng)中微生物的代謝多樣性和特異性。進(jìn)一步研究PAOs與GAOs在不同環(huán)境條件下的代謝模型，判斷它們的競爭、合作和轉(zhuǎn)化關(guān)系，掌握系統(tǒng)中主要功能微生物的種群結(jié)構(gòu)動態(tài)變化過程。

3.2 探索獲取高效聚磷菌的新方法

傳統(tǒng)分離方法和藍(lán)白斑篩選法過程比較繁瑣、得到的功能微生物種類較少，人工構(gòu)建的工程菌效果還不夠穩(wěn)定［58］。因此，為了簡單、快速獲得高效PAOs，需要不斷改進(jìn)創(chuàng)新分離和篩選方法。例如，在探明菌株代謝和聚磷機(jī)理的基礎(chǔ)上，添加特定顯色劑、改良培養(yǎng)基配方、合理使用富營養(yǎng)培養(yǎng)基和寡營養(yǎng)培養(yǎng)基，直接根據(jù)菌落形態(tài)和顏色挑選出PAOs。同時，鑒于人工構(gòu)建的工程菌質(zhì)粒易丟失、對環(huán)境的適應(yīng)能力較差等現(xiàn)狀，為PPK基因?qū)ふ液线m的載體和宿主細(xì)菌，構(gòu)建結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、聚磷效率高的工程菌是目前重要的研究方向。

3.3 高效聚磷菌應(yīng)用于實(shí)際污水

目前，研究者普遍使用人工模擬廢水驗(yàn)證高效PAOs的除磷效果，但是將其應(yīng)用于實(shí)際污水中除磷的研究卻少見報道。實(shí)際污水化學(xué)成分和微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，基于人工模擬廢水的研究成果很難準(zhǔn)確指導(dǎo)EBPR系統(tǒng)的實(shí)際運(yùn)行。一方面，選擇在實(shí)際污水中能夠成為優(yōu)勢種群的宿主細(xì)菌；另一方面，使用實(shí)際污水驗(yàn)證高效PAOs的除磷效果?？傊?，應(yīng)用基因工程技術(shù)獲得能夠在污水中生長除磷的高效聚磷工程菌，優(yōu)化運(yùn)行條件為體系中功能微生物提供適合的生長環(huán)境是未來研究的主要趨勢之一。

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Research Progress on the Functional Microorganisms in Enhanced Biological Phosphorus Removal（EBPR）Systems

WEI Ru-ping1YAN Cheng1YANG Xin-yan1HE Xiao-yun2WANG Xin1YANG Liu-yan1
（1. School of the Environment，Nanjing University，State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse，Nanjing 210046 ；2.Zhejiang Environmental Monitoring Centre，Hangzhou 310012）

Phosphorus emission from human activities is one of the major causes of water eutrophication. The technology of enhanced biological phosphorus removal（EBPR）has been widely applied for removing phosphorus from wastewater due to its advantages of economy and sustainability. The key to the efficient and stable operation of EBPR system is that the microbial community in the system is reasonable and functional. For deeply understanding the mechanism of phosphorus removal and the efficient and stable operation of EBPR system，a large number of studies were conducted on the microbial community structure and main functional microorganisms in the system. In addition to polyphosphate-accumulating organisms（PAOs），the EBPR system also includes non-PAOs，mainly glycogen-accumulating organisms（GAOs）and some auxiliary bacteria. Nowadays，more and more types of functional polyphosphate-accumulating microorganisms were identified，and the most studied PAOs and GAOs were Accumulibacter and Defluviicoccus respectively. PAOs and GAOs compete or cooperate under different environmental conditions，but it is still controversial whether PAOs may exhibit the metabolic properties of GAOs under certain conditions.Besides the traditional factors such as carbon source，pH and temperature，the effects of exogenous pollutants，like antibiotics and heavy metals，on functional microorganisms in EBPR system also exist. The traditional separation methods，blue/white screening and the method of artificial construction of gene engineering bacteria have been applied for acquiring efficient PAOs. The development of modern molecular biologytechnology provides advanced and reliable technical means for the research of functional microorganisms in EBPR system，and the efficient removal of phosphorous by constructing high-performance polyphosphate-accumulating microorganisms will be an important trend in future increasing bio-removal phosphorus efficiency from actual wastewater.

enhanced biological phosphorus removal；polyphosphate-accumulating organisms；glycogen-accumulating organisms；blue/white screening；high-efficient polyphosphate-accumulating engineering organisms

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0558

2017-07-04

國家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)（2017ZX07204）

魏儒平，男，碩士研究生，研究方向：環(huán)境微生物學(xué)；E-mail：18956268200@163.com

楊柳燕，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：環(huán)境微生物學(xué)；E-mail：yangly@nju.edu.cn

（責(zé)任編輯 狄艷紅）