仲智勇，時保軍，周 輝，王文博（河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院小兒外科，石家莊 050017）

重組人p53腺病毒注射液對腎母細胞瘤細胞增殖、凋亡及自噬的影響Δ

仲智勇＊，時保軍，周 輝，王文博（河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院小兒外科，石家莊 050017）

目的：研究重組人p53腺病毒注射液對腎母細胞瘤細胞增殖、凋亡及自噬的影響。方法：將腎母細胞瘤細胞分別與高、中、低濃度（1×109、1×108、1×107VP/mL）的重組人p53腺病毒注射液共同孵育20 h，以不加注射液的細胞為空白對照。檢測細胞增殖、周期、凋亡及相關基因p21、Bax蛋白表達，檢測細胞中自噬相關基因LC-3、Atg7、Atg12表達和自噬體數(shù)量。結果：高、中、低濃度重組人p53腺病毒注射液對腎母細胞瘤細胞的增殖抑制率分別為（42.86±3.18）%、（33.64±7.25）%、（16.26±9.07）%，細胞凋亡率分別為（53.85±9.36）%、（37.35±9.64）%、（23.64±10.65）%。與空白對照比較，高、中、低濃度藥物作用下G0/G1期細胞均增加，其中高、中濃度藥物效果較明顯（P＜0.05或P＜0.01）；高濃度下細胞中p21、Bax蛋白和LC-3、Atg7、Atg12基因表達增強，自噬體數(shù)量增加（P＜0.01）；中濃度下細胞中Bax蛋白表達增強（P＜0.05），其余指標無明顯變化（P＞0.05）。結論：重組人p53腺病毒注射液可抑制腎母細胞瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡和自噬。

腎母細胞瘤；重組人p53腺病毒注射液；細胞周期；增殖；凋亡；自噬

腎母細胞瘤是兒童常見的惡性腫瘤性疾病之一，發(fā)病率在小兒腫瘤中高居第5位，手術切除并予以輔助化療是其主要治療手段[1]。但對于病理分型為間變型等的腎母細胞瘤預后不良型的治療，受到目前臨床治療手段的限制，療效一直不穩(wěn)定[2]。

重組人p53腺病毒（rAd-p53）注射液是以現(xiàn)代生物醫(yī)學工程技術為基礎，通過生物重組而制備的一類具有代表性的病毒顆粒注射液。有研究表明，rAd-p53注射液可以通過調節(jié)細胞凋亡過程對多種腫瘤起到治療作用[3-4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，自噬與細胞的凋亡有著密切的聯(lián)系，二者可以相互調控。本文主要研究rAd-p53注射液對腎母細胞瘤細胞增殖、凋亡及自噬的影響。

1 材料

1.1 儀器

CKX41倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；DM0412低速離心機（美國賽洛捷公司，離心半徑：4 cm）；LSM 880激光共聚焦顯微鏡（德國Zeiss公司）；JEM-1400透射電鏡（日本JEM公司）；Tanon 5500化學發(fā)光儀（上海天能科技有限公司）；Multiskan MK3酶標儀、ABI7500熒光定量聚合酶鏈式反應（Q-PCR）儀（美國Thermo公司）；FACSCantoⅡ流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 藥品與試劑

rAd-p53注射液（深圳市賽百諾基因技術有限公司，批號：20151003，規(guī)格：1×1012VP/支）；RPMI 1640培養(yǎng)液及胎牛血清（FBS）（美國Gibco公司）；胰蛋白酶（美國Sigma公司）；CCK-8試劑盒（日本同仁公司）；細胞周期、細胞凋亡試劑盒（四正柏生物技術有限公司）；兔p21（細胞周期相關基因）、Bax（凋亡相關基因）、LC-3（自噬相關基因）抗體及山羊抗兔二抗（美國Abcam公司）；增強化學發(fā)光（ECL）液（德國Milipore公司）；LC-3熒光標記試劑盒（美國Ebioscience公司）；所有化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 細胞

腎母細胞瘤細胞由中國科學院細胞所提供。

2 方法

2.1 給藥濃度的選擇

以預試驗結果為依據(jù)，本試驗的Ad-p53高、中、低濃度分別設定為1×109、1×108、1×107VP/mL，rAd-p53注射液用含有10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液進行稀釋；以含有10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液為空白對照。

2.2 腎母細胞瘤的培養(yǎng)

腎母細胞瘤細胞從液氮中取出后，迅速置于37℃水浴中，搖晃解凍，1 000 r/min離心3 min，去上清，轉移細胞至培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。待細胞生長至密布瓶底約80%以上，加入500 μL胰酶消化細胞，加入新培養(yǎng)液終止消化，1 000 r/min離心3 min，重懸細胞至合適濃度后進行下一步試驗操作。

2.3 rAd-p53注射液對腎母細胞瘤細胞增殖的影響

取傳一代后的腎母細胞瘤細胞，取1×104個細胞接種于96孔板中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入適量rAd-p53注射液使其終濃度分別為1×109、1×108、1×107VP/mL（高、中、低濃度組），每個濃度設6個復孔。于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)20 h后，按照CCK-8試劑盒檢測并計算細胞增殖抑制率，同時以含有10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)為空白對照組。

2.4 rAd-p53注射液對腎母細胞瘤細胞周期和凋亡的影響

取傳一代后的腎母細胞瘤細胞，取1×105個細胞接種于96孔板中，加入適量rAd-p53注射液使其終濃度分別為1×109、1×108、1×107VP/mL（rAd-p53高、中、低濃度組），每個濃度設6個復孔。培養(yǎng)20 h后，制備成細胞懸液，按照試劑盒要求加入碘化丙啶（PI）及異硫氰酸熒光素（FITC），采用流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡情況，計算凋亡率，同時以含有10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)為空白對照組。

2.5 rAd-p53注射液對腎母細胞瘤細胞中p21、Bax蛋白表達的影響

同“2.4”項下方法分組、培養(yǎng)細胞20 h后，胰蛋白酶消化細胞，冰浴超聲（200 W，10 s/次，共3次）破解細胞，提取總蛋白。總蛋白上樣量為30 μg，使用7.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳，80 V電泳30 min至平行后，使用120 V電泳90 min，200 mA恒流轉膜90 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入兔p21、Bax抗體（稀釋比例為1∶500），4℃孵育過夜；第2天洗膜后，加入山羊抗兔二抗（稀釋比例為1∶1 000），室溫孵育2 h，洗膜，ECL曝光，記錄數(shù)據(jù)。采用Image J軟件分析條帶光密度，以目標蛋白與內參β-肌動蛋白（β-actin）比值評價目標蛋白的相對表達量。

2.6 rAd-p53注射液對腎母細胞瘤細胞自噬的影響

2.6.1 自噬相關基因LC-3表達 取傳一代后的腎母細胞瘤細胞，取1×104個細胞接種于激光共聚焦專用皿中，加入適量的rAd-p53注射液使其終濃度分別為1×109、1× 108、1×107VP/mL（高、中、低濃度組），每個濃度設3個復孔。培養(yǎng)20 h后，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細胞后使用4%多聚甲醛固定細胞，3%牛血清白蛋白（BSA）封閉非特異性抗原，加入10 μg/mL兔LC-3抗體孵育細胞24 h。清洗后使用FITC熒光標記二抗孵育2 h，激光共聚焦顯微鏡拍照記錄數(shù)據(jù)，每孔拍攝3個視野，同時以含有10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)為空白對照組。

2.6.2 自噬相關基因Atg7、Atg12表達 同“2.4”項下方法分組、培養(yǎng)細胞20 h后，吸去培養(yǎng)液，加入Trizol裂解細胞提取總RNA，按照Takara試劑盒說明書反轉錄為mRNA，并采用Q-PCR法檢測Atg7、Atg12基因的表達情況，每個濃度設6個復孔。擴增條件：95℃、15 min；94℃、15 s，40個循環(huán)；62℃、60 s。引物序列：Atg7上游引物為5′-GAGGAGACCGTCTGAGCAAC-3′，下游引物為5′-TGACACAGGAAGGTGCAA-3′，擴增長度為131 bp；Atg12上游引物為 5′-AAACGTGAGCCAAGGGATT-3′，下游引物為5′-AAACGTGAGCCAAGGGATT-3′，擴增長度為132 bp；內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）上游引物為5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′，下游引物為5′-AAATGAGCCCCAGCCTTCTCCATG-3′，擴增長度為325 bp。數(shù)據(jù)使用2－ΔΔct法分析，ΔΔct＝Δct給藥組－Δct空白對照組，Δct＝ct目標產(chǎn)物－Δct內參。

2.6.3 自噬體數(shù)量 同“2.4”項下方法分組、培養(yǎng)細胞20 h后，胰蛋白酶消化細胞，2.5%中性戊二醛固定4 h，用PBS漂洗6次，加1%鋨酸固定2 h，乙醇梯度脫水并使用樹脂滲透，包埋，切片（厚度為50～70 nm），鈾鉛雙染色后，透射電鏡觀察自噬體數(shù)量的變化。

2.7 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 細胞增殖抑制率

高、中、低濃度rAd-p53注射液對腎母細胞瘤細胞的增殖抑制率分別為（42.86±3.18）%、（33.64±7.25）%、（16.26±9.07）%。與空白對照組比較，rAd-p53中、高濃度組細胞的增殖抑制率明顯升高（P＜0.01）；rAd-p53高、中、低濃度組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3.2 細胞周期和凋亡率

與空白對照組比較，rAd-p53高、中濃度組G0/G1期細胞明顯增加（P＜0.05或P＜0.01），rAd-p53高、中、低濃度組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。各組細胞周期變化和凋亡率測定結果見表1。

表1 各組細胞周期變化和凋亡率測定結果（±s，n＝6）Tab 1 Changes of cell cycle and determination results of apoptosis rate in each group（±s，n＝6）

表1 各組細胞周期變化和凋亡率測定結果（±s，n＝6）Tab 1 Changes of cell cycle and determination results of apoptosis rate in each group（±s，n＝6）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

凋亡率，% 5.27±1.64 53.85±9.36＊＊37.35±9.64＊＊23.64±10.65＊組別空白對照組rAd-p53高濃度組rAd-p53中濃度組rAd-p53低濃度組G0/G1，% 61.66±3.84 81.74±4.76＊＊73.46±5.73＊66.32±6.86 S，% 23.75±1.85 9.54±0.97＊＊14.75±2.87＊22.85±4.86 G2/M，% 14.09±1.01 8.12±1.89＊11.39±5.25 10.13±3.15

3.3 p21、Bax蛋白表達

與空白對照組比較，rAd-p53高濃度組細胞中p21和Bax蛋白表達增強（P＜0.01），rAd-p53中濃度組細胞中Bax蛋白表達增強（P＜0.05），其余差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組細胞中p21、Bax蛋白表達的電泳圖見圖1，測定結果見表2。

圖1 各組細胞中p21、Bax蛋白表達的電泳圖Fig 1 Electrophoresis graphs of p21，Bax protein expressions of cells in each group

表2 各組細胞中p21、Bax蛋白表達測定結果（±s，n＝6）Tab 2 Determination results of p21，Bax protein expressions of cells in each group（±s，n＝6）

表2 各組細胞中p21、Bax蛋白表達測定結果（±s，n＝6）Tab 2 Determination results of p21，Bax protein expressions of cells in each group（±s，n＝6）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

Bax/β-actin 0.998±0.001 1.455±0.107＊＊1.267±0.054＊1.065±0.647組別空白對照組rAd-p53高濃度組rAd-p53中濃度組rAd-p53低濃度組p21/β-actin 1.021±0.009 1.365±0.042＊＊1.127±0.153 0.995±0.264

3.4 自噬情況

3.4.1 LC-3基因表達 與空白對照組比較，rAd-p53高濃度組細胞中LC-3熒光增多，rAd-p53中、低濃度組細胞中LC-3熒光無明顯變化。各組細胞中LC-3基因表達熒光圖見圖2。

圖2 各組細胞中LC-3基因表達熒光圖（FITC，×400）Fig 2 Fluorescence graphs of LC-3 gene expression of cells in each group（FITC，×400）

3.4.2 Atg7、Atg12基因表達 與空白對照組比較，rAdp53高濃度組細胞中Atg7、Atg12基因表達增強（P＜0.01），表明細胞自噬的基因啟動，細胞自噬顯著性增加；其余組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組細胞中Atg7、Atg12基因表達的測定結果見表3。

表3 各組細胞中Atg7、Atg12基因表達的測定結果（±s，n＝6）Tab 3 Determination results of Atg7，Atg12 gene expressions of cells in each group（±s，n＝6）

表3 各組細胞中Atg7、Atg12基因表達的測定結果（±s，n＝6）Tab 3 Determination results of Atg7，Atg12 gene expressions of cells in each group（±s，n＝6）

注：與空白對照組比較，＊＊P＜0.01Note：vs.blank control group，＊＊P＜0.01

Atg12/GAPDH 1.015±0.008 2.287±0.211＊＊1.333±0.624 1.098±0.274組別空白對照組rAd-p53高濃度組rAd-p53中濃度組rAd-p53低濃度組Atg7/GAPDH 1.001±0.012 1.928±0.173＊＊1.264±0.521 1.173±0.324

3.4.3 自噬體數(shù)量 與空白對照組比較，rAd-p53高濃度組細胞內自噬體數(shù)量明顯增加，rAd-p53中、低濃度組細胞內自噬體數(shù)量無明顯變化，表明高濃度rAd-p53注射液可以促進細胞自噬的發(fā)生。各組細胞自噬體的透射電鏡圖見圖3。

4 討論

自1995年9月美國FDA批準第一個p53基因治療的臨床試驗方案，現(xiàn)臨床研究已證實rAd-p53制品采用多種給藥方式均可以治療多種惡性腫瘤，并且安全[5]。從調查研究中發(fā)現(xiàn)，多數(shù)惡性腫瘤有p53基因突變，同時，rAd-p53注射液對多種不同類型的腫瘤均表現(xiàn)出很強的抑制作用，臨床應用結果都說明其能提高患者的生活質量，未發(fā)現(xiàn)嚴重不良反應，安全性較好。流行病學研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤情況的發(fā)生與p53基因的改變有著密切聯(lián)系[6-7]，有將近60%的人類腫瘤的發(fā)生都與其改變有關，通過增強p53基因表達從而起到治療腫瘤作用是目前藥物作用的重要靶點之一[8]。據(jù)目前的研究發(fā)現(xiàn)，腎母細胞瘤也存在著p53基因缺失等基因突變的狀況[9]。

p21是由p53調控的下游蛋白，p53-p21-去磷酸化細胞瘤通路也是調控腫瘤基因表達的重要通路之一，該通路的異常表達會導致機體細胞的癌變[10]。對于正常的細胞而言，該通路的激活會引起細胞的衰老和生長的抑制；而對于癌細胞而言，該通路的激活會誘導癌細胞的凋亡，從而起到治療腫瘤的作用[11-12]。Bax是位于線粒體膜上的一類具有調控凋亡功能的蛋白，研究表明，只有當p53基因被激活時，Bax才會發(fā)揮促進細胞凋亡的作用[13]。rAd-p53注射液通過調控p21及Bax兩個基因和蛋白的表達，從而起到促進癌細胞凋亡的作用。另外，研究還發(fā)現(xiàn)rAd-p53注射液誘導腎母細胞瘤細胞的凋亡，還與誘導細胞自噬的發(fā)生有關。研究表明，細胞自噬增加與細胞凋亡發(fā)生有著密切的關系[14]。本研究證實了rAd-p53注射液具有通過增加細胞自噬從而治療腫瘤的作用，表明通過調節(jié)細胞自噬來抗腫瘤可能是p53治療的新靶標。

本試驗證實了rAd-p53注射液具有抑制腎母細胞瘤細胞增殖、抑制癌細胞周期、增強癌細胞凋亡、同時誘導p21和Bax基因表達而增強腫瘤細胞自噬的作用，具有治療腎母細胞瘤的潛力，這對擴寬rAd-p53注射液的應用范圍有著重要的意義。

圖3 各組細胞中自噬體的透射電鏡圖（×10 000）Fig 3 Transmission electron microscopys of cell autophagosomes in each group（×10 000）

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Effects of rAd-p53 Injection on the Proliferation，Apoptosis and Autophagy of Nephroblastoma Cells

ZHONG Zhiyong，SHI Baojun，ZHOU Hui，WANG Wenbo（Dept.of Pediatric Surgery，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

OBJECTIVE：To study the effects of rAd-p53 injection on the proliferation，apoptosis and autophagy of nephroblastoma cells.METHODS：Nephroblastoma cells were respectively cultured 20 h with high，medium，low concentration（1×109，1× 108，1×107VP/mL）of Recombinant human rAd-p53 injection，cells with no injection were the blank control.Cell proliferation，cycle，apoptosis and related gene p21，Bax protein expressions were detected，and autophagy gene LC-3，Atg7，Atg12 expressions and number of autophagosomes were also detected.RESULTS：The proliferation inhibition rates of high，medium，low concentration of Recombinant human rAd-p53 injection to nephroblastoma cells were（42.86±3.18）%，（33.64±7.25）%，（16.26±9.07）%；apoptotic rates were（53.85±9.36）%，（37.35±9.64）%，（23.64±10.65）%，respectively.Compared with blank control，cells at period G0/G1were increased under high，medium，low concentration Recombinant human rAd-p53 injection，effects were relatively obvious under high，medium concentration（P＜0.05 or P＜0.01）；p21，Bax protein and LC-3，Atg7，Atg12 gene expressions were enhanced under high concentration，the number of autophagosomes was increased（P＜0.01）；Bax protein expression was enhanced under medium concentration（P＜0.05），the other indicators had no obvious changed（P＞0.05）.CONCLUSIONS：Recombinant human rAd-p53 injection can inhibit the cell proliferation of nephroblastoma，and induce its apoptosis and autophagy.

Nephroblastoma；rAd-p53 injection；Cell cycle；Proliferation；Apoptosis；Autophagy

R361+.3

A

1001-0408（2017）07-0889-04

2016-07-21

2017-01-04）

（編輯：鄒麗娟）

河北省2013年醫(yī)學科學研究計劃基金項目（No.20130151）

＊副教授，碩士。研究方向：兒童腫瘤。電話：0311-66002267。E-mail：zhongzy2005@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.07