何 堅(jiān)，梁 杰，羅慶祿△，柳維林，林如輝，5

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福州 350122;2.福建省運(yùn)動(dòng)功能康復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350003;3.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福州 350003;4.福州市第二醫(yī)院康復(fù)科，福州 350007;5.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福州 350122)

復(fù)方三七消痛軟膏超聲導(dǎo)入對(duì)兔膝骨性關(guān)節(jié)炎治療作用及機(jī)制研究?

何 堅(jiān)1，2，3，梁 杰4，羅慶祿1，2，3△，柳維林1，2，林如輝4，5

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福州 350122;2.福建省運(yùn)動(dòng)功能康復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350003;3.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福州 350003;4.福州市第二醫(yī)院康復(fù)科，福州 350007;5.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福州 350122)

目的:探討復(fù)方三七消痛軟膏用超聲波(US)導(dǎo)入對(duì)兔KOA療效及其作用機(jī)制。方法:將4月齡新西蘭大白兔40只按隨機(jī)數(shù)字表法分為復(fù)方三七消痛軟膏超聲波導(dǎo)入組(A組)、普通US組(B組)、舒筋止痛水外擦組(C組)、假US組(D組)和正常對(duì)照組(E組)各8只，除E組外各組動(dòng)物均行雙側(cè)前交叉韌帶離斷術(shù)造模。6周后A、B、C、D組分別給予復(fù)方三七消痛軟膏超聲波導(dǎo)入普通US、假US、舒筋止痛水外擦干預(yù)10 d，E組不給予任何干預(yù)。干預(yù)后軟骨切片HE染色光鏡觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)及Mankin評(píng)分;采用TUNEL法檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡陽(yáng)性比率;采用TUNEL法檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡陽(yáng)性率，Western－blot技術(shù)檢測(cè)軟骨細(xì)胞caspase－9、caspase－3蛋白水平表達(dá)。結(jié)果:A組關(guān)節(jié)軟骨病變明顯輕于B、C、D組但較E組嚴(yán)重;A組Mankin評(píng)分低于B、C、D組、高于E組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。干預(yù)后A組軟骨細(xì)胞凋亡陽(yáng)性率以及caspase－9和caspase－3蛋白表達(dá)均低于B、C、D組，高于E組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:復(fù)方三七消痛軟膏超聲波導(dǎo)入能更好地延緩KOA軟骨退變，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制caspase－9和caspase－3表達(dá)從而抑制軟骨細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)。

骨性關(guān)節(jié)炎;超聲波;藥物導(dǎo)入;軟骨;caspase

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)橹饕±硖卣鞯某Ｒ?jiàn)骨關(guān)節(jié)疾病，雖然其治療方法頗多，但不少方法(如口服氨基糖甙類(lèi)藥物、注射透明質(zhì)酸鈉、針灸、推拿)均缺乏循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。雖然非甾體類(lèi)藥物治療OA的應(yīng)用具有A級(jí)證據(jù)，但其無(wú)法改變或延緩其軟骨病理改變。國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)，口服或外用中藥和超聲波(Ultrasound，US)治療KOA均有較好療效且均無(wú)明顯副作用特點(diǎn)［1－2］。國(guó)內(nèi)外有報(bào)道［3－4］，用US導(dǎo)入中藥或西藥較之單純US治療KOA更有效，且可避免口服藥物依從性差的問(wèn)題。我院院內(nèi)制劑舒筋止痛水外擦結(jié)合拍打或相同藥物制成的復(fù)方三七消痛軟膏外擦，在治療不同部位OA方面均有良好的臨床效果。筆者研究發(fā)現(xiàn)，舒筋活血止痛水外擦拍打能降低兔KOA軟骨組織MMP－1表達(dá)［5］，但其具體機(jī)制還不十分明確。現(xiàn)代研究表明，OA的發(fā)生發(fā)展與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，而caspase－9和caspase－3分別是細(xì)胞凋亡早期和后期的信號(hào)分子。因此，我們研究復(fù)方三七消痛軟膏US導(dǎo)入對(duì)兔KOA軟骨形態(tài)、軟骨細(xì)胞凋亡陽(yáng)性表達(dá)和凋亡基因caspase－9、caspase－3蛋白含量測(cè)定的影響，明確復(fù)方三七消痛軟膏US導(dǎo)入治療KOA的更優(yōu)療效并探討其可能的分子細(xì)胞學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康普通級(jí)4月齡新西蘭大白兔40只(雌雄各半)，體質(zhì)量(2.5±0.5)kg，由福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)(合格證號(hào)SCXK(上海)20120011)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑 蛋白裂解液(碧云天P0013B)、BCA試劑盒(Thermo，MK164229)、分離膠(碧云天 P0012A)、轉(zhuǎn)移緩沖液(碧云天PA196400)、TUNEL檢測(cè)試劑盒(美國(guó)羅氏公司TUN11684817)、10%脫脂奶粉(BBI life science，B805BA0003)、PBST(上海樊克生物生物科技有限公司FK－RS2426)、Caspase－9和Caspase－3單克隆抗體(一抗，上海容創(chuàng)生物技術(shù)有限公司RCL0245)各若干瓶、辣根酶系列二抗(上海容創(chuàng)生物技術(shù)有限公司RCL0248)、顯影液(碧云天P0018);復(fù)方三七消痛軟膏(批件號(hào)閩2012S0002，批準(zhǔn)文號(hào)閩制藥Z20120002，由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院提供);無(wú)水乙醇(西隴化工股份有限公司，15031402)，蘇木素、伊紅染液(索萊寶20150407);防脫載玻片(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司16020)，包埋機(jī)(孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司20080172)，萊卡切片機(jī)(德國(guó)徠卡儀器有限公司20130215)，烤片機(jī) (上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠20121953)，電子顯微鏡(德國(guó)徠卡儀器有限公司20130216)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 根據(jù)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件編程并按隨機(jī)數(shù)字表法將40只新西蘭大白兔分為復(fù)方三七消痛軟膏US導(dǎo)入組(A組)、普通US組(B 組)、舒筋止痛水外擦組(C組)、假US組(D組)和正常對(duì)照組(E組)5組各8只。

1.2.2 兔KOA模型建立 各組動(dòng)物在同等條件下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)1周后除E組外均行右側(cè)ACTL切斷術(shù)。手術(shù)參照Batist等［6］報(bào)道手術(shù)方法。術(shù)后不固定，允許籠內(nèi)自由活動(dòng)。并按每天15 mg/kg的劑量肌注慶大霉素(80 mg/2 ml)預(yù)防感染，連用5 d。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，基礎(chǔ)飼料為標(biāo)準(zhǔn)顆粒，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，所有工作均在遵循中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物道德委員會(huì)關(guān)于動(dòng)物保護(hù)和相關(guān)法規(guī)的指導(dǎo)方針下進(jìn)行。

1.2.3 干預(yù)方法 造模6周后，A、B、C、D 4組兔分別固定于兔手術(shù)臺(tái)，脫去雙側(cè)膝關(guān)節(jié)處毛。其中A、B、D 3組兔采用同一型號(hào)(日本伊藤公司生產(chǎn)的us－700型)、同一參數(shù)(強(qiáng)度300 mW/cm2、通斷比為20%、頻率為3 MHz;聲頭直徑1 cm;每次10 min，每天1次，連續(xù)5 d為1個(gè)療程，停2 d再行下1個(gè)療程，共2個(gè)療程)的US儀，經(jīng)水囊接觸法，分別導(dǎo)入復(fù)方三七消痛軟膏、普通耦合劑和普通耦合劑假US(只移動(dòng)聲頭，不開(kāi)啟強(qiáng)度開(kāi)關(guān)干預(yù))。C組去除雙膝關(guān)節(jié)周?chē)l(fā)，均勻涂上舒筋活血止痛水外擦劑，在膝關(guān)節(jié)周?chē)檬持浮⒅兄负铜h(huán)指第二指節(jié)掌面輕微拍打涂有舒筋活血止痛水處，以使藥水充分吸收，但不使動(dòng)物有驚恐感為度，治療參數(shù)同A、B、D組，E組按正常飼養(yǎng)，不給予任何干預(yù)。

1.3 干預(yù)后軟骨形態(tài)學(xué)、軟骨細(xì)胞凋亡及凋亡基因Caspase蛋白表達(dá)檢測(cè)

1.3.1 干預(yù)后軟骨形態(tài)光鏡觀察及HE染色Mankin評(píng)分 干預(yù)結(jié)束后空氣栓塞法處死，將雙側(cè)膝關(guān)節(jié)分離，用咬骨鉗離斷股骨髁，用40 g/L中性甲醛緩沖液固定1～2 d，脫鈣、修塊、系列乙醇脫水、透明、浸蠟、包埋及修塊。切片、裱片、烤片后，對(duì)股骨內(nèi)側(cè)髁進(jìn)行縱切，切片厚度為5 μm，用于形態(tài)學(xué)觀察。蘇木精－伊紅染色(HE染色)，光學(xué)顯微鏡觀察，按改良Mankin［7］進(jìn)行評(píng)分:正常關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本(0分):表層光滑、平整，軟骨細(xì)胞分布均勻，無(wú)簇聚軟骨細(xì)胞，潮線(xiàn)完整，染色均勻，無(wú)失染現(xiàn)象;輕度骨關(guān)節(jié)炎標(biāo)本(2～7分):表層略不平整，有小裂隙，中深層有少量簇聚的軟骨細(xì)胞和單個(gè)肥大軟骨細(xì)胞，某些標(biāo)本潮線(xiàn)斷裂或出現(xiàn)雙重潮線(xiàn)，染色有失染現(xiàn)象;中度骨關(guān)節(jié)炎標(biāo)本(8～12分):表層不平整，有裂隙深達(dá)中、深層，部分標(biāo)本表層或中層有原纖維變，中、深層細(xì)胞排列紊亂，有大量簇聚軟骨細(xì)胞，潮線(xiàn)斷裂或出現(xiàn)雙重潮線(xiàn)，染色不均勻，表層和中、深層有失染現(xiàn)象;重度骨關(guān)節(jié)炎標(biāo)本(13～14分)表層變薄有深至軟骨下骨的裂隙，細(xì)胞排列紊亂，有大量簇聚軟骨細(xì)胞，潮線(xiàn)消失，染色不均勻，全層有明顯失染。

1.3.2 干預(yù)后軟骨細(xì)胞凋亡陽(yáng)性表達(dá)檢測(cè)同HE染色法制取軟骨標(biāo)本切片，采用TUNEL免疫熒光法測(cè)定軟骨細(xì)胞凋亡細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)。按說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡率，石蠟包埋切片干燥后脫蠟固定;室溫下無(wú)水乙醇洗滌，依次用梯度乙醇水化，85%NaCl洗滌，PBS洗滌1次;4%多聚甲醛固定，PBS洗滌2次，滴加100 μl新鮮配制的蛋白酶K溶液，孵育10 min;PBS液清洗，用4%多聚甲醛固定，用PBS洗滌1次;滴加100 μl平衡溶液平衡10 min，避光冰水上制備rTdT孵育緩沖液;滴加上述配制的rTdT孵育緩沖液并覆蓋組織塊;37℃孵育箱中孵育60 min，蒸餾水稀釋?zhuān)瑢⒉Ｆ萦贑optin管中，15 min后終止反應(yīng)，用PBS洗滌，滴加1 μg/ml 的PI，避光染色15 min;PBS洗滌，梯度酒精脫水，熒光顯微鏡觀察下結(jié)果。暗室內(nèi)熒光顯微鏡在波長(zhǎng)520 nm下觀察熒光素的綠色熒光，在波長(zhǎng)620 nm條件下觀察PI的紅色熒光，迭加后紅色背景下的顯示黃色、淡黃色、黃綠色、綠色細(xì)胞即為凋亡的軟骨細(xì)胞。熒光顯微鏡觀察下結(jié)果，暗室內(nèi)熒光顯微鏡在波長(zhǎng)520 nm下觀察熒光素的綠色熒光，在波長(zhǎng)620 nm條件下觀察PI的紅色熒光，迭加后紅色背景下的顯示黃色、淡黃色、黃綠色、綠色細(xì)胞即為凋亡的軟骨細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)3個(gè)視野下細(xì)胞凋亡率(凋亡細(xì)胞數(shù)/軟骨細(xì)胞總數(shù))，即凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)。

1.3.3 干預(yù)后軟骨細(xì)胞Caspase－9、Caspase－3蛋白表達(dá)檢測(cè) 手術(shù)刀切取雙側(cè)脛骨平臺(tái)全層軟骨，生理鹽水沖洗，置管于－70℃液氮罐中保存，用Western－blot方法測(cè)定Caspase蛋白表達(dá)。將組織放入碾缽中加入液氮進(jìn)行碾磨，直至成為細(xì)小粉末為止，將粉末收集在一定量的蛋白裂解液中(裂解液以1∶5的體積比混合，冰上勻漿;加入300 μl的蛋白裂解液提取總蛋白，加變性緩沖液煮沸10 min變性。SDS－PAGE凝膠電泳，200 mA濕轉(zhuǎn)2 h。5%脫脂奶粉室溫封閉膜2 h，分別用caspase－9和caspase－3一抗(1∶100)4℃孵育過(guò)夜，TBS漂洗，ECL光化學(xué)法顯色。內(nèi)參GADPH蛋白測(cè)定顯示，除一抗為抗GADPH抗體外，余步驟同前，并使用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料Mankin評(píng)分、Caspase蛋白表達(dá)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析，多重比較用SNK－q檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)后各組軟骨形態(tài)學(xué)比較

圖1顯示，HE染色觀察比較，A組軟骨輕度變性，軟骨表層結(jié)構(gòu)稍疏松，細(xì)胞外基質(zhì)輕度降解;B組和C組軟骨中度變性，細(xì)胞外基質(zhì)輕度降解，表面欠光滑;D組軟骨重度變性，軟骨細(xì)胞出現(xiàn)集簇現(xiàn)象，軟骨表面粗糙，細(xì)胞外基質(zhì)重度降解，關(guān)節(jié)軟骨裂隙增大;E組形態(tài)學(xué)表層細(xì)胞數(shù)稍減少，但軟骨細(xì)胞排列基本整齊，無(wú)明顯軟骨基質(zhì)降解。表1顯示，Mankin評(píng)分比較，A、B、C、D組均著高于E組(P＜0.05或P＜0.01)，A、B、C組均顯著低于D組(P＜0.05或P＜0.01)，A組顯著低于 B、C2組(P＜0.051)。

圖1 干預(yù)10 d后各組股骨髁軟骨切片HE染色觀察比較(×400倍)

表1 干預(yù)后股骨髁軟骨切片HE染色光鏡觀察Mankin評(píng)分比較(±s)

表1 干預(yù)后股骨髁軟骨切片HE染色光鏡觀察Mankin評(píng)分比較(±s)

注:與正常組比較:*P＜0.01;與模型組比較:#P＜0.01或 P＜0.05;與單純超聲組藥物拍打組比較:★P＜0.05

組別 Mankin 分值A(chǔ)組 3.88±1.25*#★1.37±0.52 B組 4.45±1.28*#C組 5.37±1.60*#D組 6.75±2.25*E組

2.2 干預(yù)后各組軟骨細(xì)胞凋亡陽(yáng)性率表達(dá)結(jié)果比較

表2圖2顯示，軟骨細(xì)胞凋亡率A、B、C、D組均顯著高于E組(P＜0.05或P＜0.01)，A、B、C組均顯著低于D組(P＜0.05或P＜0.01)，A組顯著低于B、C2組(P＜0.05)。Caspase－3蛋白表達(dá)A、B、C、D組均著高于E組(P＜0.05或P＜0.01)，A、B、C組均顯著低于D組(P＜0.05)，A組顯著低于B、C2組(P＜0.05)。

2.3 干預(yù)后Western－blot檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞凋亡基因caspase－9、caspase－3蛋白表達(dá)結(jié)果比較

表2圖2顯示，Caspase－9蛋白表達(dá)A、B、C、D組均著高于E組(P＜0.05或P＜0.01)，A、B、C組均顯著低于D組(P＜0.05或P＜0.01)，A組顯著低于B、C2組(P＜0.05)。Caspase－3蛋白表達(dá)A、B、C、D組均著高于E組(P＜0.05或P＜0.01)，A、B、C組均顯著低于D組(P＜0.05)，A組顯著低于B、C2組(P＜0.05)顯示。

圖2 各組軟度細(xì)胞凋亡陽(yáng)性表達(dá)比較

圖3 各組軟度細(xì)胞caspase-9、caspase-3蛋白含量Western-blot印跡表達(dá)比較

表2 各組軟骨細(xì)胞凋亡率及Caspase-9、Caspase-3蛋白表達(dá)值比較(±s)

表2 各組軟骨細(xì)胞凋亡率及Caspase-9、Caspase-3蛋白表達(dá)值比較(±s)

注:與正常組比較:*P＜0.01;與模型組比較:#P＜0.01或 P＜0.05;與單純超聲組藥物拍打組比較:★P＜0.05

3 討論

KOA的主要病理變化是關(guān)節(jié)軟骨退變、軟骨下骨增生，骨贅形成，刺激周邊組織引起疼痛。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，關(guān)節(jié)間隙變窄、關(guān)節(jié)變形，導(dǎo)致關(guān)節(jié)僵硬、活動(dòng)度降低影響日常生活。因此，其治療根本是促進(jìn)軟骨合成和延緩軟骨退變。多數(shù)KOA患者就診是因?yàn)槌霈F(xiàn)疼痛，雖然目前緩解疼痛的方法頗多，但均存在一定的缺陷。如口服非甾體類(lèi)藥物可能有胃腸道刺激甚至出現(xiàn)消化道出血，且無(wú)法改變軟骨退變;口服氨基糖甙類(lèi)藥物療程長(zhǎng)、費(fèi)用高;關(guān)節(jié)腔注射玻璃酸鈉存在可能損傷軟骨的風(fēng)險(xiǎn);口服中藥也存在味苦、煎藥耗時(shí)、療程長(zhǎng)等問(wèn)題。因此，尋求一種簡(jiǎn)單、方便、有效的KOA是當(dāng)務(wù)之急。

隨著現(xiàn)代康復(fù)技術(shù)在我國(guó)大陸應(yīng)用的快速發(fā)展，不少物理因子可緩解KOA疼痛，但由于作用機(jī)制不一，某些物理因子(如濕熱敷、紅外線(xiàn))無(wú)法作用于關(guān)節(jié)深層組織，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的作用有限。而Korstjens［8］等也發(fā)現(xiàn)，低強(qiáng)度脈沖超聲波(low intensity pulse US，LIPUS)可促進(jìn)體外干預(yù)軟骨細(xì)胞增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成。高明霞等［9］用LIPUS可以減輕關(guān)節(jié)軟骨ECM的損傷程度，其作用與LIPUS治療后關(guān)節(jié)軟骨中p38、ERK1/2表達(dá)下調(diào)有關(guān)，并從軟骨的合成方面證實(shí)US治療KOA的效果和機(jī)制。然而KOA的發(fā)生除軟骨合成減少外，軟骨細(xì)胞過(guò)度凋亡也是KOA發(fā)生發(fā)展的重要原因。有研究證實(shí)，US較毫米波、超短波、低功率激光、脈沖電磁場(chǎng)能更好地抑制兔KOA模型軟骨細(xì)胞凋亡，從而延緩軟骨細(xì)胞退變［10－11］。表1、2、圖1、2顯示，本次的研究證實(shí)，單純US可以抑制軟骨細(xì)胞凋亡，延緩軟骨退變，臨床也證實(shí)US治療能改善KOA患者功能［12］。

表2圖3顯示，雖然單純US能較好地緩解KOA疼痛癥狀且能延緩軟骨退變，但一些研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用US機(jī)械振動(dòng)原理導(dǎo)入一些藥物能更好地促進(jìn)局部藥物吸收，起到US和藥物的雙重效果，且減少口服藥物對(duì)胃腸道刺激的副作用或單純局部外用藥物吸收率低的問(wèn)題［3－4］。因此，我們用US導(dǎo)入我院院內(nèi)制劑復(fù)方三七消痛軟膏(該方主要由川烏、草烏、紅花、當(dāng)歸、川芎等組成，具有祛風(fēng)除濕、活血化瘀、宣痹止痛、補(bǔ)腎強(qiáng)筋功效，符合KOA發(fā)病的中醫(yī)病因病機(jī))治療KOA，并與該方的酊劑(舒筋止痛水)外擦和單純超聲波治療KOA療效作比較。同時(shí)研究其作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，US導(dǎo)入復(fù)方三七軟膏在抑制軟骨細(xì)胞凋亡、延緩軟骨退變效果均優(yōu)于單純US或其酊劑外擦拍打法。而軟骨細(xì)胞凋亡信號(hào)caspase－9和caspase－3蛋白含量發(fā)現(xiàn)，US導(dǎo)入復(fù)方三七消痛軟膏、單純US或舒筋止痛水外擦怕打，均能不同程度地降低 caspase－9和 caspase－3蛋白表達(dá)，抑制軟骨凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方三七軟膏方中的川芎成分川芎嗪能抑制OA軟骨細(xì)胞caspase－9蛋白表達(dá)，以治療軟骨破壞［13］;當(dāng)歸注射液能通過(guò)調(diào)節(jié)與軟骨細(xì)胞凋亡有關(guān)的PI3K/AKT蛋白含量，延緩軟骨退變［14］。而本研究證實(shí)，由當(dāng)歸、川芎、懷牛膝等組成的復(fù)方三七消痛軟膏同樣能抑制軟骨細(xì)胞caspase－9和caspase－3表達(dá)(表2，圖3)。

我們的研究結(jié)果顯示，US導(dǎo)入復(fù)方三七軟膏、復(fù)方三七軟膏外用和單純US治療KOA均有一定效果，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)因子caspase－3和caspase－9的蛋白表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)筆者認(rèn)為，用US導(dǎo)入復(fù)方三七軟骨治療KOA具有以下優(yōu)點(diǎn):一是能使中藥直達(dá)關(guān)節(jié)深部組織，解決口服中藥存在對(duì)胃腸道刺激且依從性差問(wèn)題;二是與傳統(tǒng)針灸、推拿比較，能夠減少治療時(shí)間，US導(dǎo)入治療一般是5～10 min，后者一般要30～40 min;三是醫(yī)療費(fèi)用低，US導(dǎo)入治療一般收費(fèi)40元，而藥物、針刺、推拿、關(guān)節(jié)腔注射收費(fèi)基本上百元。因此，筆者認(rèn)為，臨床KOA的康復(fù)治療方法，應(yīng)充分發(fā)揮中西醫(yī)各自的優(yōu)點(diǎn)或中西醫(yī)結(jié)合優(yōu)勢(shì)，我們提倡有條件的醫(yī)療單位可使用US治療KOA;如果能夠研制出針對(duì)KOA病因病機(jī)的中藥制劑，結(jié)合US導(dǎo)入，效果更明顯，值得今后進(jìn)一步研究應(yīng)用。

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Study of Therapeutic Effects and Mechanisms of Ultrasound Phoresis Compound Sanqi Xiaotong Paste for Treatment Knee Osteoarthritis in Rabbits

HE Jian2，3，LIANG Jie4，LUO Qing－lu1，2，3△，LIU Wei－lin1，2，LIN Ru－h(huán)ui4，5
(1．College of rehabilitation medicine，F(xiàn)ujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou Fujian，350122，China; 2．The key laboratory of Motor Function of Fujian，F(xiàn)uzhou Fujian 350003，China;3．Affiliated Rehabilitation Hospital Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou Fujian 350003，China;4．The second hospital of Fuzhou，F(xiàn)uzhou，350007，China;5．Fujian Academy of Integrative Medicine，F(xiàn)ujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350122，China)

Objective:Observing the theraputic effects and studying the mechanisms of US phoresis Compound Sanqi Xiaotong Paste in KOA rabbits.Methods:Four month old，40 white New Zealand rabbits，were randomly divided into US phoresis Compound Sanqi Xiaotong Paste(A group)，normal US(B group)，ShuJinZhiTong water local external pat(C group)，sham normal US(D group)and nornal controls(E group)groups.All were subjected to double knee anterior cruciate ligament abscise(ACLA)except E group，each group included 8 rabbits.Six weeks after surgery，A，B，C，D group(surgical knee joint)were interrupted with US phoresis Compound Sanqi Xiaotong Paste，normal US，ShuJinZhiTong water local external pat，sham normal US for 8 min per day for 10 days(5 days after exposure，stopping 2 days，continue，exposure 5 days)，respectively.After 10 days intervention，all rabbits were sacrificed by air injection.The cartilaginous tissue was stained with Hematoxylin and Eosin(H＆E)and observed chondrocyte morphology by light microscopy and Mankin’s score were counted.Chondrocytes apoptosis were detected by TUNEL.Incide tibial plate full－thickness cartilage for apotposis gene of caspase－9 and caspase－3，measurement the protein content by Western－Blot in chondrocyte.Results The Mankin scores in A groups was significantly lower than B，C，D groups，and significantly higher than E group.The apoptosis of chondrocytes and the caspase－9，caspase－3 protien expression in A groups were significantly lower than B，C，D groups，and significantly higher than E group.Conclusions US phoresis Compound Sanqi Xiaotong Paste can regress cartilage apomorphosis for treatment OA，and superior to the general US interruption.It downregulated the expression of caspase－9 and caspase－3 protien in chondrocyte，which it may be the theraputic signal molecules.

Osteoarthritis;Ultrasound;Drug phoresis;Chondrocyte;Caspase

R285.5

B

1006－3250(2017)02－0191－05

2016－08－07

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81273774)

何 堅(jiān)(1970－)，男，副教授，醫(yī)學(xué)碩士，從事骨關(guān)節(jié)疾病的中醫(yī)推拿研究。

△通訊作者:羅慶祿(1973－)，男，副教授，醫(yī)學(xué)博士，從事骨關(guān)節(jié)疾病的現(xiàn)代康復(fù)研究，E－mail:luo_qinglu@126.com。