潘德灼, 林偉彬, 譚芳林, 陳 偉,3

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建林業(yè)科學(xué)研究院，福建 福州 350012；3.福建農(nóng)林大學(xué)分子細(xì)胞與系統(tǒng)生物學(xué)中心，福建 福州 350002)

紅樹植物秋茄查爾酮合酶基因克隆及其在鹽脅迫下的表達(dá)分析

潘德灼1, 林偉彬1, 譚芳林2, 陳 偉1,3

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建林業(yè)科學(xué)研究院，福建 福州 350012；3.福建農(nóng)林大學(xué)分子細(xì)胞與系統(tǒng)生物學(xué)中心，福建 福州 350002)

以秋茄(Kandeliacandel)葉片為試驗材料，采用RT-PCR的方法獲得秋茄查爾酮合酶(chalcone synthase, CHS)基因的cDNA序列，命名為KcCHS, GenBank登錄號為KX673194.1.序列分析結(jié)果表明，KcCHS基因的cDNA序列長度為1 170 bp，編碼389個氨基酸，屬于CHS超家族.序列比對結(jié)果顯示，秋茄與其他物種的CHS基因核苷酸序列具有較高的相似性，平均達(dá)到80%以上.系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，KcCHS基因與余甘子CHS基因親緣關(guān)系最近.實(shí)時熒光定量PCR分析表明，秋茄葉片KcCHS基因的轉(zhuǎn)錄水平隨著NaCl濃度的升高而上升.此外，隨著NaCl濃度的升高，黃酮類化合物的含量顯著增加，羥自由基清除率也明顯提高.

秋茄; 查爾酮合酶基因; 克隆; 鹽脅迫

鹽堿地含有較高濃度的可溶性鹽分，會造成土壤水勢降低，植物種子的胚軸受到破壞，植物根系活力下降，蛋白形成困難，生理代謝失調(diào)等現(xiàn)象，最終導(dǎo)致植物的死亡，因此土壤的鹽堿化已成為嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的非生物脅迫因子[1-3].秋茄[Kandeliacandel(L.) Druce]屬于紅樹科(Rhizophoraceae)秋茄屬(Kandelia)木本植物，是一種典型的非泌鹽紅樹植物，主要生長于熱帶和亞熱帶的海岸潮間帶地區(qū)[4].由于秋茄長期受到不同鹽度海水的浸漬，所以已進(jìn)化一套獨(dú)特的耐鹽機(jī)制以適應(yīng)鹽環(huán)境，蘊(yùn)含著豐富的耐鹽基因資源.我國鹽堿地占地34.7×106hm2，研究紅樹植物秋茄的耐鹽基因，利用耐鹽基因培育耐鹽植物，對開發(fā)利用鹽堿地具有十分重要的意義.

查爾酮合酶(chalcone synthase, CHS)是植物黃酮類化合物生物合成的關(guān)鍵限速酶[5]，而黃酮類化合物是一類重要的抗氧化和清除自由基的植物次級代謝產(chǎn)物，在植物生長發(fā)育以及抵抗逆境脅迫的過程中發(fā)揮重要作用[6-8].前人關(guān)于CHS基因的研究主要是探討該基因?qū)χ参锘ㄉ纬傻挠绊懀P(guān)于CHS基因抗逆性的研究鮮見報道.研究發(fā)現(xiàn)，杧果(Mangiferaindica)和蜜柑(Citrusunshiu)等植物CHS基因表達(dá)量與黃酮類化合物的累積呈正相關(guān)[9-10].銀杏(Ginkgobiloba)葉片在紫外線B(UV-B)處理下，CHS基因的表達(dá)量顯著增加[11]，但是紅樹植物的抗逆性與CHS基因表達(dá)量間的關(guān)系尚未見報道.本實(shí)驗室前期研究結(jié)果表明，秋茄在鹽脅迫條件下，與苯丙烷代謝途徑相關(guān)的黃酮類化合物有明顯增加的趨勢[12].目前，漆樹科、木蘭科、蕓香科、豆科、十字花科、旋花科、茄科以及葡萄科等多個物種的CHS基因已被克隆[13-15]，但是未見秋茄CHS基因的研究報道.鑒于此，本研究以秋茄為材料，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果(CL8403.Contig2_All)設(shè)計引物，RT-PCR擴(kuò)增CHS基因，克隆并測序后得到CHS基因的cDNA序列，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，再利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)，探索不同鹽濃度條件下秋茄CHS基因表達(dá)量的變化規(guī)律，以期揭示秋茄的耐鹽機(jī)制，也為培育作物耐鹽品種提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

秋茄胚軸采自福建省泉州市洛陽河紅樹林保護(hù)區(qū)(24°58′ N、118°39′ E).選擇外觀完好、無蟲害、無機(jī)械損傷及大小相近的成熟胚軸，培養(yǎng)于潔凈的砂子中，培養(yǎng)條件：溫度25～30 ℃，光周期 光照16 h，黑暗8 h，光照強(qiáng)度 1 200～1 250 μmol·m-2·s-1，相對濕度70%.每盆(30×42×14 cm)砂子種植胚軸15株，每天澆水2次，每隔2天換1次Hoagland營養(yǎng)液(每盆1 L).待幼苗第2對葉片完全展開時進(jìn)行鹽脅迫處理，以Hoagland營養(yǎng)液為基本溶液，添加濃度為200、500 mmol·L-1NaCl，以無添加NaCl為對照組，每個處理設(shè)3個重復(fù)，處理72 h后采集完好的葉片，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用.

1.2 總RNA提取和CHS基因克隆

應(yīng)用CTAB-LiCl沉淀法提取秋茄葉片總RNA[16]，采用TaKaRa公司PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Perfect Real Time; TaKaRa公司，日本)試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增.根據(jù)秋茄葉片CHS基因的轉(zhuǎn)錄組序列(CL8403.Contig2_All)設(shè)計特異性引物，上游引物(F)：5′-AATGGTGACGGTTGATGAAG-3′ ，下游引物(R)：5′-ATGACATGGACTGGAGTGATA-3′ .PCR擴(kuò)增的參數(shù)為：95 ℃變性3 min，1個循環(huán)；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸5 min.PCR產(chǎn)物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，應(yīng)用北京BioTeKe生物技術(shù)有限公司的多功能DNA純化回收試劑盒(離心柱型)回收純化目的DNA片段.將目的DNA片段連接到pMD18-T載體，采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(購自華大基因).Amp抗性篩選和X-gal/PTG藍(lán)白斑篩選后，選取白色菌落進(jìn)行液體培養(yǎng).采用通用引物BcaBEST Primer RV-M和BcaBEST Primer M13-47進(jìn)行PCR檢測陽性克隆.選取轉(zhuǎn)化成功的菌液，按照泰京生物技術(shù)有限公司的質(zhì)粒小提試劑盒的使用說明書，提取質(zhì)粒并通過1%的瓊脂糖凝膠檢測后，檢測合格的質(zhì)粒溶液由深圳華大基因公司測序.

1.3 生物信息學(xué)分析

應(yīng)用InterProScan在線工具(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)分析氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)，應(yīng)用NCBI中BLAST在線工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索CHS基因編碼的同源氨基酸序列，利用MEGA 6.06軟件的最大似然法(maximum likelihood, ML)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.

1.4 qRT-PCR分析

秋茄葉片CHS基因的qRT-PCR分析在Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀上進(jìn)行，方法參照熒光試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus，購自TaKaRa公司)的操作說明書.引物CHS-F：5′-TCCAGGGCAGAAAGACCA-3′ ，CHS-R：5′-TCCTCGGAT-TGCGTAGTG-3′ ，選擇Actin基因作為內(nèi)參，引物Actin-F：5′-GGCAGATAGATGCTTATG-TAGGTG-3′ ，Actin-R：5′-TGTTTGCTTTAGGGTTGAGTGG-3′.反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s，1個循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)；65 ℃升至95 ℃，每升高0.5 ℃，恒溫保持5 s.試驗設(shè)3個重復(fù)，基因相對表達(dá)量采用2-△△Ct法[17]進(jìn)行計算.

1.5 生理指標(biāo)測定及數(shù)據(jù)分析

黃酮類化合物含量測定參考趙亞婷等方法[18].羥自由基清除率參照郭亞力等方法[19].每個試驗均進(jìn)行3次重復(fù).采用EXCEL軟件處理試驗數(shù)據(jù)，利用DPS 14.5軟件分析試驗數(shù)據(jù)，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 秋茄葉片CHS基因的克隆

以500 mmol·L-1NaCl處理72 h后的秋茄葉片樣本cDNA第一鏈為模板，用引物F：5′-AATGGTGACGGTTGATGAAG-3′，R：5′-ATGACATGGACTGGAGTGATA-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可擴(kuò)增出1條約1 200 bp的特異性條帶，條帶大小符合預(yù)期結(jié)果(圖1-A).

目的條帶片段回收后，連接到pMD 18-T載體，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)培養(yǎng)后挑選陽性克隆接種于含100 μg·mL-1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR，鑒定轉(zhuǎn)化結(jié)果.結(jié)果如圖1-B所示，擴(kuò)增條帶約1 200 bp，與預(yù)期結(jié)果相符，說明目的條帶連接pMD 18-T載體后成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α.

根據(jù)菌液PCR的結(jié)果，選取轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌培養(yǎng)液，提取質(zhì)粒后電泳，可以看出，質(zhì)粒條帶清晰，說明成功獲得了濃度較高的重組質(zhì)粒，可以用于測序(圖1-C).

M：DNA分子標(biāo)記；1：RT-PCR擴(kuò)增CHS基因(A)；2：菌液PCR篩選CHS基因陽性克隆(B)；3：重組質(zhì)粒(C).

2.2 CHS基因序列的生物信息學(xué)分析

將重組質(zhì)粒送至深圳華大基因公司測序，結(jié)果表明，秋茄CHS基因長度為1 170 bp，編碼389個氨基酸(圖2)，命名為KcCHS，序列的GenBank登錄號為KX673194.1.根據(jù)InterProScan在線軟件分析KcCHS編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)，研究表明，秋茄CHS蛋白具有典型的CHS蛋白保守結(jié)構(gòu)域：N-末端結(jié)構(gòu)域(Asp5-Pro228)、C-末端結(jié)構(gòu)域(Glu238-Val387)、植物Ⅲ型聚酮合酶的結(jié)構(gòu)域(Val2-Ile389)和查爾酮/二苯乙烯合成酶的活性位點(diǎn)(Arg156-Arg172).KcCHS編碼的產(chǎn)物屬于植物Ⅲ型聚酮合酶家族即查爾酮合酶超家族，該家族包括柚皮素——查爾酮合酶(naringenin-chalcone synthases, CHSs)和二苯乙烯合成酶(stilbene synthases, STSs)兩大類.

序列相似性分析發(fā)現(xiàn)，秋茄CHS基因序列與其他15種植物CHS基因的核苷酸序列的相似性為80%～84%，其中與胡楊(Populuseuphratica)CHS基因的相似性最高，為84%，而與變?nèi)~海棠(Malustoringoides)、獼猴桃(Actinidiachinensis)和浙江紅花油茶(Camelliachekiangoleosa)CHS基因的相似性最低，為80%(表1).這表明各種植物的CHS基因序列比較保守.

左邊數(shù)字代表核苷酸數(shù)；右邊數(shù)字代表氨基酸數(shù).

表1 秋茄CHS基因與15種其他植物CHS基因核苷酸序列相似性比較

采用MEGA 6.06軟件構(gòu)建秋茄和其他15種植物CHS基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹，由圖3可知，秋茄與余甘子(Phyllanthusemblica)CHS基因在進(jìn)化上靠得最近，并且與麻風(fēng)樹(Gossypiumhirsutum)和胡楊CHS基因聚成一個分支，同時，棗(Ziziphusjujuba)自成一個分支，其他11種植物的CHS基因又聚成2個分支.這說明秋茄和木本植物的余甘子親緣關(guān)系最近，與麻風(fēng)樹和胡楊的親緣關(guān)系較近，與其他12種植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn).

2.3 KcCHS相對表達(dá)量及生理指標(biāo)分析

為了研究KcCHS相對表達(dá)量與鹽脅迫過程中NaCl濃度的關(guān)系，以秋茄肌動蛋白Actin作為內(nèi)參進(jìn)行模板定量，對鹽脅迫下秋茄葉片CHS基因進(jìn)行qRT-PCR分析.圖4-A表明，隨著NaCl濃度的升高，KcCHS相對表達(dá)量呈極顯著上升趨勢(P<0.01)，與對照組相比，200 mmol·L-1NaCl和500 mmol·L-1NaCl處理的KcCHS相對表達(dá)量分別上升了1.39倍和4.01倍.由圖4-B結(jié)果顯示，鹽處理下秋茄葉片黃酮類化合物的含量隨著鹽濃度的上升而顯著上升，而且在500 mmol·L-1NaCl處理下的黃酮類化合物的含量極顯著高于對照組(P<0.01).此外，本研究還對不同鹽處理下的秋茄葉片的羥自由基清除率進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)200 mmol·L-1和500 mmol·L-1NaCl處理的葉片，羥自由基清除率均顯著高于對照(P<0.05，圖4-C).

圖3 秋茄和其他15種植物的CHS核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

不同小寫字母表示組間顯著差異(P<0.05) ；不同大寫字母表示組間極顯著差異(P<0.01).

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)植物CHS的保守結(jié)構(gòu)域含有活性位點(diǎn)Cys164、His303和Asn336，具有CHS基因所必需的活性位點(diǎn)Thr169、Ile309和Val342，以及CHS的信號序列GFGPG等[20].本研究從紅樹植物秋茄葉片中克隆了KcCHS基因，該基因編碼389個氨基酸，具有典型的CHS蛋白保守結(jié)構(gòu)域如N-末端結(jié)構(gòu)域(Asp5-Pro228)、C-末端結(jié)構(gòu)域(Glu238-Val387)等.N-末端結(jié)構(gòu)域含有1個活性位點(diǎn)Cys164和1個CHS基因所必需的活性位點(diǎn)Thr169.N-末端結(jié)構(gòu)域的不同可造成CHS基因活性的不同，是CHS功能活性的關(guān)鍵部位，其中N-端結(jié)構(gòu)域中保守的Cys164在激活CHS的催化活性以及香豆酰輔酶A結(jié)合位點(diǎn)活性中起著至關(guān)重要的作用[21].同時，C-末端結(jié)構(gòu)域含有2個活性位點(diǎn)His303和Asn336，以及2個CHS基因所必需的活性位點(diǎn)Ile309和Val342.這些位點(diǎn)能夠促進(jìn)底物與查爾酮合酶的結(jié)合[20].另外，秋茄CHS蛋白C-末端含有GFGPG信號序列.與此同時，對秋茄與其他15種植物CHS基因的核苷酸序列的相似性進(jìn)行分析，結(jié)果表明秋茄與其他物種CHS基因的相似性較高，達(dá)80%～84%.此外，從秋茄CHS和其他15種植物CHS核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出，紅樹科秋茄與大戟科余甘子親緣關(guān)系最近，與麻風(fēng)樹和胡楊的親緣關(guān)系較近，與其他12種植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn).這些結(jié)果表明，植物CHS基因是一種高保守的基因家族，在植物的生長發(fā)育過程中有著重要作用，同時說明紅樹植物秋茄的CHS基因在進(jìn)化過程中發(fā)生了一定的變異.

大量研究表明，CHS基因在植物色素形成過程中發(fā)揮重要作用，其作用機(jī)制研究得較深入[8,10,13-15].矮牽牛(Toreniahybrida)花色素合成因為CHS基因和二氫黃酮醇4-還原酶基因的共同抑制而受到影響，從而改變了花的顏色[15].此外，CHS基因在防UV照射、抵御病原真菌侵染等抗逆方面也起著重要作用[22-24]，高梁(Sorghumvulgare)幼苗被玉米小斑病病菌(Bipolarismaydis)侵染后CHS基因的表達(dá)量明顯增加[23]；紅蘿卜在紫外線A的照射下CHS基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)[24].本研究發(fā)現(xiàn)隨著鹽脅迫的增強(qiáng)，KcCHS的相對表達(dá)量呈極顯著上升趨勢.另外，研究表明，紅砂(Reaumuriasoongorica)在UV-B輻射脅迫下，黃酮類化合物含量顯著增加[25]；在干旱脅迫下酸棗(ZiziphusjujubaMill.)葉片黃酮類化合物含量顯著增加[26]；在鹽脅迫下烤煙NC89葉片中黃酮類化合物含量也明顯增加[27].因此黃酮類化合物含量的增加有助于提高植物體抵抗不利生長環(huán)境的能力.本研究表明，隨著NaCl濃度的升高，黃酮類化合物的含量顯著增加，羥自由基清除率也明顯提高.總之，這些結(jié)果說明秋茄能夠通過增強(qiáng)黃酮類化合物的合成代謝來適應(yīng)鹽環(huán)境，是秋茄耐鹽性的一個特征，意味著KcCHS與秋茄抵抗鹽脅迫的能力有關(guān)，為揭示秋茄的耐鹽機(jī)制提供理論依據(jù).

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(責(zé)任編輯:吳顯達(dá))

Cloning and expression analysis of chalcone synthase gene from mangrove treeKandelia candelundersaltstress

PAN Dezhuo1, LIN Weibin1, TAN Fanglin2, CHEN Wei1,3

(1.College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2.Fujian Academy of Forestry, Fuzhou, Fujian 350012, China; 3.Molecular Cell and System Biology Center, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

The accumulation of flavonoid plays an important role in physiological accommodation whenKandeliacandelsuffered from high-salinity stress. In this study, a cDNA sequence of chalcone synthase (CHS) gene from the leaves ofK.candelwas cloned using RT-PCR, namedKcCHS(GenBank accession. KX673194.1). Sequence analysis indicated that the cDNA sequence ofKcCHScontained an open reading frame (ORF) of 1170 bp encoding 389 amino acids which belonged to theCHSsuperfamily. Sequence alignment analysis revealed thatCHSfromK.candelshared more than 80% homology withCHSfrom other plant species. The phylogenetic analysis based on the cDNA sequences showed thatKcCHShad the closest genetic relationship with theCHSfromPhyllanthusemblica. Real-time quantitative PCR was carried out to analyze the expression level ofKcCHSunder different NaCl conditions, showing that its expression level increased with elevated NaCl concentration. Furthermore, the content of flavonoids and the scavenging rate of hydroxyl radical in NaCl treatments both increased compared with the control. These results suggested that the up-regulation expression ofKcCHSmight improve salt tolerance ofK.candel.

Kandeliacandel; chalcone synthase gene; cloning; salt stress

2016-08-15

2016-09-30

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費(fèi)(201504415).

潘德灼(1982-)，男，博士研究生.研究方向：植物生理與分子生物學(xué).Email:pdz_006@163.com.通訊作者陳偉(1955-)，教授，博士，博士生導(dǎo)師.研究方向：植物生理與分子生物學(xué).Email: weichen909@163.com.

S718.43

A

1671-5470(2017)02-0180-07

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.02.010