摘 要 建立離子色譜法測(cè)定發(fā)芽大豆中γ-氨基丁酸（GABA）含量的快速、簡(jiǎn)便分析方法。樣品用碳酸鈉-碳酸氫鈉2.4 mmol/L溶液提取后，過0.22 μm濾膜后進(jìn)行色譜分析。選用IonPac AS 18陰離子交換分析柱，IonPac AG 18陰離子保護(hù)柱，梯度洗脫的方式分離，過電導(dǎo)檢測(cè)器測(cè)定含量。該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高且結(jié)果可靠，獲得良好的加標(biāo)回收率，可用于快速測(cè)定發(fā)芽大豆中γ-氨基丁酸含量。

關(guān)鍵詞 離子色譜；發(fā)芽大豆；γ-氨基丁酸；GABA

中圖分類號(hào)：S565.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.28.031

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γ-氨基丁酸（GABA）廣泛分布在動(dòng)物和植物中，其具有很強(qiáng)的生物活性，是哺乳動(dòng)物的一種重要神經(jīng)遞質(zhì)[1]。有研究表明，GABA具有激活腦內(nèi)葡萄糖代謝、促進(jìn)乙酰膽堿合成、抗驚厥、降血壓、改善腦機(jī)能、神經(jīng)安定、促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌等多種生理功能[2]。富集GABA的方法研究較多，其中采用植物富集方法是普遍認(rèn)為最安全的方法，即控制植物的生長(zhǎng)環(huán)境，使之能夠最大限度地積累GABA。由于豆類中富含谷氨酸，在發(fā)芽過程中經(jīng)谷氨酸脫羧酶催化將轉(zhuǎn)化成GABA，使用發(fā)芽豆類富集GABA是研究的熱點(diǎn)[3]。

檢測(cè)GABA的方法有很多種，其中最常用的有比色法、高效液相色譜法、氨基酸分析儀法等。比色法具有一定局限性，容易受到樣品本身顏色的干擾；高效液相色譜法需要將樣品進(jìn)行衍生化處理，實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣且成本較高；氨基酸分析儀法對(duì)測(cè)定條件及樣品均有很高要求[4]。為此，以發(fā)芽大豆作為研究對(duì)象，采用離子色譜法，探討優(yōu)化樣品前處理方法以及色譜條件，旨在開發(fā)一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高且結(jié)果可靠的GABA檢測(cè)方法，為研究GABA在發(fā)芽大豆中的富集提供幫助。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

1）發(fā)芽大豆。選取3種不同生長(zhǎng)時(shí)期的發(fā)芽大豆作為研究對(duì)象，芽長(zhǎng)分別為1～3 cm，3～6 cm，6～10 cm。

2）γ-氨基丁酸。純度99.2 %，SIGMA-ALORICH，Lot：BCBT6565。

3）無(wú)水碳酸鈉。分析純?cè)噭?，?gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

4）碳酸氫。分析純?cè)噭?，?gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

5）超純水。電阻率為18.2 MΩ/cm，美國(guó)Millipore純水儀。

6）0.22 μm尼龍濾膜。購(gòu)于天津津騰公司。

7）ICS 5000離子色譜儀。購(gòu)于美國(guó)戴安公司。

8）EGC 500 OH-離子發(fā)生器。購(gòu)于美國(guó)戴安公司。

9）電導(dǎo)檢測(cè)器。購(gòu)于美國(guó)戴安公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：IonPac AS 18陰離子交換分析柱（250 mm×4 mm）；IonPac AG 18陰離子保護(hù)柱（50 mm×4 mm）；ASRS 400 型抑制器，自循環(huán)模式，抑制電流：100 mA；KOH濃度梯度：0～13 min，4 mmol·L-1；13.1～18 min，40 mmol·L-1；18 .1～23 min，4 mmol·L-1；流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量50 μL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及曲線繪制

稱取1.0056 g GABA標(biāo)準(zhǔn)品，定容至100 mL容量瓶，即濃度為10 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，稀釋配制標(biāo)準(zhǔn)成1000 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)使用液。配制標(biāo)準(zhǔn)曲線：取GABA標(biāo)準(zhǔn)液稀釋配制濃度分別是100 μg·mL-1、80 μg·mL-1、50 μg·mL-1、40 μg·mL-1、25 μg·mL-1、20 μg·mL-1。

1.2.3 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取粉碎后樣品約0.5 g于50 mL比色管中，用碳酸鈉-碳酸氫鈉2.4 mmol·L-1溶液定容至刻度，渦旋振蕩3 min，超聲提取30 min，溫度50℃，靜置30 min，在4℃條件下離心8000 r·min-1，20 min。取上清液，過0.22 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。

1.2.4 樣品凈化及分析測(cè)定

吸取樣品管中層液體，過0.22 μm水性樣品濾膜，棄去前3滴試液，以同樣方法上機(jī)測(cè)定樣品液，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。含量計(jì)算公式如下：

式中：X 為樣品中目標(biāo)物的含量（mg·kg-1）；Y為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品溶液中目標(biāo)物的濃度（μg·mL-1）；V為樣品溶液定容體積（mL）；m為樣品質(zhì)量（g）。

2結(jié)果與分析

2.1樣品前處理?xiàng)l件的選擇

樣品提取液的選擇，GABA其不溶于有機(jī)溶劑，易溶于水[5]，因此考慮采用水相試劑提取。且在加熱條件下GABA極易分解形成吡咯烷酮和水[3]，提取時(shí)不宜選擇過高的溫度。嚴(yán)聃[6]使用檸檬酸溶液在pH6.0時(shí)，50℃水浴提取4 h，提取米糠中的GABA得到較好提取效果；廖周華等[7]以水為提取介質(zhì)（pH7.0），溫度37℃、抽提6 h，提取麥麩中的GABA有較好效果；李炳坤等[8]采用碳酸鈉-碳酸氫鈉2.4 mmol/L溶液為介質(zhì)提取桑葉中的GABA取得較好結(jié)果。綜上，本文研究了不同提取介質(zhì)對(duì)于GABA的提取效果的影響。發(fā)現(xiàn)檸檬酸對(duì)于離子色譜基線有較大干擾，不適合于離子色譜法提取，碳酸鈉-碳酸氫鈉提取效果較好，詳見表1。

靜置時(shí)間的選擇，多數(shù)研究認(rèn)為[7-8]，在50℃時(shí)，為提取樣品中GABA的適宜溫度。對(duì)于提取時(shí)間則有較大分歧，因此本文參考50℃為提取溫度，研究了不同提取時(shí)間對(duì)于GABA提取效果的影響，結(jié)果見表2。

由結(jié)果分析可知，不同提取介質(zhì)對(duì)于提取發(fā)芽大豆中GABA的效率有較大影響，采用碳酸鈉-碳酸氫鈉為介質(zhì)提取GABA有較好效果。在相同溫度條件下，延長(zhǎng)靜置時(shí)間對(duì)于提取效率未見明顯改善。本研究增加了30 min超聲波提取，提取效率有明顯提高。

2.2色譜條件的選擇

比較了3種陰離子分析柱的分離效果。IonPac AS 16陰離子交換分析柱，是親水性較強(qiáng)的高容量柱，GABA在柱中的保留時(shí)間較短，低濃度洗脫時(shí)約6.00 min出峰，不能保證GABA能完全分離。IonPac AS 19陰離子交換分析柱，是高通量柱，GABA在其中有較長(zhǎng)的保留時(shí)間，但在GABA出峰前0.2 min處存在雜峰干擾，使之無(wú)法完全分離。因此，本研究最終選用IonPac AS 18陰離子交換分析柱，在4 mmol·L-1濃度OH-離子洗脫將目標(biāo)物分離，使用50 mmol·L-1的高濃度洗脫液沖洗色譜柱，可獲得平穩(wěn)基線和良好的峰形，如圖1所示。

2.3線性范圍

配制多個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行線性范圍分析，結(jié)果表明，在20～100 μg·mL-1時(shí)，各組分的濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系，以組分的質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積（μS×min）為縱坐標(biāo)，回歸方程為：y=0.006x+0.021，R2 = 0.998 6。

選擇濃度20 μg·mL-1準(zhǔn)品溶液，按“1.2.1”的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，GABA的儀器檢出限為0.07 μg·mL-1 （信噪比RSN=3），以0.5 g稱樣量計(jì)算方法檢出限為7 mg·kg-1。

2.4樣品分析及加標(biāo)回收率

選取具有代表性的3種不同芽長(zhǎng)的發(fā)芽大豆作為研究對(duì)象，芽長(zhǎng)分別為1～3 cm，3～6 cm，6～10 cm。在樣品中添加已知濃度的GABA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行樣品分析及加標(biāo)回收試驗(yàn)（n=6）。

如表3所示，樣品中的GABA，樣品加標(biāo)后回收率在89.46%～104.00%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在3.16%～8.11%。

由圖2可以看出，樣品的特征峰與標(biāo)準(zhǔn)品（圖1）出峰時(shí)間重合，分離度較好。由此可見，本方法穩(wěn)定可靠，準(zhǔn)確性高。

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了能夠快速測(cè)定發(fā)芽大豆中GABA的離子色譜方法。該法與其他方法相比，能夠有效節(jié)約檢測(cè)時(shí)間及檢測(cè)成本，分析速度快，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

參考文獻(xiàn)：

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（責(zé)任編輯：敬廷桃）