劉亞青李琦辛鳳袁永一

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科(南京 210008) 2解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100853）

·基礎(chǔ)研究·

遺傳性遠(yuǎn)端腎小管性酸中毒合并耳聾相關(guān)基因Atp6v0a4在小鼠內(nèi)耳發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)

劉亞青1,2李琦1辛鳳2袁永一2

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科(南京 210008) 2解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100853）

目的常染色體隱性遺傳遠(yuǎn)端腎小管酸中毒是一種嚴(yán)重的酸堿平衡紊亂性疾病,常常合并有感音神經(jīng)性聾,ATP6V0A4被證實(shí)是其致病的相關(guān)基因，目前仍不明確致病機(jī)制。我們擬通過(guò)研究Atp6v0a4在不同發(fā)育階段小鼠的內(nèi)耳表達(dá)來(lái)探究ATP6V0A4在聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)形成中的作用。方法 選擇不同發(fā)育時(shí)期健康的昆明小鼠(E18, P1,P7,P14,P21)，應(yīng)用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察Atp6v0a4蛋白在內(nèi)耳的定位與表達(dá)。West?ern-blot定性定量研究該蛋白在不同時(shí)期小鼠內(nèi)耳蛋白表達(dá)變化。結(jié)果 Atp6v0a4蛋白主要表達(dá)部位為耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞、外毛細(xì)胞、血管紋、內(nèi)淋巴囊以及螺旋神經(jīng)節(jié)，且在不同發(fā)育階段表達(dá)位置穩(wěn)定。Western-blot結(jié)果提示Atp6v0a4在小鼠內(nèi)耳廣泛表達(dá),在不同發(fā)育階段,Atp6v0a4在Corti’s器及螺旋神經(jīng)節(jié)及血管紋中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定,而在前庭組織中表達(dá)下降。結(jié)論 通過(guò)對(duì)不同發(fā)育階段的小鼠耳蝸切片進(jìn)行Atp6v0a4蛋白表達(dá)分析研究，明確了Atp6v0a4在小鼠內(nèi)耳的表達(dá)，為深入研究Atp6v0a4在內(nèi)耳發(fā)育過(guò)程中的作用和致聾機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

Atp6v0a4；表達(dá)定位；內(nèi)耳

Fund projects:The National Natural Science Foundation of China(81371098)；Project of Natural Science Foundation of Beijing (7132177);Jiangsu provincial key research and development of special funds(BE2015608);Science and education in Jiangsu province key medical personnel(RC2011028);Jiangsu Province,"the 333 high-level personnel training project"fund(2015);The peak of six talents in Jiangsu Province（2015-wsw-063）.

Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest.

耳聾是嚴(yán)重影響人類社會(huì)交流和生活質(zhì)量的常見(jiàn)疾病之一。早期耳聾可導(dǎo)致患兒言語(yǔ)功能發(fā)育障礙，為家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。遺傳性耳聾根據(jù)是否伴有聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)以外其他系統(tǒng)病變的臨床表現(xiàn)可分為兩大類，即綜合征性聾(Syndromic Hearing Loss，SHL)和非綜合征性聾(Nonsyndromic Hearing Loss,NSHL)，前者指除了耳聾以外，還同時(shí)存在眼、腎、骨、皮膚等其他部位的病變，此類耳聾約占遺傳性聾的30%；而后者則只出現(xiàn)耳聾的癥狀，無(wú)其他系統(tǒng)病變表現(xiàn)，在遺傳性聾中約占70%。遺傳性遠(yuǎn)端腎小管性酸中毒，即經(jīng)典型遠(yuǎn)端腎小管性酸中毒（經(jīng)典型RTA，distal renal tubular acidosis，dRTA)，該疾病因遠(yuǎn)端腎小管泌氫障礙，使得可滴定酸及尿NH4+排出減少，從而導(dǎo)致一系列的臨床表現(xiàn)，如高氯性代謝性酸中毒、低鉀低鈣血癥、尿液不能酸化等，遺傳性遠(yuǎn)端腎小管性酸中毒常合并有感音神經(jīng)性耳聾，ATP6V0A4被證實(shí)是其相關(guān)致病基因[1]，其致病機(jī)制尚不清楚。

本研究擬進(jìn)一步探究Atp6v0a4在小鼠耳蝸中的表達(dá)，及其在各個(gè)發(fā)育時(shí)期的小鼠耳蝸中表達(dá)的穩(wěn)定性，我們采用免疫熒光、免疫組化及West?ern-blot對(duì)不同發(fā)育階段的聽(tīng)力正常小鼠行蛋白表達(dá)分析，為后續(xù)的功能研究奠定基礎(chǔ)，并為臨床上早期dRTA合并感音神經(jīng)性聾患兒提供有效篩查診斷和積極干預(yù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

挑選40只健康且耳廓反應(yīng)靈敏的育齡昆明小鼠作為種鼠，公母比例為1:4，合籠后，早晚定點(diǎn)（早8點(diǎn)及晚17點(diǎn)）觀察母鼠陰栓，若有則記為0.5天（Embryo 0.5）。同樣挑選耳廓反應(yīng)靈敏的健康孕鼠，每日早晚定點(diǎn)觀察生產(chǎn)情況（早8點(diǎn)及晚17點(diǎn)），若生產(chǎn)，則記為0.5天（Postnatal 0.5）。分組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照日齡分組，每組五只，時(shí)間點(diǎn)分別為胚胎18天（Embryo 18，E18），出生后1天（Postna?tal 1），2天（P2），7天（P7），14天（P14），21天（P21）。（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）

1.2 標(biāo)本處理

按以上分組取小鼠，斷頭取耳蝸，解剖顯微鏡下快速去移除鐙骨并去除圓窗膜，用4%多聚甲醛在4℃冰箱固定至少24h，除E18耳蝸外，所有耳蝸組織均于10%EDTA中至完全脫鈣，置于搖床上的固定液內(nèi)洗樣兩次，每次至少10min，30%蔗糖溶液脫水后再次置于4℃冰箱過(guò)夜，蔗糖飽和3-5天，取出用OCT膠包埋過(guò)夜，顯微鏡下包埋，-20℃冰凍切片機(jī)切片，室溫靜置20min后置于切片盒，存儲(chǔ)于-80℃冰箱備用。

1.3免疫熒光染色

取出冰凍切片，室溫下靜置約30min，0.01M PBS洗5min，30%的山羊血清0.3%Triton X-100 PBS封閉通透30min；0.01M PBS洗10min，加入1: 150一抗（anti-ATP6V0A4，ab110752，abcam）37℃孵育40min，0.01M PBS洗片三次，每次5min；加入1:1000二抗（Alexa Flour 488，HPA028918，SIGMA）37℃孵育60min，0.01M PBS洗片三次，時(shí)間分別為5min，10min，60min；分別加入 1:150一抗（an?ti-MYO7A，HPA028918，SIGMA；anti-Neuroflia?ment，ab7795，abcam），37℃40min，PBS洗3遍，各5min；加入1:1000二抗（Alexa Flour 568，Alexa Flour 568，SIGMA），37℃1h；0.01M PBS洗片三次，5min，10min，60min；加入DAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚），室溫作用10min；0.01M PBS洗片一次5min；甘油封片，進(jìn)行共聚焦掃描成像。

1.4免疫組化

取出冰凍切片，室溫下靜置約30min，0.01M PBS洗片5min；加2%雙氧水于37℃下作用20min，0.01M PBS洗片3次，每次5min；30%羊血清+0.3% Triton于37℃封閉60min；加入1:150一抗（an?ti-ATP6V0A4），4℃冰箱過(guò)夜后取出，0.01M PBS洗3次，每次5min，加入生物素化二抗，37℃下30min，0.01M PBS洗4次，每次5min；DAB顯色5-10min，鏡下查看染色程度，輕柔流水沖洗10min；蘇木素復(fù)染1-5min流水沖洗15分鐘左右，梯度酒精脫水：80%酒精脫水2分鐘；95%酒精脫水2分鐘；100%酒精脫水2次，每次5分鐘；二甲苯透明：兩次各5分鐘；中性樹(shù)膠封片后鏡檢。

1.5 Western-blot

取不同發(fā)育階段的小鼠（P2，P7，P21）各十只，斷頭取出耳蝸，在解剖顯微鏡下去除耳蝸周圍結(jié)締組織，仔細(xì)分離耳蝸分別取基底膜、蝸軸、血管紋以及前庭組織。使用碧云天提取蛋白試劑盒提取組織蛋白：耳蝸組織置于1～2ml勻漿器中，用吹打槍頭將組織塊剪碎。加400 μ含PMSF的去污劑裂解液于勻漿器中進(jìn)行勻漿，冰上靜置10min，重復(fù)碾壓使組織盡量碾碎，裂解半小時(shí)后移至1.5ml離心管中，4℃12000rpm離心5min，取上清分裝并置于-20℃冰箱保存。BCA法行蛋白定量：BCA工作液=1:8，37℃30min，酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)讀取OD值。RIPA調(diào)整蛋白濃度，5×還原樣品緩沖液調(diào)整樣品的終濃度，煮沸變性5min。根據(jù)目的蛋白的分子量，配制分離膠，濃度分別為8%和12%，濃縮膠的濃度為5%，待檢蛋白20ug/孔上樣。電泳條件：濃縮膠恒壓90V 20min；分離膠恒壓160V。轉(zhuǎn)膜：300mA恒流，0.45um孔徑NC膜1.5h。封閉：3%BSA-TBST，室溫輕搖30min。

1)一抗孵育：3%BSA-TBST稀釋一抗室溫10min，放4℃冰箱過(guò)夜。

編號(hào)1一抗名稱ATP6V0A4稀釋比例1:4000稀釋后體積4ml

2)隔天從4℃冰箱取出，室溫30min。TBST洗5次，各3min。

3)二抗孵育：山羊抗兔IgG（H+L）（5%脫脂奶粉-TBST稀釋二抗），HRP 1:20000，室溫40min，TBST洗膜6次，各3min。

4)ECL加到膜上，作用3-5min，膠片曝光10s-5min，顯影2min，定影。

內(nèi)參蛋白WB實(shí)驗(yàn)：TBST洗膜3次，每次3min。后浸沒(méi)于5%脫脂奶粉-TBST中，室溫下作用30min；GAPDH鼠單抗，用5%脫脂奶粉-TBST稀釋抗體（1：20000），室溫孵育40min；TBST洗膜5次，各3min；山羊抗小鼠IgG（H+L）（5%脫脂奶粉-TBST稀釋）HRP，1:10000，室溫下作用40min。TBST洗膜5次，各3min。將ECL加到膜上，反應(yīng)3-5min，膠片曝光10s-5min，顯影2min，定影。

2 結(jié)果

2.1 我們采用免疫熒光法檢測(cè)了Atp6v0a4蛋白在小鼠內(nèi)耳發(fā)育過(guò)程中在耳蝸的定位以及表達(dá)情況。結(jié)果見(jiàn)圖1，通過(guò)對(duì)E18、P1、P7、P14及P21天昆明小鼠內(nèi)耳切片行免疫熒光染色，可以看到在昆明小鼠耳蝸多個(gè)部位，即Corti’s器的內(nèi)毛細(xì)胞、外毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)上，Atp6v0a4均有明顯表達(dá),在毛細(xì)胞上的熒光表達(dá)與毛細(xì)胞特異性染色抗體MYO7A的熒光重合,而在螺旋神經(jīng)節(jié)上的免疫熒光表達(dá)則與螺旋神經(jīng)節(jié)的特異性抗體Neurofila?ment的熒光表達(dá)位置重合。此外,該蛋白在血管紋、前庭的橢圓囊及球囊處可見(jiàn)表達(dá)。在不同發(fā)育階段的小鼠中,Atp6v0a4的表達(dá)位置較為恒定。

圖1 免疫熒光染色,Atp6v0a4蛋白在小鼠內(nèi)耳發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)與定位（E18,P1,P7,P14,P21）。(1)Corti’s器（×20倍）；(2)Corti’s器（×40倍）；(3)螺旋神經(jīng)節(jié)（×20倍)；(4)螺旋神經(jīng)節(jié)（×40倍）；（G）ATP6V0A4（R）MYO7A（1-2），Neu?rofliament（3-4）；（B）DAPI熒光染色-細(xì)胞核；（Y）整合圖Fig.1 Immunofluorescence staining,The expression and location of Atp6v0a4 in developing mouse inner ear（E18,P1, P7,P14,P21）.（1)）Corti's organ（×20times）;（2）Corti's organ（×40times）;（3）spiral ganglion neuron（×20times);(4)spiral ganglion neuron（×40times);（G）ATP6V0A4（R）MYO7A（1-2），Neurofliament（3-4）;（B）nuclear staining;（Y）synthetic map

2.2 通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶染色結(jié)果見(jiàn)圖2，Atp6v0a4在昆明小鼠耳蝸中的表達(dá)與上述免疫熒光法染色結(jié)果一致,即均表現(xiàn)為在小鼠耳蝸耳蝸Corti’s器的內(nèi)外毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)、血管紋及前庭淋巴囊存在表達(dá)。

圖2 免疫組化分析Atp6v0a4蛋白在小鼠耳蝸的表達(dá)與定位。耳蝸切片與ATP6V0A4一抗及相應(yīng)二抗結(jié)合，10倍光學(xué)顯微鏡下觀察。(上)耳蝸（×10倍）；(左下)Corti’s器（×40倍）；(右下）對(duì)照（×40倍）Fig.2 Immunohistochemical,he expression and location of Atp6v0a4 in developing mouse inner ear,Cochlear slices were reacted with the corresponding two antibodies of ATP6V0A4,Observation under optical microscope.(upper figure):cochlea（×10times）; (bottom-left figure):Corti's organ（×40times）;(bottom-right figure):contrast（×40times）

2.3我們通過(guò)提取不同發(fā)育階段昆明小鼠的內(nèi)耳前庭組織、耳蝸內(nèi)血管紋、Corti’s器基底膜、螺旋神經(jīng)節(jié)(取蝸軸)的蛋白進(jìn)行Western-blot定性并半定量分析了Atp6v0a4的表達(dá),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，實(shí)驗(yàn)成功檢測(cè)到了特異性陽(yáng)性條帶,結(jié)果顯示Atp6v0a4在內(nèi)耳前庭組織、耳蝸內(nèi)血管紋、Corti’s器基底膜、螺旋神經(jīng)節(jié)均有表達(dá),在昆明小鼠的不同發(fā)育時(shí)期，Corti’s器及螺旋神經(jīng)節(jié)中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定,P21小鼠前庭組織蛋白表達(dá)下降,P2小鼠血管紋蛋白表達(dá)相對(duì)較高，Atp6v0a4蛋白在血管紋及前庭組織在各個(gè)發(fā)育階段可能存在差異表達(dá)。

圖3 western-blot:目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白Western-blot膠片掃描顯影結(jié)果；（M）Corti’s器基底膜；（QT）前庭；（XG）血管紋；NG（螺旋神經(jīng)節(jié)）Fig.3 Western-blot:The imaging results of The target protein and reference protein.（M）basement membrane of Corti’s;（QT）vestibula;（XG）vasculars;（NG）spiral ganglion neuron

3 討論

遺傳性遠(yuǎn)端腎小管性酸中毒合并SNHL是一種具有遺傳異質(zhì)性的罕見(jiàn)的耳、腎共同發(fā)病的常染色體隱性遺傳綜合征，ATP6V0A4編碼V型質(zhì)子泵的a4亞基，是目前已知的疾病相關(guān)基因，ATP6V0A4突變患者多表現(xiàn)為遲發(fā)性感音神經(jīng)性耳聾[2]。目前對(duì)于ATP6V0A4在聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)中發(fā)揮作用的機(jī)制及其功能仍不明確。有學(xué)者認(rèn)為其致病機(jī)理可能為V-H+-ATPase功能的破壞，從而導(dǎo)致耳蝸內(nèi)淋巴的紊亂[3]。而內(nèi)淋巴的pH在維持正常聽(tīng)力中發(fā)揮重要作用[4]，它的維持有賴于H+ATPase以及Cl?–HCO3?交換，突變等因素引起它們功能的破壞，將會(huì)導(dǎo)致聽(tīng)力損失。為了進(jìn)一步探究ATP6V0A4在聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)發(fā)生中的作用。我們對(duì)不同發(fā)育階段的小鼠內(nèi)耳進(jìn)行了Atp6v0a4表達(dá)的研究，以明確Atp6v0a4在小鼠內(nèi)耳耳蝸中的表達(dá)。

囊泡型質(zhì)子泵V-ATPase是生物膜H+-ATPase一種類型，廣泛分布于原核即真核生物中，它可通過(guò)水解ATP，從而逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)H+[5]。分為兩類，即位于胞質(zhì)中水溶性的V1和疏水性的鑲嵌于膜上的V0，本研究中A4為其A亞基的一個(gè)亞型。ATP6V0A4位于7q34，一共有24個(gè)外顯子，由840個(gè)氨基酸組成，編碼V-H+-ATPase的a4亞基。已證實(shí)，骨質(zhì)疏松[6]和糖尿病[7]等許多疾病和V-ATPase的功能障礙相關(guān)。目前已知包括ATP6V1B1、ATP6V1B2、ATP6V0A4的突變可導(dǎo)致感音神經(jīng)性耳聾[3,8,9]。

為了明確Atp6v0a4蛋白在小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)，我們采用了毛細(xì)胞特異性抗體MYO7A及螺旋神經(jīng)節(jié)特異性抗體Neurofilament雙標(biāo)。實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)蛋白Atp6v0a4先行反應(yīng)，二抗清洗后再做MYO7A及Neurofilament的免疫組化。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們?cè)O(shè)置了陰性對(duì)照(所有一抗均用PBS稀釋的5%羊血清替代)。此外我們采用傳統(tǒng)的免疫組化法輔助驗(yàn)證免疫熒光的結(jié)果，顯示Atp6v0a4在不同發(fā)育階段小鼠內(nèi)耳Cor?ti’s器、螺旋神經(jīng)節(jié)穩(wěn)定表達(dá)。此外在血管紋及前庭淋巴囊等亦有表達(dá)，說(shuō)明Atp6v0a4可能參與維持內(nèi)耳的正常功能和內(nèi)耳環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，與聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的形成有關(guān)。我們根據(jù)免疫熒光的亮度可以初步判斷表達(dá)量，為進(jìn)一步探究各個(gè)階段蛋白表達(dá)的變化，我們還提取了P2、P7以及P21天的小鼠內(nèi)耳的蝸軸、基底膜、血管紋和前庭，通過(guò)Western-blot來(lái)定量研究Atp6v0a4蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示基底膜、蝸軸、血管紋以及前庭均有Atp6v0a4蛋白表達(dá)，在Cortis器及螺旋神經(jīng)節(jié)中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，P21小鼠前庭組織蛋白表達(dá)下降，P2小鼠血管紋蛋白表達(dá)相對(duì)較高，血管紋及前庭組織在各個(gè)發(fā)育階段可能存在差異表達(dá)。有研究顯示Atp6v0a4純合突變小鼠模型整個(gè)蝸管顯著擴(kuò)大，處于中階的Cortis器異常膨脹，耳蝸和內(nèi)淋巴管顯著擴(kuò)張[9]，結(jié)合本研究結(jié)果，Atp6v0a4除了在前庭內(nèi)淋巴囊有表達(dá)并發(fā)揮作用外，在耳蝸毛細(xì)胞、血管紋、及螺旋神經(jīng)節(jié)等聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路上可能也發(fā)揮重要作用。

Stover等提取成人內(nèi)耳組織，通過(guò)RT-PCR首次證實(shí)ATP6V0A4在人內(nèi)耳組織中的表達(dá)[3]。Eliz?abeth等研究了Atp6v0a4基因敲除小鼠，通過(guò)β-半乳糖苷酶標(biāo)記敲除的基因發(fā)現(xiàn)a4除了在預(yù)期的腎臟和內(nèi)耳有表達(dá)外，在骨、鼻、眼以及皮膚等組織也有表達(dá)。Beatriz通過(guò)免疫化學(xué)方法提示了Atp6v0a4在前庭內(nèi)淋巴囊上皮細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)[10]，這和我們提取小鼠前庭組織的Western-blot結(jié)果以及免疫熒光結(jié)果相一致。耳蝸內(nèi)血管紋不僅是高代謝組織，而且具有分泌和吸收內(nèi)淋巴液電解質(zhì)的功能，對(duì)耳蝸內(nèi)電位的產(chǎn)生具有重要的作用。耳蝸毛細(xì)胞含有豐富的溶酶體，而V-H+-ATPase廣泛存在于溶酶體膜表面，通過(guò)水解ATP將質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體內(nèi)，以維持其酸性環(huán)境，PH的變化可能會(huì)影響其他離子的通透平衡，近年大量研究發(fā)現(xiàn)，很多造成溶酶體失穩(wěn)的因素可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[3，11]。有研究顯示Atp6v0a4和耳聾相關(guān)基因Foxi1以及Pds有作用關(guān)系。Foxi1是和a4啟動(dòng)子序列相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)a4在內(nèi)耳的表達(dá)，但a4突變不影響Foxi1的表達(dá)，表明a4可能是Foxi1的下游靶點(diǎn)[2]。在Atp6v0a4-/-基因敲除小鼠模型的內(nèi)淋巴囊均有Foxi1以及Pds的強(qiáng)表達(dá)，且Kcnj10 and Kcnq1(分別在血管紋中間細(xì)胞及邊緣細(xì)胞表達(dá))，即參與耳蝸內(nèi)電位形成的主要鉀離子通道在Atp6v0a4-/-小鼠強(qiáng)表達(dá)，我們的研究和以上諸多研究均提示Atp6v0a4可能參與其他基因的協(xié)同調(diào)控，但是對(duì)于其突變引起的耳蝸內(nèi)電位降低或消失發(fā)生的機(jī)制卻依然不清楚。

為了研究ATP6V0A4在內(nèi)耳的功能，有學(xué)者建立了Atp6v0a4-/-基因敲除小鼠模型，該模型表現(xiàn)出了與以上所述的dRTA患者V-H+-ATPase功能缺失相同的臨床表現(xiàn)，但它們之間也有差異性表現(xiàn)，如該模型動(dòng)物早期即出現(xiàn)嚴(yán)重的聽(tīng)力障礙，且比臨床上絕大多數(shù)病人嚴(yán)重。該研究亦顯示，a4早期表達(dá)的減弱可能會(huì)導(dǎo)致Atp6v0a4-/-基因敲除小鼠的內(nèi)耳解剖及功能破壞[12]。而在純合突變模型小鼠即Atp6v0a4-/-基因敲除小鼠的聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能的研究方面，聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)閾值顯著升高，提示嚴(yán)重的聽(tīng)力損害，而雜合子的閾值則是正常的。涂料填充內(nèi)耳胚胎顯示Atp6v0a4-/-小鼠耳蝸和內(nèi)淋巴管顯著擴(kuò)張[10]，這與臨床上部分dRTA合并感音神經(jīng)性聾的患者內(nèi)耳影像學(xué)相一致。然而該動(dòng)物模型早期即出現(xiàn)聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)功能障礙，這與多數(shù)患者臨床表現(xiàn)卻不相符，有待進(jìn)一步探討。

ATP6V1B1和ATP6V0A4均是傳性遠(yuǎn)端腎小管合并感音神經(jīng)性聾的疾病相關(guān)基因，相關(guān)病例報(bào)告顯示，在檢出率上，ATP6VIB1顯著高于ATP6V0A4，兩者存在聽(tīng)力表型差異[13]。ATP6V1B1突變致感音神經(jīng)性耳聾多出現(xiàn)在早期(10歲以前)，而ATP6V0A4多表現(xiàn)為遲發(fā)性感音神經(jīng)性耳聾（10歲以后甚至成年），即ATP6VIB1基因突變患者多表現(xiàn)為早發(fā)性感音神經(jīng)性耳聾，而后者大多數(shù)表現(xiàn)為聽(tīng)力正常[2]。有學(xué)者構(gòu)建了一個(gè)Atp6v1b1-/-小鼠模型，并沒(méi)有觀察到自發(fā)性酸中毒[14]，這與ATP6V0A4-/-小鼠模型完全不同，考慮可能為早期胚胎發(fā)生補(bǔ)償機(jī)制，比如b2亞基對(duì)于b1亞基的補(bǔ)償作用大于其他a亞基對(duì)a4亞基的作用，使得小鼠模型研究中相關(guān)臨床表現(xiàn)不明顯。未來(lái)可進(jìn)一步研究?jī)?nèi)耳atp6v1b1的表達(dá)及a4亞基與b1亞基之間的相互作用。

我們的研究明確了Atp6v0a4編碼的蛋白在昆明小鼠內(nèi)耳中的表達(dá)定位，以及在小鼠內(nèi)耳發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步探討ATP6V0A4在聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 Karet FE,Finberg KE,Nelson RD et al.Mutations in the gene en?coding B1 subunit of H+-ATPase cause renal tubular acidosis with sensorineural deafness.Nat Genet 1999;21:84–90.

2 Vidarsson,H.,Westergren,R.,Heglind,M et al.The forkhead transcription factor Foxi1 is a master regulator of vacuolar H-ATPase proton pump subunits in the inner ear,kidney and epi?didymis.2009 PLoS ONE 4,e4471.

3 Stover EH,Borthwick KJ,Bavalia C et al.Novel ATP6V1B1 and ATP6V0A4 mutations in autosomal recessive distal renal tubular acidosis with new evidence for hearing loss.J Med Genet 2002; 39:796–803.

4 Lang F,Vallon V,Knipper M et al.Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. Am JPhysiol Cell Physiol 2007;293:C1187–C1208.

5 Kawasaki·Nishi S，Nishi T，F(xiàn)orgac M．Proton translocation driv?en by ATP hydrolysis in V·ATPases.FEBS Lett,2003.545:76.85.

6 Yao G,Feng H,Cai Y et al.Characterization of vacuolar-ATPase and selective inhibition of vacuolar-H(+)-ATPase in osteoclasts. Biochem.Biophys.Res.Commun.2007,15;357(4):821-827.

7 Rojas JD,Sennoune SR,Martinez GM et al.Plasmalemmal vacuo?lar H+-ATPase is decreased in microvascular endothelial cells from a diabetic model.J.Cell.Physiol.2004,201(2):190-200.

8 Yuan Y,Zhang J,Chang Q et al..De novo mutation in ATP6V1B2 impairs lysosome acidification and causes dominant deafness-ony?chodystrophy syndrome.Cell Research,2014,24(6):1370–1373.

9 Rybak LP,Whitworth CA.Ototoxicity:therapeutic opportunities. Drug Discov Today 10:1313–1321,2005.

10 Beatriz Lorente-Canovas B,Ingham N,Norgett EE et al.Mice de?ficient in H+-ATPase a4 subunit have severe hearing impairment associated with enlarged endolymphatic compartments within the inner ear.Dis Model Mech.2013,6(2):434-42.

11 Vargas-Poussou,R.,Houillier,P.,Le Pottier,N.et al.Genetic in?vestigation of autosomal recessive distal renal tubular acidosis:ev?idence for early sensorineural hearing loss associated with muta?tions in the ATP6V0A4 gene.J.Am.Soc.Nephrol.2006,17, 1437-1443.

12 Norgett EE,Golder ZJ,Lorente-Cánovas B et al..Atp6v0a4 knock out mouse is a model of distal renal tubular acidosis with hearing loss,with additional extrarenal phenotype.Proc Natl Acad Sci U S A.2012 Aug21;109(34):13775-80.

13 Antunes F,Cadenas E,Brunk UT.Apoptosis induced by exposure?to a low steady-state concentration of H2O2 is a consequence of lysosomal rupture.Biochem J,2001,356(2):549-555.

14 Dou H,Finberg K,Cardell EL et al.Mice lacking the B1 subunit of H+-ATPase have normal hearing.Hear Res 2003，180:76–84.

The expression of a combined distal renal tubular acidosis（dRTA）-deafness related geneATP6V0A4 in developing inner ears of the mice

LIU Yaqing1,2,LI Qi1,XIN Feng2,YUAN Yongyi2
1.Department of Otolaryngology,Head&Neck Surgery,Children,s hospital affiliated to Nanjing medical University 2.Department of Otolaryngology,Head&Neck Surgery,Chinese PLA General Hospital Corresponding author:YUAN Yongyi Email:yyymzh@163.com

Objective Autosomal recessive distal renal tubular acidosis(dRTA),a severe disorder of acid–base homeostasis,is often accompanied by sensorineural deafness.The ATP6V0A4 is considered as the causative gene;however,it is unknown how this gene causes the diseases.This study aims to investigate the expression of ATP6V0A4 in the mice inner ear at different stages of development.Methods Kunming mice at different developmental stages(Embryo 18,Postnatal 1,Postnatal 7,Postnatal 14,Postnatal 21)were used.The expression of Atp6v0a4 in the mice inner ear was analyzed using combined techniques of immunohistochemistry and immunofluorescence under confocal laser scanning microscopy.In addition,western-blot was used to analyze the expression of Atp6v0a4 quantitatively and qualitatively in mice inner ear.Results Atp6v0a4 was steadily expressed in the inner and outer hair cells,stria vascularis,spiral ganglion,and endolymphatic sac during the inner ear development,as shown by confocal laser scanning microscopy. The western-blot showed that the expression of Atp6v0a4 is relatively stable in the organ of Corti,spiral ganglion,andstria vascularis,while the expression of Atp6v0a4 in vestibule decreased during inner ear development.Conclusions Expression and localization of Atp6v0a4 in the mice inner ear at different developmental stages are demonstrated.This study may pave the way for further investigation in theAtp6v0a4 related deafness mechanisms.

Atp6v0a4；Expression and localization；Inner ear

R764

A

1672-2922（2017）01-88-6

2016-09-28審核人：郭維維）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.01.018

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81371098）；北京市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（7132177）；江蘇省省級(jí)重點(diǎn)研發(fā)專項(xiàng)資金（BE2015608)；江蘇省科教興衛(wèi)重點(diǎn)醫(yī)學(xué)人才（RC2011028）；江蘇省“333高層次人才培養(yǎng)工程”基金（2015）；江蘇省六大人才高峰（2015-wsw-063）聯(lián)合資助

劉亞青，碩士，住院醫(yī)師，研究方向:感音神經(jīng)性耳聾

劉亞青和李琦為并列第一作者

袁永一，Email:yyymzh@163.com