簡 瑤

(成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心， 四川 成都 610106)

基于化學(xué)熒光法的雙黃連口服液神經(jīng)氨酸酶抑制活性測定

簡 瑤

(成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心， 四川 成都 610106)

建立流感病毒神經(jīng)氨酸酶體外活性熒光檢測法測定雙黃連口服液的NA抑制生物活性.采用化學(xué)熒光法測定雙黃連口服液對神經(jīng)氨酸酶的抑制率.結(jié)果表明，反應(yīng)后溶液熒光強(qiáng)度與產(chǎn)物4-MU濃度在0.1～1.2 μg/mL內(nèi)成良好的線性相關(guān)系(Y=39482X-254.05(r=0.9994))，該測定方法的精密度與重復(fù)性良好，反應(yīng)后溶液在4 ℃條件下4 h內(nèi)穩(wěn)定，雙黃連口服液對流感病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制率高達(dá)64.20%.該方法可用于測定雙黃連口服液對神經(jīng)氨酸酶抑制活性測定.

化學(xué)熒光法；神經(jīng)氨酸酶抑制劑；活性測定

0 引 言

流感病毒屬于正黏病毒科成員，為單分子負(fù)鏈RNA病毒，能引起上下呼吸道疾病[1]，是流感的主要病源體[2].而神經(jīng)氨酸酶是一個呈蘑菇狀的四聚體糖蛋白，具有水解唾液酸的活性[3]，當(dāng)成熟的流感病毒經(jīng)出芽的方式脫離宿主細(xì)胞之后，病毒表面的血凝素會經(jīng)由唾液酸受體與宿主細(xì)胞膜保持聯(lián)系，神經(jīng)氨酸酶可將唾液酸水解，切斷病毒與宿主細(xì)胞的最后聯(lián)系，使病毒能順利從宿主細(xì)胞中釋放，繼而感染下一個宿主細(xì)胞.因此，神經(jīng)氨酸酶也成為流感治療藥物的一個作用靶點(diǎn).

在我國，中成藥在流感的預(yù)防和治療中的應(yīng)用非常廣泛[4-7]，其中雙黃連口服液是由黃芩、金銀花、連翹3味藥組成[8]，通過傳統(tǒng)水提醇沉工藝精制而成，表里雙解、氣血兩清，具有良好的清熱解毒作用，為目前各大中醫(yī)院急診科的常用抗菌、抗病毒中成藥，臨床主要用于細(xì)菌或病毒引起的上呼吸道感染，也是兒童感冒治療的常用中成藥之一.此外，由于中成藥的物質(zhì)基礎(chǔ)復(fù)雜，相關(guān)作用機(jī)制尚不明確，且缺乏準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，限制了其臨床使用.基于此，本研究擬對雙黃連口服液對流感病毒神經(jīng)氨酸酶活性的抑制效果進(jìn)行研究，并在體外進(jìn)行了抗流感病毒活性驗(yàn)證.

1 材料與儀器

1.1 藥材與試劑

實(shí)驗(yàn)所用藥材與試劑包括：雙黃連口服液10批(批號，20120719、20130824，河南太龍藥液股份有限公司；批號，20130920、20140427，東莞市亞洲制藥有限公司；批號，20140612、20141009，黑龍江瑞格制藥有限公司；批號，20150216、20150610，河南福森藥液有限公司；批號，20160215、20160518，哈藥集團(tuán)三精制藥有限公司)；MDCK細(xì)胞、流感病毒(A/PR8/34)，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物傳染病研究所保存；神經(jīng)氨酸酶底物，4-methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-neuraminic acid(MUNANA)，購于美國Sigma公司.

1.2 儀 器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：Fluostar galary微板光學(xué)測定儀及配套熒光測定96孔板(德國BMG公司).

1.3 神經(jīng)氨酸酶的制備

參照文獻(xiàn)[8]所述方法對培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞接種流感病毒(A/PR8/34標(biāo)準(zhǔn)株),待完全感染病變后取濾除細(xì)胞的病毒液，加NP-40滅活，用0.22 μm濾器濾過后分裝，作為神經(jīng)氨酸酶的儲備液，-70 ℃凍存，備用.

1.4 緩沖溶液與反應(yīng)終止液的配制

1)緩沖液的配制.稱取0.64 g MES，0.044 g CaCl2溶于100 mL超純水中,配成濃度為33 mmol/L MES，4 mmol/L CaCl2的緩沖溶液，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.5.

2)反應(yīng)終止液的配制.稱取0.08 g NaOH溶于1 000 mL超純水中，配置成0.002 mol/L的溶液，備用.

2 方法與結(jié)果

2.1 神經(jīng)氨酸酶的體外檢測原理

化合物MUNANA是神經(jīng)氨酸酶的特異性底物,在神經(jīng)氨酸酶作用下的產(chǎn)物4-MU(7-Hydroxy-4-methylcoumarin,C10H8O3)在355 nm入射波長激發(fā)下,可以產(chǎn)生460 nm熒光,采用熒光檢測器測定該波長熒光強(qiáng)度的變化，可靈敏地反映神經(jīng)氨酸酶活性.在反應(yīng)體系中加入能夠抑制神經(jīng)氨酸酶活性的藥物,則相同條件下產(chǎn)物4-MU的量會相應(yīng)減少，熒光強(qiáng)度會相應(yīng)減弱,該藥物的神經(jīng)氨酸酶抑制活性就能通過熒光強(qiáng)度的變化被表征.

2.2 神經(jīng)氨酸酶的體外活性實(shí)驗(yàn)

神經(jīng)氨酸酶的體外活性實(shí)驗(yàn)在96孔熒光酶標(biāo)板孔內(nèi)進(jìn)行，先加入20 μL待測藥物配制溶液，加入適量稀釋的神經(jīng)氨酸酶30 μL混勻，室溫靜置10 min后加入反應(yīng)物50 μL MUNANA(濃度為20 μmol/L)，37 ℃溫孵60 min，立即加入150 μL終止液NaOH(0.034 mol/L)，測定熒光強(qiáng)度值，激發(fā)波長355 nm，發(fā)射波長460 nm.設(shè)置酶對照組與空白對照組，酶對照組用相同體積的超純水代替待測樣品，空白對照組用相同體積的超純水代替待測樣品，且用相同體積的緩沖液代替神經(jīng)氨酸酶.抑制率計(jì)算公式為，

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系.

將神經(jīng)氨酸酶儲備液稀釋至不同的濃度，在96 孔熒光酶標(biāo)板孔內(nèi)，各神經(jīng)氨酸酶稀釋液濃度值平行3組，按酶對照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同時進(jìn)行空白組實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)完后測定熒光強(qiáng)度(見圖1)，并用HPLC法測定各孔內(nèi)4-MU的生成量(見圖2).同時，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對2種測定方法所得結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析(見圖3).

結(jié)果表明，溶液熒光強(qiáng)度與HPLC法測定的產(chǎn)物4-MU濃度在0.1～1.2 μg/mL內(nèi)呈良好的線性相關(guān)系(Y=39482X-254.05(r=0.9994))，表明熒光強(qiáng)度測定所得結(jié)果能準(zhǔn)確反映產(chǎn)物生成量.

圖1 不同稀釋比例反應(yīng)后溶液熒光強(qiáng)度值

圖3 4-MU濃度與熒光強(qiáng)度的關(guān)系

2.3.2 精密度.

取雙黃連口服液于96孔板中，按待測藥物組同時進(jìn)行酶對照組與空白對照組實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)完成后連續(xù)重復(fù)測定溶液的熒光強(qiáng)度6次.計(jì)算抑制率的RSD值為1.68%，表明儀器的精密度良好.

2.3.3 重復(fù)性.

取同一批雙黃連口服液6份于96孔板中，按待測藥物組同時進(jìn)行酶對照組與空白對照組實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)完成后分別測定溶液的熒光強(qiáng)度.計(jì)算抑制率的RSD值為2.42%，表明本方法的重復(fù)性良好.

2.3.4 穩(wěn)定性.

取雙黃連口服液于96孔板中，按待測藥物組同時進(jìn)行酶對照組與空白對照組實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)完成后立即于4 ℃冷藏，分別于0、1、2、3、4 h測定溶液的熒光強(qiáng)度.計(jì)算抑制率的RSD值為3.29%，表明本方法所制備的溶液于4 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.4 多批樣品流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制率測定

取10批雙黃連口服液分別于96孔板中，按待測藥物組同時進(jìn)行酶對照組與空白對照組實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)完成后立即測定溶液的熒光強(qiáng)度.分別計(jì)算10批雙黃連口服液的抑制率，結(jié)果見表1.

表1 10批雙黃連口服液對流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制率的測定結(jié)果(n=3)

表1數(shù)據(jù)顯示，不同批次的雙黃連口服液對流感病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制率存在差異，其范圍為35.13%～69.87%，高低相差近2倍.通常，雙黃連口服液的有效期為2年，其中批號為20120719、20130824、20130920、20140427、20140612、20141009，已經(jīng)過了規(guī)定的有效期，其對流感病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制率明顯低于批號為，20150216、20150610、20160215、20160518的雙黃連口服液.實(shí)驗(yàn)表明，有效期內(nèi)的雙黃連口服液對流感病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制率達(dá)64.20%.

3 討 論

本研究在前期實(shí)驗(yàn)中，詳細(xì)考察了酶用量、底物MUNANA的用量、反應(yīng)時間等因素，確定了化合物MUNANA與神經(jīng)氨酸酶的反應(yīng)條件.

化合物MUNANA在神經(jīng)氨酸酶的作用下的產(chǎn)物4-MU在355 nm入射波長激發(fā)下,可以產(chǎn)生460 nm熒光，4-MU在溶液中的濃度與熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系，且測定熒光強(qiáng)度快捷迅速，準(zhǔn)確度與精密度良好，HPLC測定產(chǎn)物4-MU比較費(fèi)時，故本研究采用測定熒光強(qiáng)度的方法來計(jì)算雙黃連口服液對神經(jīng)氨酸酶的抑制率.

雙黃連口服液由黃芩、金銀花、連翹組成.相關(guān)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明，黃芩苷能通過影響細(xì)胞的凋亡受體途徑FAS/FASL，激發(fā)病毒感染小鼠肺組織細(xì)胞的凋亡系統(tǒng)，發(fā)揮抗流感病毒感染的作用[9]；體外實(shí)驗(yàn)研究表明，黃芩苷在病毒感染后24～48 h有抗病毒作用，基本上可以抑制流感病毒在細(xì)胞造成的損傷[10].此外，段林建等[11-12]的研究還表明，連翹具有抗甲型流感病毒的作用，在應(yīng)對甲型及其他兩型流感病毒引發(fā)的流行性感冒方面效果顯著.本研究結(jié)果與以上文獻(xiàn)研究結(jié)論一致.

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NA Inhibiting Activity Determination of Shuanghuanglian Oral Liquid Based on Chemical Fluorescence

JIANYao

(Public Health Clinical Center of Chengdu, Chengdu 610106, China)

The paper is going to establish the influenza virus neuraminidase(NA) activity in vitro fluorescence assay to determine the NA inhibition of biological activity of Shuanghuanglian oral liquid.The chemical fluorescence spectrometry is used to determine the inhibitory rate of Shuanghuanglian oral liquid on neuraminidase.The results show that the solution fluorescence intensity after reaction and the intensity of 4-MU of the product is in a good linear phase relationship within 0.1 to 1.2 μg/mL.This determination method has good precision and repeatability.The solution after reaction is stable under the condition of 4 ℃ within 4 hours and the inhibition rate of Shuanghuanglian oral liquid on influenza virus neuraminidase is as high as 64.20%.The conclusion drawn from the study is that this method can be used for the determination of neuraminidase inhibitory activities of Shuanghuanglian oral liquid.

chemical fluorescence;neuraminidase inhibitors;activity determination

2017-01-14.

簡 瑤(1980 — )， 女， 主治醫(yī)師， 從事臨床醫(yī)療與科研工作.

R285.5

A