黃巧婷， 許 杰， 高維緯， 曹建民

(1.成都大學 體育學院， 四川 成都 610106； 2.北京體育大學 運動人體科學學院， 北京 100084)

骨性關(guān)節(jié)炎滑膜醛縮酶及烯醇酶的差異表達

黃巧婷1， 許 杰1， 高維緯2， 曹建民2

(1.成都大學 體育學院， 四川 成都 610106； 2.北京體育大學 運動人體科學學院， 北京 100084)

通過分析膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者及對照受試者滑膜中醛縮酶及烯醇酶的差異蛋白表達，為骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機理研究提供新的思路.獲取10名膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者(實驗組)和同期10名對照受試人員(對照組)膝關(guān)節(jié)滑膜，二維凝膠電泳技術(shù)分離蛋白質(zhì)，并采用基質(zhì)輔助激光解析質(zhì)譜技術(shù)鑒定差異表達蛋白質(zhì).結(jié)果顯示，骨性關(guān)節(jié)炎組和對照組滑膜相比，醛縮酶及烯醇酶均僅存于骨性關(guān)節(jié)炎組中，而對照組中并未出現(xiàn)這兩種蛋白.結(jié)果表明，醛縮酶、烯醇酶僅在實驗組中表達，可通過調(diào)節(jié)細胞能量活動參與骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程.

骨性關(guān)節(jié)炎；蛋白質(zhì)組學；醛縮酶；烯醇酶

0 引 言

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種常見的影響中老年人生活質(zhì)量的慢性關(guān)節(jié)疾病，其主要的病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨面退行性變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生[1].研究發(fā)現(xiàn)，骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中伴隨著炎癥反應，并累及關(guān)節(jié)滑膜，即產(chǎn)生相應的病理變化過程——滑膜炎[2].核磁共振成像和超聲波掃描顯示，骨性關(guān)節(jié)炎早期已伴有滑膜炎癥反應，滑膜炎癥反應的活性分子有血清C-反應蛋白、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白、透明質(zhì)酸與血清II膠原等，它們與骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)[3].骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)作時，由于軟骨細胞缺氧，細胞內(nèi)能量代謝能力發(fā)生障礙，與能量代謝相關(guān)的酶類活性將發(fā)生改變，并引起關(guān)節(jié)內(nèi)組織的病理生理學改變.因此，針對關(guān)節(jié)滑膜醛縮酶及烯醇酶的研究有重要意義，可為骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機理研究提供新的思路.

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

研究對象為國家體育總局運動醫(yī)學研究所體育醫(yī)院微創(chuàng)外科10名符合納入標準的膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎病人(實驗組)其中男性5名，女性5名，平均年齡54.94(46～60)歲.同期10名非骨性關(guān)節(jié)炎膝關(guān)節(jié)手術(shù)病人(對照組)，其中男性5名，女性5名，平均年齡39.5(38～44)歲.

1.1.1 研究對象納入與排除標準.

1)實驗組納入標準：知情同意，并自愿簽署知情同意書；年齡38歲以上，性別不限；身體其他部分健康；無明確膝部受傷史.

實驗組排除標準：類風濕、風濕性膝關(guān)節(jié)炎；感染性關(guān)節(jié)炎；關(guān)節(jié)創(chuàng)傷手術(shù)史.

2)對照組納入標準：知情同意，并自愿簽署知情同意書；年齡、性別與實驗組相近；無骨性關(guān)節(jié)炎.

對照組排除標準：未自愿簽署知情同意書者；年齡在38歲以下者；有膝關(guān)節(jié)手術(shù)史.

1.1.2 臨床表現(xiàn)及診斷標準.

美國風濕病學會(American College of Rheumatology，ACR)在2010年發(fā)布的膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎臨床和放射學結(jié)合的診斷標準為：

1)臨床癥狀：①1個月大多數(shù)日子膝痛；②關(guān)節(jié)活動時有骨響聲；③晨僵小于30 min；④年齡≥38歲；⑤膝檢查顯示骨性肥大.

具備①、②、③、④項或①、②、⑤或①、④、⑤項納入實驗組.

2)臨床及放射學：①1個月中大部分時間有明顯膝痛；②X線顯示關(guān)節(jié)邊緣骨贅；③關(guān)節(jié)炎實驗室檢查符合骨關(guān)節(jié)炎(關(guān)節(jié)液清晰標準，白細胞<2×109個)；④年齡≥40歲；⑤晨僵<30 min；⑥關(guān)節(jié)活動時有骨響聲.

具備①、②或①、③、⑤、⑥項或①、④、⑤、⑥項納入實驗組.

3)所有患者根據(jù)Kellgren和Laurence放射學分級標準(0～4級)進行分級：0級為正常；1級為關(guān)節(jié)間隙可疑變窄，可能有骨贅；2級為關(guān)節(jié)間隙可疑變窄，有明顯骨贅；3級為關(guān)節(jié)間隙肯定變窄，中等量骨贅，有些硬化性病變；4級為關(guān)節(jié)間隙明顯變窄，大量骨贅，嚴重硬化性病變及關(guān)節(jié)畸形.其中，1級及1級以上可確診為骨性關(guān)節(jié)炎.本研究限定患者為1～2級骨性關(guān)節(jié)炎.

1.2 取樣及樣品處理

膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)鏡手術(shù)過程中，用髓核鉗于膝關(guān)節(jié)髕上囊滑膜增生或充血顯著部位獲取骨性關(guān)節(jié)炎病變滑膜組織及正?；そM織，每例約為0.5 g，TRIS-山梨醇漂洗后，迅速裝入冷存管，并立即(30 s內(nèi))投入液氮中(-196 ℃)，快速運抵-80 ℃恒溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?

1.3 蛋白質(zhì)組學測試

蛋白質(zhì)組學測試流程為：①TCA-丙酮沉淀法樣品制備；②固相pH梯度-SDS雙向凝膠電泳及銀染，第一向等電聚焦的基本原理是利用蛋白質(zhì)分子或其他兩性分子的等電點不同，在一個穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的pH梯度中進行蛋白質(zhì)的分離和分析，第二向運用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)分子量大小對蛋白質(zhì)進行分離；③質(zhì)譜分析；④蛋白質(zhì)鑒定，根據(jù)出峰情況決定質(zhì)譜結(jié)果好壞，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫檢索，確定蛋白質(zhì).質(zhì)譜分析后進行NCBI數(shù)據(jù)庫檢索，獲差異蛋白名稱、分子量、等電點等相關(guān)信息；⑤NCBI數(shù)據(jù)庫檢索.

2 結(jié) 果

2.1 實驗組和正常組膝關(guān)節(jié)滑膜二維凝膠電泳圖像

本研究以50 μg上樣蛋白量，7 cm長膠，膠條pH值為3～10，對樣本進行的二維凝膠電泳實驗，結(jié)果如圖1所示.

圖1 實驗組和正常組膝關(guān)節(jié)滑膜二維凝膠電泳圖

2.2 膝關(guān)節(jié)滑膜組織烯醇酶及醛縮酶的一級質(zhì)譜(PMF)

膝關(guān)節(jié)滑膜組織烯醇酶及醛縮酶的一級質(zhì)譜(PMF)如圖2所示.

圖2 烯醇酶及醛縮酶的PMF

2.3 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

通過一級質(zhì)譜鑒定分析后，對差異蛋白點進行NCBI數(shù)據(jù)庫檢索，獲得醛縮酶及烯醇酶序列號、相匹配的肽段數(shù)及匹配率等相關(guān)信息，如表1所示.

表1 OA組和對照組差異蛋白點鑒定結(jié)果

3 分析與討論

通常認為，骨性關(guān)節(jié)炎是由于關(guān)節(jié)磨損并伴有退行性變引起的，但最近的研究發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)的炎癥反應也是其的重要致病因素.而關(guān)節(jié)炎癥反應主要表現(xiàn)為滑膜組織上的炎癥——滑膜炎，滑膜炎刺激了細胞因子等的合成與分解，破壞了軟骨基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，被認為是僅次于關(guān)節(jié)軟骨改變的第二重要致病因素，而與代謝有關(guān)的酶能夠反映骨性關(guān)節(jié)炎滑膜內(nèi)能量代謝的變化，可有效地體現(xiàn)關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜慢性炎癥過程.

3.1 醛縮酶

醛縮酶(Adolase)屬于裂合酶，是一種在糖分解過程中催化醛糖分裂與固縮反應的生物酶，它是催化1，6-二磷酸果糖(FDP)裂解為磷酸甘油醛(GAP)和磷酸二羥丙酮的糖酵解酶，同時在糖異生中也催化這個反應的可逆反應，在糖酵解和果糖代謝中起關(guān)鍵作用.醛縮酶主要由4個相同亞基組成，這4個亞基通過內(nèi)部高度對稱相互連接[4].其催化活性結(jié)構(gòu)為β-筒狀結(jié)構(gòu)，目前的研究已證實β-筒狀結(jié)構(gòu)中心的口袋狀區(qū)域的某些氨基酸殘基對醛縮酶的催化分解過程起作用.

醛縮酶具有3種同工型：AldolaseA可存在于多個組織中，但在骨骼肌中含量最高；AldolaseB主要存在肝臟和腎臟中；AldolaseC存在于腦組織中，與A亞型，B亞型混雜共生.AldolaseA是橫紋肌中主要的醛縮酶，能夠分解1，6-二磷酸果糖(FDP)和1-磷酸果糖(FIP)，因此在糖酵解過程中起重要作用.

正常的軟骨細胞主要利用葡萄糖代謝產(chǎn)生ATP，糖代謝的受損與骨性關(guān)節(jié)炎軟骨降解的作用機制相關(guān)[5].研究發(fā)現(xiàn)，在增殖的細胞中Aldolase的表達量是上調(diào)的[6]，而骨性關(guān)節(jié)炎的其中一個病理性變化就是滑膜細胞的增殖，骨性關(guān)節(jié)炎滑膜的增生主要表現(xiàn)為襯里層成纖維樣滑膜細胞的增殖，因此骨性關(guān)節(jié)炎患者Aldolase表達量的升高可能與滑膜襯里層成纖維樣滑膜細胞的增生相關(guān).大量研究顯示，成纖維樣滑膜細胞能夠釋放了各種效應分子，如透明質(zhì)酸，作用于各種細胞，調(diào)節(jié)了關(guān)節(jié)的炎癥和基質(zhì)合成與分解的平衡.

本研究結(jié)果顯示，Aldolase的表達只在骨性關(guān)節(jié)炎組出現(xiàn)，表明骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞降解，能量代謝紊亂，糖代謝受損后引起糖相關(guān)蛋白表達量的增高[7]，進而有效地刺激了Aldolase的增加.表達量增加的Aldolase，可在TNF-a的調(diào)解下，進一步促進關(guān)節(jié)炎癥反應，導致骨性關(guān)節(jié)炎病情加重.

3.2 烯醇酶

烯醇酶(Enolase，ENOA)，又稱2-磷酸-D甘油酸水解酶，是糖酵解系統(tǒng)的一種酶，通過催化2-磷酸甘油酸生成磷酸烯醇式丙酮酸，在ATP的合成代謝過程中起重要作用.烯醇酶由a、β、γ三種亞基以二聚體形式組成，a-Enolase，又稱非神經(jīng)元烯醇酶，分布于多種組織；β-Enolase，又稱肌肉特異性烯醇酶，僅存在于肌肉組織；γ-Enolase又稱神經(jīng)元烯醇酶，主要分布于神經(jīng)元及神經(jīng)內(nèi)分泌組織.

Enolase作為糖酵解過程中的限速酶，在結(jié)構(gòu)上高度保守.當機體組織處于病理狀態(tài)下，如骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生時，Enolase作為糖酵解過程中重要的酶，其表達量及活性隨著環(huán)境的需要發(fā)生了適應性變化，以滿足細胞不同狀態(tài)下的需求.Enolase還是一種自身抗原.抗Enolase抗體通過識別a-Enolase的膜聯(lián)形式而誘發(fā)局部免疫炎性反應.Kinloch等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Enolase抗體在類風濕性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑膜中大量存在，Enolase是一種自身抗原，因此會刺激機體產(chǎn)生特異性抗體——Enolase抗體，進而引發(fā)類風濕性關(guān)節(jié)炎慢性炎癥反應.

本研究中，Enolase僅現(xiàn)于骨性關(guān)節(jié)炎組滑膜中，而在對照組滑膜中并未發(fā)現(xiàn)Enolase的表達，這與相關(guān)文獻的研究結(jié)果相一致，進一步證明Enolase作為糖酵解限速酶、自身抗原及缺氧誘導因子的靶基因在骨性關(guān)節(jié)炎病程中的重要作用，同時可以證明Enolase可作為骨性關(guān)節(jié)炎診斷及預測的生物活性分子.

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，醛縮酶和烯醇酶僅僅存在于骨性關(guān)節(jié)炎組滑膜中，這兩種酶均與細胞的能量代謝有關(guān).在正常人群中，關(guān)節(jié)內(nèi)細胞ATP的產(chǎn)生與消耗保持平衡，進而調(diào)節(jié)軟骨基質(zhì)成分的合成分解，使關(guān)節(jié)軟骨在總體上保證其細胞數(shù)量、形態(tài)和功能的穩(wěn)定.當細胞受到外界諸如壓力、低氧、炎癥因子等刺激時，細胞的代謝活動隨之發(fā)生改變，不足以提供充足的ATP使軟骨細胞產(chǎn)生有效的軟骨基質(zhì)以維持細胞基質(zhì)的完整，基質(zhì)的合成分解平衡遭受破壞，軟骨進一步降解，加重了骨性關(guān)節(jié)炎病程.骨性關(guān)節(jié)炎時，關(guān)節(jié)組織處于缺氧環(huán)境，ATP的供應主要靠無氧糖酵解.醛縮酶和烯醇酶催化葡萄糖進行無氧分解產(chǎn)生ATP以補充細胞代謝需要的同時，刺激滑膜細胞產(chǎn)生一系列可引起骨性關(guān)節(jié)炎慢性炎癥反應的細胞因子，如白細胞介素1、白細胞介素7及腫瘤壞死因子等.通過促進基質(zhì)降解酶的產(chǎn)生從而抑制了基質(zhì)的合成，基質(zhì)的分解大于合成，進一步破壞了細胞基質(zhì)的平衡狀態(tài)，導致軟骨細胞凋亡，造成惡性循環(huán).

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Different Expression of Osteoarthritis Synovial Aldolase and Enolase

HUANGQiaoting1，XUJie1，GAOWeiwei2，CAOJianmi2

(1.School of Sports, Chengdu University， Chengdu 610106, China； 2.Sport Science College, Beijing Sport University， Beijing 100084, China)

The purpose of this study is to provide a new approach for the study of pathogenesis of osteoarthritis by analyzing the different protein expression of adolase and enolase by comparing the expression profiles of synovial membrane from patients with osteoarthritis(OA) and normal.Synovial membranes are collected from the experimental group(n=10) and the normal control group(n=10).Proteins are separated by the two-dimensional electrophoresis.The proteins with significantly different expressions are evaluated by matrix-assisted laser disorption/ionization-time of flight(MALDI-TOF) MS.The results show that by comparing the synovial membranes in the experimental group and the control group,it is found that aldolase and enolase only exist in the experimental group,while do not appear in the control group.Finally,the paper draws a conclusion that adolase and enolase are only expressed in the experimental group,and adolase and enolase are involved in the pathogenesis of osteoarthritis process by regulating cell energy activities.

osteoarthritis;proteomics;aldolase;enolase

1004-5422(2017)01-0030-04

2017-01-14.

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金(2015BS004)資助項目.

黃巧婷(1986 — )， 女， 博士， 副教授， 從事骨骼肌損傷與運動營養(yǎng)研究.

G804.3；R684.3

A