摘 要 2016年4月，從四川省南充市嘉陵區(qū)貓兒山垃圾填埋場采集土壤樣品，運用PCR-DGGE法鑒定垃圾填埋場的土壤細菌。結(jié)果表明：DGGE指紋圖譜中條帶數(shù)較少，比較之后選擇鑒定Band 1。將Band 1的測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的土壤細菌進行BLAST比對，序列相似性為84%，鑒定出Band 1所代表的不可培養(yǎng)細菌屬于酸桿菌門，并根據(jù)鑒定結(jié)果做出進化樹。

關(guān)鍵詞 PCR-DGGE；垃圾填埋場；鑒定；土壤細菌；酸桿菌

中圖分類號：Q939.96 文獻標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.28.011

知網(wǎng)出版網(wǎng)址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1186.S.20171011.1343.002.html 網(wǎng)絡(luò)出版時間：2017/10/11 13：43：26

隨著環(huán)境污染的日益加重，生活中所產(chǎn)生的垃圾降解問題也越來越引起人們的重視。近年來，無污染、耗能小且效率高的生物修復(fù)逐漸成為研究熱點。通過試驗來摸索微生物降解垃圾最優(yōu)的條件和關(guān)鍵影響因素，從而制備出高效微生物降解菌劑，使得環(huán)境垃圾的降解效果達到更好[1]。

1材料與方法

1.1材料與試劑

本研究所用土壤樣品于2016年4月采自四川省南充市嘉陵區(qū)貓兒山垃圾填埋場。選擇具有代表性的土壤采樣區(qū)，在采樣區(qū)內(nèi)按照上、中、下坡的地勢設(shè)置6個采樣點，采用五點取樣法采集土壤表層（0～10 cm）樣品，用無菌手套采完土樣后立即裝入已滅菌的封口聚乙烯袋，按1～6號順序編號后放入冰盒中保存。其中1， 2號為上坡土樣，3， 4號為中坡土樣，5， 6號為下坡土樣。采樣完成后立即運回實驗室，放入-80℃冰箱保存，用于后續(xù)土壤細菌的測定。土壤基因組DNA提取試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司；PCR擴增引物、PCR擴增酶和Molecular Probes SYBR? Green I 核酸凝膠染料均購于Thermo Scientific。

1.2試驗方法

1.2.1 土壤細菌總DNA提取

采用從北京天根生化科技有限公司購買的土壤基因組DNA提取試劑盒進行垃圾填埋場土壤細菌DNA的提取。

1.2.2 16S rDNA（V6～V8區(qū)）PCR擴增

本研究采用如下的細菌通用引物。

954f-GC：

5′-GCACAAGCGGTGGAGCATGTGG-3′；

1369r：

5′-GCCCGGGAACGTATTCACCG-3′。

下游試驗為DGGE電泳時，需要在上游引物954f的5′端加一段長度為40 bp的GC夾（CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCC）。反應(yīng)體系為50 μL： Mix 25 μL，前引物 1 μL，后引物 1 μL，模板DNA 2 μL，純水21 μL。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，61～56℃ 30 s，72℃ 1 min，10個循環(huán)，每個循環(huán)降低0.5℃；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，25個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃ forever[2]。PCR擴增結(jié)束后，采用0.8%瓊脂糖凝膠對所得的PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，電泳條件為120 V、30 min。

1.2.3 變性梯度凝膠電泳（DGGE）及圖像分析

采用DcodeTM Universal Mutation Detection System對PCR產(chǎn)物進行分離。DGGE所采用的聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性范圍為40%～60%，上樣量為每孔20 μL，60℃、85 V電泳11 h。電泳結(jié)束后，用經(jīng)超純水稀釋后的SYBR? Green I核酸凝膠染料（質(zhì)量比

10 000∶1）染色45 min。使用Chemi Doc XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進行拍照。

1.2.4 DGGE優(yōu)勢條帶測序分析

選取優(yōu)勢條帶并用無菌手術(shù)刀片切割下來，浸泡于50 μL超純水中，置于4℃冰箱充分浸泡凝膠直至DNA產(chǎn)物浸出。以1 μL浸提液作為模板再次進行PCR擴增，上游引物954f不含發(fā)夾結(jié)構(gòu)，下游引物1369r、PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件不變，擴增產(chǎn)物做DGGE電泳確認回收片段的正確性。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化回收試劑盒純化后與克隆載體相連接，送北京金諾銳杰基因科技有限公司進行雙向測序。將拼接后的測序結(jié)果在NCBI- Nucleotid BLAST中進行比對分析，找出與之同源性較高的序列。將16S rDNA序列上傳到 NCBI數(shù)據(jù)庫中，申請后得到登錄號為KY436035。

2結(jié)果與分析

2.1土壤樣品16S rDNA（V6～V8區(qū)）PCR擴增分析

土壤細菌的16S rDNA（V6～V8區(qū)）的擴增片段長度在500 bp左右（如圖1）。所得到的目的片段特異性好，無雜帶產(chǎn)生，能夠滿足下一步DGGE電泳的要求。

2.2DGGE圖譜及優(yōu)勢條帶測序分析

2.2.1 DGGE圖譜分析

DGGE圖譜中，泳道中的條帶即代表土壤中的細菌種類，亮暗差異則代表細菌數(shù)量的多少[2]。從圖2可以看出，DGGE指紋圖譜中條帶數(shù)較少，比較之后選擇鑒定Band 1。

2.2.2 DGGE優(yōu)勢條帶測序結(jié)果分析

將Band 1的測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的土壤細菌進行BLAST比對，序列相似性為84%，鑒定出Band 1所代表的不可培養(yǎng)細菌屬于酸桿菌門，并根據(jù)鑒定結(jié)果做出進化樹（見表1、圖3）。

3討論

吳昊等研究了活性污泥中微生物對生活垃圾的降解，結(jié)果表明：活性污泥中的微生物是降解生活垃圾的主體，它可以將生活垃圾中的復(fù)雜有機物降解為簡單的有機物，然后在一定的條件下，將簡單的有機物轉(zhuǎn)變成無機物，從而達到降解的目的[3]。酸桿菌廣泛存在于自然界，在許多生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[4]。此次檢測到貓兒山垃圾填埋場酸桿菌的存在，帶給我們一些信息。酸桿菌大多是嗜酸菌，所以其生存環(huán)境應(yīng)該是呈酸性的，說明該區(qū)域土壤呈酸性。目前國內(nèi)外基于酸桿菌門的研究很少，鮮有酸桿菌的專屬研究報告。建議進一步研究該垃圾填埋場的土壤中，除了酸桿菌以外還有何種微生物能夠起到降解生活垃圾的作用。

參考文獻：

[1]朱欣潔.落地原油污染土壤修復(fù)微生物菌劑開發(fā)研究[D].陜西西安：西安工程大學(xué)，2016.

[2]唐杰，徐青銳，王立明，等.若爾蓋高原濕地不同退化階段的土壤細菌群落多樣性[J].微生物學(xué)通報，2011，38（5）：677-686.

[3]吳昊，喬德陽，徐惠彬，等.活性污泥中微生物降解生活垃圾的探討[J].中國資源綜合利用，2007，25（10）：36-37.

[4]王春香，田寶玉，呂睿瑞，等.西雙版納地區(qū)熱帶雨林土壤酸桿菌群體結(jié)構(gòu)和多樣性分析[J].微生物學(xué)通報，2010，37（1）：24-29.

（責(zé)任編輯：丁志祥）