李勝男++趙起越++付剛++沙迪++徐紅艷

摘要：為確定胡桃楸（Juglans mandshurica）種仁殼多糖提取工藝條件，以多糖提取量為考察指標(biāo)，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取提取溫度、提取時間、料液比為自變量，多糖提取量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法對種仁殼多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，各變量影響主次順序為提取時間>料液比>提取溫度，優(yōu)化后的最佳提取工藝條件為提取溫度82 ℃，提取時間3.7 h，料液比1∶45（g∶mL）。通過驗證試驗，胡桃楸種仁殼多糖提取量為8.64 mg/g，RSD為1.94%，該回歸方程與實際情況擬合較好。

關(guān)鍵詞：胡桃楸（Juglans mandshurica）；種仁殼；多糖；響應(yīng)面法

中圖分類號：S792.132；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）22-5907-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.045

Optimization of Extract Technology of Polysaccharides from Seed Shell of

Juglans mandshurica in Changbai Mountain

LI Sheng-nan，ZHAO Qi-yue，F(xiàn)U Gang，SHA Di，XU Hong-yan

（Agricultural College of Yanbian University， Yanji 133002， Jilin， China）

Abstract：In order to determine the optimal conditions of polysaccharides extraction from seed shell of Juglans mandshurica， the content of polysaccharides was measured by the method of phenol-sulphate acid with the extraction yield of polysaccharides as evaluation index. Based on the single factor test，the extraction temperature，extraction time and solid-to-liquid ratio were selected as independent variables，and the extraction yield of polysaccharides was as response value，the extraction technology of polysaccharides from seed shell was optimized by response surface methodology（RSM）. Results showed that，the variables were ranked in decreasing order as extraction time，solid-to-liquid ratio and extraction temperature. The optimized extraction conditions were found to be a extraction temperature of 82 ℃，extraction time of 3.7 h and a solid-to-liquid ratio of 1∶45（g/mL）. The validation experiments indicated that，the extraction yield of polysaccharides from seed shell of Juglans mandshurica was 8.64 mg/g with RSD of 1.94%（n=5），and the experimental data could be well fitted with the developed regression equation.

Key words： Juglans mandshurica； seed shell； polysaccharides； response surface methodology

胡桃楸（Juglans mandshurica）又名山核桃、楸樹，為胡桃科胡桃屬落葉喬木，在東北分布廣泛，主要集中在小興安嶺、長白山區(qū)、完達(dá)山脈及遼寧東部，在大興安嶺林區(qū)東南部有少量分布[1]，是珍貴的用材樹種，也是重要的藥源植物，其葉、樹皮、根及果實均可入藥[2]。胡核楸屬伴生樹種[3]，與水曲柳、黃菠蘿并稱“東北三大硬闊”，是國家Ⅱ級珍稀樹種和中國珍稀瀕危樹種的三級保護(hù)植物[4，5]。胡桃楸種子是林業(yè)副產(chǎn)品，其種仁（俗稱山核桃仁）營養(yǎng)價值很高，早已成為人們的食療佳品。在種仁生產(chǎn)過程中，產(chǎn)生大量的種仁殼廢棄物，造成了資源的浪費。有研究顯示，胡桃楸種仁殼中含有多種化學(xué)成分，包括氨基酸、多糖、皂甙、黃酮、揮發(fā)油、香豆素類等[6]?，F(xiàn)代研究證實胡桃楸具有抗氧化、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗炎和殺菌等生物活性[7，8]。而目前對胡桃楸種子的研究主要集中在種仁的營養(yǎng)成分和營養(yǎng)價值以及在食品工業(yè)中的應(yīng)用等方面[9]，關(guān)于胡桃楸種仁殼的相關(guān)研究僅限于本課題組前期的種仁殼中黃酮成分的相關(guān)研究[10-13]，而有關(guān)胡桃楸種仁殼多糖的相關(guān)研究未見報道。

多糖（Polysaccharides，PS）又稱多聚糖，是由10個以上的單糖分子通過苷鍵聚合而成，一般由幾百甚至幾萬個單糖分子組成，是一類大分子化合物[14]。多糖廣泛存在于動物細(xì)胞膜、高等植物和微生物細(xì)胞壁中，從量上講，是碳水化合物在自然界中存在的主要形式[15]。隨著醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和高分子科學(xué)的不斷發(fā)展和相互滲透，發(fā)現(xiàn)多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗炎、抗病毒等多種生物功能，具有高效低毒的特點，是中藥的主要活性成分之一，并已在臨床上得到廣泛應(yīng)用[16，17]。

本研究以加工胡桃楸種仁產(chǎn)生的廢棄物種仁殼為原料，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化胡桃楸種仁殼多糖的提取條件，旨在為胡桃楸種仁殼多糖的深入研究提供理論依據(jù)，從而提高胡桃楸種子的附加值，促進(jìn)其綜合開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

胡桃楸種子采摘于吉林省延邊朝鮮族自治洲和龍市南崗山林區(qū)。無水葡萄糖、5%苯酚溶液、濃硫酸均為分析純。

UV-1800型紫外可見分光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；HH-S6型恒溫水浴鍋（余姚市肖東儀表廠）；BSA124S-CW型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程 胡桃楸種仁殼→去除雜質(zhì)、粉碎→過篩→水浴浸提→定容→苯酚硫酸法顯色→測定多糖含量。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用苯酚-硫酸法[18]，精確稱取105 ℃真空干燥至恒重的無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品24.0 mg，置于100 mL容量瓶中，配制0.24 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。精確移取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL標(biāo)準(zhǔn)品儲備液于試管中，再分別加入2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2 mL蒸餾水。然后再依次加入1.0 mL 5%苯酚溶液，搖勻，慢慢加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后置于40 ℃水浴15 min，取出置于冷水中冷卻10 min，蒸餾水做空白，486 nm處測吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)得出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.2.3 胡桃楸種仁殼多糖的提取 準(zhǔn)確稱取胡桃楸種仁殼粉末0.5 g，按適當(dāng)料液比加入蒸餾水，置于恒溫水浴中加熱，過濾，濾液于100 mL容量瓶中定容，備用。吸取定容提取液3 mL，按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定吸光度，多糖提取量按如下公式計算：

多糖提取量=C×V/m

式中，C為按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算的提取液多糖質(zhì)量濃度（μg/mL）；V為液體體積（mL）；m為原料質(zhì)量（g）。

1.2.4 單因素試驗 以多糖提取量為指標(biāo)，以提取料液比、提取溫度、提取時間為單因素，進(jìn)行胡桃楸種仁殼多糖提取的單因素試驗。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計 根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，采用3因素3水平響應(yīng)面分析法。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以液料比（g∶mL，下同）、提取溫度、提取時間3個因素為自變量，以多糖提取量為響應(yīng)值，采用最小二乘法擬合二次多項方程表達(dá)響應(yīng)值，試驗因素編碼及水平見表1。采用Minitab15軟件進(jìn)行試驗方案設(shè)計與結(jié)果統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.012 9x+0.017 5，R2=0.991 7，表明葡萄糖在0.017 5～0.800 0 mg/mL吸光度與濃度之間存在良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗

2.2.1 料液比對胡桃楸種仁殼多糖的影響 按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，恒溫80 ℃提取1 h，考察不同料液比對多糖提取量的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著溶劑的增加，多糖提取量逐漸增加，當(dāng)料液比大于1∶40時，增加幅度較大，之后呈現(xiàn)緩慢增長的趨勢。故選1∶40為最佳提取料液比。

2.2.2 溫度對胡桃楸種仁殼多糖的影響 按料液比1∶30，分別在50、60、70、80和90 ℃條件下，提取3 h，考察提取溫度對多糖提取量的影響，結(jié)果見圖2。溫度升高，分子運動速度加快，滲透、擴(kuò)散速度也加快。如圖2所示，隨著提取溫度的增加，多糖提取量不斷增大。但考慮溫度過高時，其他非多糖類的雜質(zhì)溶出量也會相應(yīng)增大。因此確定最佳溫度為80 ℃。

2.2.3 時間對胡桃楸種仁殼多糖的影響 在料液比1∶30，80 ℃條件下，分別提取1、2、3、4、5 h，考察提取時間對多糖提取量的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著提取時間的延長，多糖提取量也逐漸增加，當(dāng)提取時間大于3 h，多糖提取量呈現(xiàn)緩慢增長的趨勢。因此確定最佳提取時間為3 h。

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken試驗原理，按表2進(jìn)行試驗，對試驗結(jié)果進(jìn)行二次多項式逐步回歸擬合，得到如下回歸模型：

Y=8.304 50+0.477 85X1+0.212 54X2+0.666 46X3-0.423 72X12-0.960 25X22-0.628 65X32+0.610 47X1X2+0.134 37X1X3+0.051 50X2X3

模型的可靠性可以從方差分析及相關(guān)系數(shù)來考察，采用Minitab15軟件進(jìn)行模型的系數(shù)檢驗和方差分析，結(jié)果見表3和表4。由表3可知，一次項X1對多糖提取量影響顯著（P<0.05），X3對多糖提取量影響極顯著（P<0.01）；二次項X22和X32對多糖提取量影響顯著（P<0.05）；交互項X1X2對多糖提取量影響顯著（P<0.05）。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.920 1。由表4可知，對胡桃楸種仁殼多糖提取所建立的二次多項模型回歸項P值為0.027，具有顯著性（P<0.05）；模型失擬項P值為0.655，不顯著（P>0.05）。因此，該模型擬合度較好，可以用此模型對胡桃楸種仁殼多糖提取進(jìn)行分析和預(yù)測。

圖4～圖6分別為料液比、提取溫度、提取時間3因素影響胡桃楸種仁殼多糖提取量的響應(yīng)面和等高線。綜合分析響應(yīng)面試驗結(jié)果，提取時間對胡桃楸種仁殼多糖提取量影響最大，其次是料液比，影響最小的是提取溫度。依據(jù)回歸方程，響應(yīng)面優(yōu)化的胡桃楸種仁殼多糖的最佳提取工藝參數(shù)為：料液比1∶44.78，提取溫度82.13 ℃，提取時間3.67 h，回歸模型預(yù)測的山核桃殼多糖提取量理論值為8.83 mg/g。結(jié)合實際操作，最終確定最佳提取工藝參數(shù)為提取溫度82 ℃，提取時間3.7 h，料液比1∶45。按照最終確定的最佳工藝參數(shù)（提取溫度82 ℃，提取時間 3.7 h，料液比1∶45）進(jìn)行5次平行試驗，多糖平均提取量為8.64 mg/g，與理論預(yù)測值8.83 mg/g相比，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.94%，可見該模型能較好地模擬和預(yù)測胡桃楸種仁殼多糖的提取效果。

3 結(jié)論

本研究以長白山胡桃楸種仁殼為原料，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對胡桃楸種仁殼多糖的恒溫水浴提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳提取工藝條件為提取溫度82 ℃，時間3.7 h，料液比1∶45，各因素對多糖提取量影響的主次順序是：提取時間>料液比>提取溫度。經(jīng)驗證試驗，胡桃楸種仁殼多糖提取量為8.64 mg/g，與理論預(yù)測值之間的相對偏差較小，表明經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化的種仁殼多糖的提取條件是真實可靠的。長白山胡桃楸種仁殼可以作為植物多糖的可開發(fā)利用資源，但關(guān)于種仁殼多糖的純化、單糖組成分析及活性作用還有待進(jìn)一步的研究。

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