羅亞玲， 周 娟， 齊景梁

(四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院， 四川 成都 610097)

基于高效液相色譜法的牛黃解毒制劑中膽紅素含量測定

羅亞玲， 周 娟， 齊景梁

(四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院， 四川 成都 610097)

利用高效液相色譜法建立牛黃解毒制劑中膽紅素的含量測定方法，色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18色譜柱，流動(dòng)相為乙腈—1%冰醋酸(95∶5)，檢測波長為450 nm.結(jié)果顯示，膽紅素進(jìn)樣量在0.8321～208.032 ng范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，r=0.9995，牛黃解毒片平均回收率為105.6%，RSD為1.42%，牛黃解毒丸平均回收率為96.2%，RSD為1.83%.結(jié)果表明，方法準(zhǔn)確、簡便，可作為牛黃解毒片及牛黃解毒丸等制劑中膽紅素含量的測定方法.

牛黃解毒制劑；膽紅素；液相色譜法

0 引 言

牛黃解毒片和牛黃解毒丸的處方主要由人工牛黃、雄黃和黃芩等8味藥材組成[1]，具有清熱解毒之功效，臨床上常用于火熱內(nèi)盛、咽喉腫痛、牙齦腫痛、口舌生瘡及目赤腫痛等癥.人工牛黃為方中主藥，系我國藥學(xué)工作者根據(jù)天然牛黃的成分研制而成，具體由膽紅素、膽酸、膽固醇等配制而成.膽紅素是人工牛黃中的主要成分，有解熱、降壓、抗病毒等作用，也是評(píng)價(jià)人工牛黃品質(zhì)優(yōu)劣的依據(jù)[2-5]，故考察牛黃解毒制劑中膽紅素的含量具有現(xiàn)實(shí)意義.

1 材料與儀器

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)所用材料包括：膽紅素對(duì)照品(批號(hào)，100077-200805，含量測定用，含量以98.5%計(jì)，使用前無需干燥處理)，由中國生物制品檢定所提供；牛黃解毒片(批號(hào)，B82015)，由天津同仁堂集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)；牛黃解毒丸(水蜜丸)(批號(hào)，1120668)，由北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠生產(chǎn)；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純.

1.2 儀 器

實(shí)驗(yàn)所用主要儀器為Waters 2695-2489-2998型液相色譜儀(美國沃特世公司).

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

實(shí)驗(yàn)色譜條件為：色譜柱，Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈—1%冰醋酸溶液(95∶5)；柱溫35 ℃；流速0.7 mL·min-1；檢測波長450 nm.

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備.

取膽紅素對(duì)照品適量，精密稱定，加三氯甲烷制成每1 mL含4.16 μg的溶液，制得對(duì)照品溶液.

2.2.2 供試品溶液的制備.

精密稱取牛黃解毒片細(xì)粉適量(相當(dāng)于大片4片或小片6片(糖衣片除糖衣，或水蜜丸細(xì)粉2 g))，置50 mL棕色量瓶中，精密加入二氯甲烷—甲醇(1∶1)混合溶劑25 mL(水蜜丸加10 mL)，稱重，冰水浴超聲20 min，取出，補(bǔ)重，濾過，取續(xù)濾液，制得供試品溶液.

2.3 測定法

分別吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測定.

2.4 專屬性考察

分別取陰性樣品(缺膽紅素)供試溶液、膽紅素對(duì)照品溶液、牛黃解毒片供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn).結(jié)果顯示，陰性樣品對(duì)膽紅素的測定無干擾，結(jié)果如圖1、2所示.

A.膽紅素對(duì)照品、牛黃解毒片樣品；B.和陰性樣品；C.色譜圖

A.膽紅素對(duì)照品；B.牛黃解毒丸樣品和陰性樣品；C.色譜圖

2.5 線性范圍考察

精密稱取膽紅素對(duì)照品(含量98.5%)10.56 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加三氯甲烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為S1；精密吸取S1 1mL，加三氯甲烷稀釋至25 mL量瓶中，搖勻，作為S2；精密吸取S2 1 mL，加三氯甲烷稀釋至10 mL量瓶中，搖勻，作為S3.分別精密吸取S3 2 μL、5 μL、10 μL及S2 5 μL、10 μL及S1 2 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定其峰面積，并以峰面積(A)為縱座標(biāo)，膽紅素進(jìn)樣量(ng)為橫座標(biāo)，進(jìn)行回歸，得回歸方程，

A=8 158.06C-11 324.30，r=0.9995

結(jié)果表明，膽紅素在進(jìn)樣量為0.8321～208.032 ng時(shí)，與峰面積線性關(guān)系良好.

2.6 精密度

精密量取膽紅素對(duì)照品溶液(濃度10.9532 μg·mL-1)5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，其RSD為0.52%.表明儀器的精密度良好.

2.7 重復(fù)性

取牛黃解毒片細(xì)粉適量(相當(dāng)于大片4片或小片6片(糖衣片除糖衣，或水蜜丸細(xì)粉2 g))，精密稱定，各6份，照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備溶液并測定含量，測得牛黃解毒片膽紅素平均含量為67.24 μg·g-1(RSD=0.91%)，牛黃解毒丸膽紅素平均含量為32.24 μg·g-1(RSD=1.73%).結(jié)果表明，方法的重復(fù)性良好.

2.8 加樣回收率

分別取已知含量的牛黃解毒片細(xì)粉(含量為67.24 μg·g-1)1.0 g，牛黃解毒丸細(xì)粉(含量為32.24 μg/g)1.0 g，各6份，精密稱定，置于50 mL棕色量瓶中，精密加入膽紅素對(duì)照品溶液(C=3.5051 μg·mL-1)25 mL(片劑)或10 mL(丸劑)，稱定質(zhì)量，按照擬定方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1、表2.

表1 牛黃解毒片中膽紅素的加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表2 牛黃解毒丸中膽紅素的加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.9 檢測限考察

精密量取膽紅素對(duì)照品溶液(C=0.09266 μg·mL-1)5 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果顯示，S/N≈3.確定本品檢測限為0.46 ng，折算成樣品中的檢測限即為:牛黃解毒片0.4 μg·片-1或大片0.6 μg·片-1，牛黃解毒丸1.15 μg·g-1(水蜜丸/水丸)或大蜜丸0.46 μg·g-1.

2.10 樣品測定

依據(jù)建立的膽紅素含量測定方法，對(duì)2批次牛黃解毒丸(水蜜丸)和246批次的牛黃解毒片進(jìn)行了考察.2批次水蜜丸中，膽紅毒含量分別為46.91 μg·g-1和48.42 μg·g-1；246批次牛黃解毒片劑樣品中，膽紅素含量從0.00 μg·片-1～50.82 μg·片-1(220批次小片)，9.80 μg·片-1～55.602 μg·片-1(26批次大片)，含量差異很大.結(jié)果見圖3、圖4.

圖3 牛黃解毒片(小片)膽紅素含量結(jié)果

3 討 論

由于膽紅素不溶于水，可溶于苯、三氯甲烷及二硫化碳等有機(jī)溶劑中，但這些溶劑毒性均較大.對(duì)此，本研究考察了毒性較低的二氯甲烷、二氯甲烷—甲醇(8∶2)、二氯甲烷—甲醇(1∶1)3種提取溶劑，并同三氯甲烷作了比較.結(jié)果表明，二氯甲烷同三氯甲烷提取效果一致，二氯甲烷—甲醇(8∶2)同二氯甲烷—甲醇(1∶1)提取效果一致，且所提取的膽紅素含量高于二氯甲烷與三氯甲烷，原因可能是加了甲醇后，溶劑對(duì)樣品的滲透性較好，因而提取率更高.考慮到二氯甲烷的揮發(fā)性較強(qiáng)，最終選擇了甲醇比例更高的溶劑，即二氯甲烷—甲醇(1∶1)為提取溶劑.

膽紅素對(duì)光和熱不穩(wěn)定，因此本實(shí)驗(yàn)全程避光，并采用冰浴超聲的方法進(jìn)行提取.在制備工藝中，人工牛黃一般在壓片或制丸之前加入，根據(jù)牛黃解毒片處方分析，膽紅素理論含量分別為32 μg·片-1(大片)、21 μg·片-1(小片)、27 μg·g-1(水蜜丸).測定結(jié)果顯示，246批樣品膽紅素含量相互之間差異較大，原因可能是由于原標(biāo)準(zhǔn)中無膽紅素的含量測定項(xiàng)目，缺乏對(duì)廠家投料的監(jiān)控.因此，本品標(biāo)準(zhǔn)的完善具有緊迫性和重要性.

本研究采用高效液相色譜法測定牛黃解毒片/水蜜丸中膽紅素的含量，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，獲得了理想的檢測效果，可以作為牛黃解毒制劑的人工牛黃的質(zhì)量評(píng)價(jià)鑒定方法，為其質(zhì)量控制提供依據(jù).本研究建議在牛黃解毒劑原標(biāo)準(zhǔn)中增加膽紅素的含量測定，具體為：牛黃解素片中膽紅素大片含量不得少于30 μg·片-1，小片膽紅素含量不得少于20 μg·片-1；牛黃解毒丸(水蜜丸)中含膽紅素含量不得少于25 μg·片-1.

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2]吳紅霞，付錦江.高效液相色譜法測定西黃片中人工牛黃的膽紅素含量測定[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2009，15(4)：124-125.

[3]楊云沛，黃志東，李海生.人工牛黃及天然牛黃中膽紅素的HPLC測定方法研究[J].天津藥學(xué),1995，7(2)：15-16.

[4]羅珍妹，陳曉玲.高效液相色譜法測定人工牛黃中膽紅素的含量[J].海峽藥學(xué),2010,22(6)：48-50.

[5]王宜祥，傅劍飛.HPLC法測定小兒速效感冒靈中膽紅素含量[J].現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，1996，13(6)：59-61.

Determination of Bilirubin Content in Bezoar Detoxication Preparation by HPLC

LUOYaling，ZHOUJuan，QIJingliang

(Sichuan Institute for Food and Drug Control, Chengdu 610097, China)

The paper is going to establish a method for the determination of bilirubin in bezoar detoxicatio preparation.Liquid chromatography is used.The chromatography column is C18column;mobile phase is acetonitrile-1% acetic acid(95∶5);the detection wavelength is 450 nm.The results show that the amount of bilirubin in the sample has a high linearity among the range of 0.8321～208.032 ng,r=0.9995;the average recovery rate of the bezoar detoxicatio tablets is 105.6%,RSD=1.42%;the average recovery rate of bezoar detoxicatio pills is 96.2%,RSD=1.83%.The results demonstrate that this method is accurate and simple,and can be used as the method to determine the bilirubin content in bezoar detoxicatio tablets and pills.

bezoar detoxication preparation;bilirubin;liquid chromatography

1004-5422(2017)01-0021-04

1004-5422(2017)01-0018-03

2016-11-21.

羅亞玲(1978 — )， 女， 中藥師， 從事中成藥制劑有效成分檢測與分析.

R927.2；O657.7+2

A