摘 要 為探索淀粉對四川三大煙區(qū)烤煙品質(zhì)、香氣特征的影響，以四川主要栽培品種紅花大金元和云煙87為材料，在攀西煙區(qū)（攀枝花、涼山）、川南煙區(qū)（瀘州）、川北煙區(qū)（廣元）駐點采樣，研究煙株旺長期、現(xiàn)蕾期和成熟期碳代謝重要產(chǎn)物淀粉相關(guān)分解酶活性及基因表達情況。研究發(fā)現(xiàn)：1）各地淀粉酶均呈現(xiàn)先降后升的規(guī)律，酶活性在煙草成熟期最高；各地淀粉去分支酶活性變化與淀粉酶活性變化相似，在旺長期、現(xiàn)蕾期酶活性較低，進入成熟期后酶活性升高。2）攀西煙區(qū)淀粉酶活性在不同時期均最高，且與川北、川南兩煙區(qū)差異顯著，而其淀粉去分支酶活性在三煙區(qū)中最低，淀粉酶活性差異有可能是導(dǎo)致各煙區(qū)煙葉香型不同的因素。淀粉去分支酶活性較弱，各煙區(qū)差異相對較小。β-amylase基因表達量相對較高，且三大煙區(qū)之間表達量差異較為明顯，也是影響各煙區(qū)香型不同的因素之一。

關(guān)鍵詞 烤煙；淀粉分解酶類活性；基因表達量；四川三大煙區(qū)

中圖分類號：S572；Q946.5 文獻標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.25.008

知網(wǎng)出版網(wǎng)址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1186.S.20170908.1504.011.html 網(wǎng)絡(luò)出版時間：2017/9/8 15：04：15

煙草（Nicotiana tabacum L.）為雙子葉植物管花目茄科煙草屬植物，是以收獲葉片為目標(biāo)的一種應(yīng)用價值極高的重要經(jīng)濟作物，煙葉品質(zhì)的好壞直接決定烤煙最終的經(jīng)濟價值。國內(nèi)外研究表明，生態(tài)環(huán)境的不同通過影響煙株內(nèi)部的生理生化反應(yīng)成為影響煙葉質(zhì)量的關(guān)鍵因素，是優(yōu)良煙葉品質(zhì)形成的基礎(chǔ)與前提[1-2]。

四川作為我國最為重要的煙葉主產(chǎn)區(qū)之一，各煙區(qū)區(qū)域氣候特征差異明顯，土壤類型分布多樣，海拔跨度較大，生態(tài)環(huán)境不一，因而烤煙抽吸風(fēng)格特色各有特色，綜合來看可將四川分為攀西煙區(qū)、川南煙區(qū)和川北煙區(qū)三大煙區(qū)。其中，攀西地區(qū)煙葉香氣量較足，香氣質(zhì)佳，加工性好，香氣特性兼有清香型和中間型；川南地區(qū)煙葉外觀質(zhì)量和物理特性均不如攀西地區(qū)，化學(xué)成分協(xié)調(diào)性好，該地區(qū)的部分煙葉產(chǎn)區(qū)煙堿含量偏高，勁頭偏大，香氣特性為中間型；川北地區(qū)煙葉外觀質(zhì)量和物理特性較好，化學(xué)成分較為協(xié)調(diào)，該地區(qū)煙葉還原糖含量較高，煙葉香氣特性為中間型[3-4]。

淀粉是煙草碳代謝的主要產(chǎn)物之一，是煙草光合作用的主要產(chǎn)物。煙草作為以積累淀粉為主的粉葉類植物，新鮮煙葉中淀粉含量很高，含量常達到干重的40%，其中直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例約為23∶77[5]。淀粉在煙葉中既可作為主要的營養(yǎng)物質(zhì)積累，也可在需要能量時部分水解為葡萄糖供機體利用。煙葉品質(zhì)與其淀粉含量密切有關(guān)。一方面，卷煙制品中，以淀粉形態(tài)存在的糖類在煙支燃吸時，對煙氣質(zhì)量會產(chǎn)生不良影響：1）影響燃燒速度以及燃燒完全性；2）淀粉在煙支燃燒時產(chǎn)生的糊焦氣味，會使煙草香味變差，口感欠佳，使人通過吸食卷煙得到的愉悅程度下降。所以從卷煙制品的角度來講，淀粉含量越低越好。另一方面，立足于煙葉生長，要達到充分的成熟，則淀粉的積累必須達到最高峰。在烤煙的烘烤的過程中，約有80%的淀粉經(jīng)過酶的作用轉(zhuǎn)化為糖，只有少量淀粉被分解為中間產(chǎn)物如糊精等，因此通常情況下，鮮煙葉中淀粉積累越多，煙葉成熟越充分，烘烤調(diào)制過程淀粉水解越完全，淀粉轉(zhuǎn)化為有利物質(zhì)就越多，煙葉的品質(zhì)越佳[6-7]。所以，淀粉是影響烤煙品質(zhì)的重要因素之一。

淀粉酶作為一類促進淀粉水解的酶，左右著煙葉中淀粉含量的多少。淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、異淀粉酶等[8-9]，在煙葉生長、調(diào)制的過程中起著將淀粉水解成糖類供細胞代謝、化學(xué)成分的平衡調(diào)節(jié)等作用。在烤煙中，淀粉酶主要以α-淀粉酶、β-淀粉酶以及淀粉去分支酶的形式存在。本研究以四川主要栽培種紅花大金元和云煙87為材料，在攀枝花、涼山、瀘州、廣元駐點采樣，通過研究烤煙旺長期、現(xiàn)蕾期和成熟期淀粉分解的相關(guān)酶活性及其基因表達情況，系統(tǒng)分析四川不同產(chǎn)區(qū)煙葉淀粉分解相關(guān)酶活性及其基因表達規(guī)律，以探索烤煙淀粉酶及其基因分解代謝對于四川省不同煙區(qū)特色煙葉風(fēng)格的影響，為優(yōu)質(zhì)煙葉的生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)，為進一步優(yōu)化四川省烤煙風(fēng)格特色提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗點及試驗品種選取

四川烤煙全年出產(chǎn)約為19萬t，其中攀西地區(qū)生產(chǎn)煙葉12.5萬t。因此在試驗點的選取上，偏重于攀枝花和西昌地區(qū)。攀枝花地區(qū)選取米易、仁和兩個地區(qū)，涼山選取的3個點分別為冕寧、會理、西昌。川南和川北采集點選取瀘州古藺縣、廣元劍閣縣。本試驗所選品種為當(dāng)前四川烤煙的主推品種紅花大金元和云煙87，以H代表紅花大金元品種，Y代表云煙87品種；煙區(qū)地名中，JG為劍閣，GL為古藺，HL為會理，MY為米易，XC為西昌，MN為冕寧，RH為攀枝花仁和。

1.2 試驗材料采集

2013年、2014年2年在烤煙旺長期、現(xiàn)蕾期、成熟期的晴朗天氣上午采集各地區(qū)試驗田中長勢基本一致且無病蟲害的煙株，按“S”型取樣方法，選取30株采集中部煙葉（從下往上數(shù)第10片煙葉），每個地區(qū)每個品種采集3管煙葉，液氮速凍。2年共計在攀西煙區(qū)的西昌（XC）、會理（HL）、冕寧（MN）、仁和（RH）、米易（MY），川南煙區(qū)的古藺（GL），川北煙區(qū)的劍閣（JG）7個不同取樣點采集樣品252份，帶回實驗室分裝后凍存于-80℃冰箱，用于酶活性及基因表達水平測定。

1.3淀粉酶的提取和測定

稱取2 g煙葉，置研缽中加少許石英砂，磨成勻漿倒入25 mL刻度試管中，用蒸餾水定容，混勻室溫下放置，每隔5 min震蕩1次，放置20 min后離心，取上清液備用。

酶活性的測定：

1）取制備的酶液5 mL，放入100 mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，混勻。取4支試管，2支做對照，2支做測定，各加入稀釋酶液1 mL以及1 mL pH為5.6的檸檬酸緩沖液；對照管中加入4 mL 0.4 mol/L NaOH，以鈍化酶活性。將4支試管置于40℃恒溫水浴中保溫15 min，再分別向各管加入預(yù)熱（40℃）的淀粉溶液2 mL，搖勻，再保溫5 min取出，向另外2支測定管中分別加入4 mL 0.4 mol/L NaOH，終止酶活性。備用。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。

3）取2號、3號管中酶作用后的溶液以及對照管的溶液各2 mL，分別加入25 mL刻度試管中，再加入2 mL 3，5—二硝基水楊酸，置沸水浴煮沸5 min，冷卻，用蒸餾水定容至25 mL，混勻，在波長520 nm處測光密度值，從曲線中測出糖含量，用以表示酶活性。實驗重復(fù)3次。

1.4DBE活性的測定

參照文迪等的方法進行[10]，重復(fù)3次。酶活性以每分鐘生成1 mg還原性糖為活性單位（U）。提取酶粗液，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取100 μL酶粗提取液加入100 μL反應(yīng)液[MES-NaOH（pH=6.5） 50 mmol/L，5mg Amylopetin]，30℃保溫2 h，加入100 μL 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，取出迅速冷卻，定容至500 μL，加1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸[3.25 g 3，5-二硝基水楊酸（DNS）溶于水中，再加入2 mol/L NaOH 162.5 mL，再加入22.5 g丙三醇，搖勻后定容至500 mL，放入冰箱中待用]，混勻后沸水浴中5 min，540 nm比色測定還原糖量。

1.5Real-Time PCR檢測

煙草蔗糖代謝相關(guān)酶關(guān)鍵基因序列通過NCBI、EMBL、DDBJ查閱，利用軟件Primer 5.0通過相關(guān)序列設(shè)計特定引物，并檢測特異性。

根據(jù)北京天恩澤基因科技有限公司生產(chǎn)的Trizol伴侶試劑盒的說明書步驟提取RNA。

將提取到的煙草總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。以純化后的RNA為模板，根據(jù)Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行，反應(yīng)體系總體積為20 μL。

以檢測合格的cDNA產(chǎn)物為模板，以10倍比例稀釋原液，制作目的標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法對樣品中基因的表達量進行Real-Time PCR檢測，每個待測樣品設(shè)置3次重復(fù)，選用18S作為內(nèi)參基因。

1.6數(shù)據(jù)分析

酶活性數(shù)據(jù)、基因表達量數(shù)據(jù)使用Excel分析，相關(guān)酶活性多重比較使用SPSS軟件進行，多重比較結(jié)果采用LSD法。

2結(jié)果與分析

2.1引物設(shè)計

引物設(shè)計結(jié)果見表1。

2.2不同地區(qū)烤煙蔗糖和淀粉分解酶活性動態(tài)變化規(guī)律及其差異

2.2.1 淀粉酶

由圖1及表2可知，云煙87及紅花大金元淀粉酶活性變化趨勢是一致的，都呈現(xiàn)出旺長期、成熟期活性較高，現(xiàn)蕾期活性降低的態(tài)勢，但云煙87酶活性較紅花大金元酶活性高。四川各煙區(qū)中，劍閣和古藺酶活性各個時期都為最低。淀粉酶活性的大小能在一定程度上反映烤煙內(nèi)碳代謝的強弱。

2.2.2 淀粉去分支酶

結(jié)合淀粉去分支酶活性數(shù)據(jù)進行分析，從旺長期到成熟期，四川煙區(qū)淀粉去分支酶活性動態(tài)變化整體像是一條開口向下的拋物線，即旺長期、成熟期各地酶活性較高，現(xiàn)蕾期酶活性下降。其中，會理、冕寧酶活性較高，西昌、米易酶活性較低（見表3）。

2.3不同地區(qū)烤煙蔗糖和淀粉分解酶調(diào)控基因表達量動態(tài)變化規(guī)律及其差異

2.3.1 淀粉酶基因α-amylase表達變化

從表4可知，紅花大金元α-淀粉酶基因表達量變化趨勢同酶活性變化趨勢相同，旺長期、成熟期基因表達量高，現(xiàn)蕾期表達量較低，2013年、2014年2年基因變化規(guī)律相同。云煙87 α-淀粉酶基因在各煙區(qū)變化趨勢與紅花大金元相似，但各地基因表現(xiàn)不一，是生態(tài)條件各異所造成的。

2.3.2 淀粉酶基因β-amylase表達變化

從表5可知，紅花大金元β-淀粉酶基因在四川各地變化規(guī)律較為相似，旺長期、成熟期表達量高，現(xiàn)蕾期表達量較低，與淀粉酶活性變化趨勢一致。通過對比可知，四川各地β-淀粉酶基因表達量雖不一，但均遠高于各地α-淀粉酶基因表達量，因此我們推測紅花大金元β-淀粉酶基因在淀粉酶中起主導(dǎo)作用。同理，我們也可以推測云煙87 β-淀粉酶基因在淀粉酶中起主導(dǎo)作用。2013年、2014年2年基因表達變化規(guī)律相同。

2.3.3 淀粉去分支酶基因DBE表達變化

從表6可知，各地?zé)o論是紅花大金元還是云煙87，淀粉去分支酶調(diào)控基因變化趨勢較為一致，旺長期、成熟期表達量較高，現(xiàn)蕾期表達量較低。

2.4四川不同煙區(qū)相關(guān)分解酶活性變化規(guī)律及其差異

由表7可見，攀西煙區(qū)淀粉酶活性在各個時期均是最高，且與川南煙區(qū)、川北煙區(qū)的差異達到顯著，川北煙區(qū)與川南煙區(qū)相比差異較小。

由表8可見，烤煙旺長期、現(xiàn)蕾期時，川南煙區(qū)、川北煙區(qū)淀粉去分支酶活性強，且與攀西煙區(qū)差異顯著，進入成熟期后，川北煙區(qū)淀粉去分支酶活性仍保持在相對較高的酶活性水平上，而川南煙區(qū)、攀西煙區(qū)差異不顯著。

3結(jié)論與討論

3.1四川不同煙區(qū)淀粉分解酶類動態(tài)變化特征及其差異

淀粉是烤煙大田期間積累的最為重要的碳水化合物之一，淀粉酶活性影響煙葉淀粉的積累量，從而影響到煙葉的品質(zhì)。四川各地烤煙淀粉酶活性呈現(xiàn)出開口向下的拋物線趨勢，在大田生長初期，煙葉中淀粉的積累量較小，積累后也被迅速地分解用于植株的形態(tài)建成，因此淀粉酶活性較低。旺長期后，烤煙代謝旺盛，淀粉的合成分解速率加快，淀粉酶活性上升，淀粉被迅速分解用于植株代謝；進入現(xiàn)蕾期，烤煙由營養(yǎng)生長變成生殖生長，淀粉酶活性有所降低；打頂后，一方面烤煙繼續(xù)營養(yǎng)生長，此前煙葉體內(nèi)貯藏的大量淀粉進一步誘導(dǎo)了淀粉酶活性，另一方面，淀粉酶活性的上升能夠協(xié)調(diào)烤煙中化學(xué)成分的平衡，為各種香氣的合成提供前體，因此淀粉酶活性在成熟期時達到峰值。DBE催化支鏈淀粉中糖苷鍵的水解，因此DBE的活性高低可改變直鏈淀粉、支鏈淀粉的比例，而且還可改變支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)，形成分支程度不一的支鏈淀粉，有研究表明，烤煙中支鏈淀粉、直鏈淀粉比率的不同能影響烤煙烘烤的結(jié)果，我國烤煙烘烤后淀粉含量較高已經(jīng)成為制約卷煙品質(zhì)的重要因素，因此DBE活性的高低對于烤煙優(yōu)良品質(zhì)的形成有重要的影響。四川各地DBE基本呈現(xiàn)出先降后升的趨勢，DBE酶活性的動態(tài)變化與其功能相關(guān)，同淀粉酶活性的變化趨勢一致。

各煙區(qū)相比較，攀西煙區(qū)淀粉酶活性在不同時期活性最高，與川北、川南差異顯著，而其淀粉去分支酶活性則在三大煙區(qū)中最低。淀粉去分支酶活性較弱，各煙區(qū)差異相對較小，淀粉酶活性高，各煙區(qū)差異較大，可能是導(dǎo)致各煙區(qū)煙葉香型不同的因素。

3.2四川不同生態(tài)區(qū)淀粉分解酶類基因時空表達規(guī)律及其差異

淀粉酶包括α-淀粉酶、β-淀粉酶。α-淀粉酶屬于內(nèi)切酶，內(nèi)切酶能夠在淀粉分子內(nèi)部以任意方式執(zhí)行催化水解，α-淀粉酶能夠降解α-1，4-鏈，作用于直鏈淀粉時，將相應(yīng)淀粉降解成葡萄糖；當(dāng)作用于支鏈淀粉時，除降解生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖，還生成少量的極限糊精。β-淀粉酶屬于外切酶，外切酶在非還原型末端起作用，催化水解，在沒有支鏈的直鏈淀粉中，β-淀粉酶能夠?qū)⒌矸鄯种耆鉃槠咸烟呛望溠刻牵划?dāng)水解支鏈淀粉時，只能切斷α-1，6-糖苷鍵之前的反應(yīng)，因此會產(chǎn)生大量的極限糊精。在煙葉生長過程中，α-淀粉酶基因和β-淀粉酶基因表達趨勢基本一致，都呈現(xiàn)出先降后升的趨勢，與淀粉酶的趨勢基本一致，但后者的表達量較前者高出很多，因此可以推測β-淀粉酶基因起主要作用。DBE主要催化多糖鏈中a-1，6-糖苷鍵的水解，和淀粉酶協(xié)同一起分解煙葉中的淀粉[11]，在大田生長期間，DBE在煙草成熟期的基因表達量較高，旺長期、現(xiàn)蕾期較低。煙葉中淀粉的分解是幾種不同的酶相互協(xié)同作用的結(jié)果，共同調(diào)節(jié)烤煙中淀粉的分解代謝。

β-amylase基因表達量相對較高且煙區(qū)之間表達差異較為明顯，推測可能是導(dǎo)致各煙區(qū)香型不同的因素之一。

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